CC BY
60
© Коллектив авторов, 1999 УДК 616.71-006.04-008:612.018
Н. Е. Кушлинский, В. Г. Дегтярь, Т. В. Бабкина,
Ю. Н. Соловьев, М. Д. Алиев, И. Н. Трапезников
ОПУХОЛИ КОСТЕЙ И МЕТАБОЛИЗМ АНДРОГЕНОВ
НИИ клинической онкологии
Исследования метаболизма андрогенов при заболеваниях костной системы проводятся достаточно давно, однако до сих пор отсутствуют четкие представления о физиологической роли андрогенов в регуляторных процессах в костях, особенно в процессах бластомогенеза [11, 39, 43]. Вместе с тем показано, что при некоторых опухолях костей у больных может наблюдаться гиперандрогенемия [8]. Данный факт дает основание полагать, что возникновение и развитие опухолей костей либо опосредованно связано с усилением биосинтеза половых стероидов, в частности андрогенов в половых железах, либо сами опухоли могут быть источником андрогенов. Последнее предполагает не только наличие в костной ткани ферментов метаболизма андрогенов и участие андрогенов (прямо или опосредованно) в регуляции определенных функций в этих тканях, но и возможное нарушение (изменение) процессов регуляции при некоторых нозологических формах патологии кости, в частности при саркомах костей.
Участие андрогенов в регуляции клеточных функций, как известно, предполагает наличие рецепторного аппарата в клетке (рецепторов андрогенов — РА) и, как правило, метаболизма андрогенов в этой клетке (экспрессию в клетках соответствующих ферментов). В то же время данные о метаболизме андрогенов в тканях костей достаточно противоречивы [11, 46, 53], притом рядом авторов [6, 53] показано наличие РА в опухолях костей. Все это указывает на необходимость всестороннего исследования обмена андрогенов у больных саркомами костей. Однако одним из важных разделов в изучении механизма действия андрогенов в любой ткани, помимо РА, является проблема роли метаболизма андрогенов в этой ткани, а также отдельных метаболитов андрогенов, образующихся при этом.
Изучение метаболизма андрогенов может дать основание для ответа на несколько вопросов. Во-первых, наличие метаболизма в клетке почти однозначно может указывать на физиологическую роль андрогенов в этой клетке [9, 17]. Во-вторых, может косвенно указывать на наличие в клетке рецепторного аппарата для андрогенов, хотя это, вероятно, не всегда так однозначно, как кажется. В-третьих, при положительном ответе можно с определенной уверенностью утверждать, что опухоли костей являются гормонозависимыми. В-четвертых, и это самое
N.E.Kushlinsky, W.G.Degtjar, T.V.Babkina,
Yu. N. Soloviev, M.D. Aliyev, N.N.Trapeznikov
BONE TUMORS AND ANDROGEN METABOLISM
Institute of Clinical Oncology
Androgen metabolism in bone diseases has been studied for a rather long time, but the physiological role of androgens in bone regulatory processes, in particular in blasto-mogenesis, is still unclear [11,39,43]. Hyperandrogenemia was found to be associated with some bone tumors [8]. This finding suggests that bone tumor generation and development is related to increased biosynthesis of sex steroids (in particular of androgens) in sex glands or that the tumors themselves produce androgens. The latter supposition implies the presence of enzymes contributing to androgen metabolism in bone tissues and (direct or indirect) androgen regulatory effect on certain functions in these tissues as well as a possible impairment (alteration) of regulatory processes in bone lesions, e.g. osteosarcoma.
Androgens can regulate cell functions only if the cells have androgen receptors (AR) and, as a rule, conditions for androgen metabolism (expression of relevant enzymes). However, the findings on androgen metabolism in bone tissues are equivocal [11,46,53]. Some authors [6,53] report of the presence of AR in bone tumors. All this encourages thorough study of androgen turnover in patients with bone sarcoma, it should be noted, however, that the role of androgen metabolism and the contribution of some androgen metabolites are not less important than the AR in study of androgen effects in any tissue.
The study of androgen metabolism may answer several questions. First, detection of the cellular metabolism may be definitely indicative of the physiological role of androgens in these cells [9,17]. Second, it provides indirect evidence of the presence of AR though this evidence is rather ambiguous. Third, the positive test is suggestive of hormone dependence of the tumor. Forth and the most important (follows from the previous consideration), if the metabolism is found one may determine on whether activity of enzymes contributing to androgen metabolism may be regulated by therapy other than conventional influence on AR. This consideration is of much importance since definite conclusions on androgen metabolism in bone tumors can hardly be made basing on the equivocal findings [11,31].
Before describing and discussing androgen metabolism in bone tumors let us consider the general pattern of androgen metabolism common for most animal and human tissues except the liver and kidneys.
The blood androgen qualitative and quantitative composition depends generally on production of androgens by sex glands and adrenals [14] as well as on activity of
главное и может быть следствием предыдущего,— оценить принципиальную возможность регуляции активности ферментов метаболизма андрогенов как основу терапевтического воздействия, помимо общеизвестного воздействия на РА. Это особенно важно, поскольку противоречивость данных по метаболизму андрогенов в опухолях костей не позволяет пока сделать определенные выводы [11,31].
Прежде чем перейти к изложению и обсуждению результатов по метаболизму андрогенов в опухолях костей, необходимо рассмотреть общую схему метаболизма андрогенов, согласно которой осуществляется метаболизм этих половых стероидов в большинстве тканей животных и человека, за исключением печени и почек.
В общем случае качественный и количественный состав андрогенов в крови организма зависит не только от секреции их половыми железами и надпочечниками [14], но и от активности ферментных систем андроге-неза в периферических тканях [10, 23], что и обусловливает содержание каждого отдельного андрогена в клетке-мишени и, вероятно, выход его в общий кровоток. В то же время нарушение процессов биотрансформации андрогенов не всегда может отражаться на концентрации отдельных андрогенов в крови, так как их пул в общем кровотоке может не изменяться. Вероятно, все зависит от степени нарушений [27].
Как известно, стероидные гормоны в крови переносятся в виде комплексов с белками крови [56]. В частности, у человека андрогены в крови образуют комплексы с альбумином, в основном с тестостерон-эстрадиолсвя-зывающим глобулином (глобулином, связывающим половые стероиды — ГСПС). Считается, что в клетки попадают только свободные стероиды после диссоциации комплексов с ГСПС (и с альбумином) путем пассивной диффузии через мембрану клетки из-за своей липофильности. Однако имеются данные, что в ряде случаев можно ставить под сомнение эту общепринятую точку зрения [41]. Некоторые исследователи предположили, что в транспорте через клеточную мембрану, например андрогенов и эстрогенов, может участвовать и ГСПС [33]. Вполне вероятно, что in vivo это возможный альтернативный механизм проникновения половых стероидов в клетку. Не исключено также, что механизм проникновения стероида в клетку зависит и от его структуры [42].
Попадая в клетки из крови, андрогены включаются в цепь метаболических превращений. Общая схема метаболизма андрогенов обсуждается в данном случае на примере предстательной железы (ПЖ) человека (рис. 1).
Аналогично протекают реакции метаболизма андрогенов и в других тканях-мишенях половых стероидов. В то же время интенсивность отдельных реакций метаболизма в значительной степени зависит от ткани и для каждой ткани в норме, вероятно, характерны либо только некоторые реакции ферментативного превращения андрогенов, либо преобладание некоторых из них.
Тестостерон (Т) и 4-андростен-3,17-дион (А4) при участии соответствующего фермента — 17(3-гидрокси-
androgenic enzyme systems in peripheral tissues [10,23] which determine the content of each individual androgen in target cells and probably in circulation. However, disregulation of androgen biotransformation does not always affect blood concentration of individual androgens because their circulatory pool may remain unchanged; it seems that degree of the disregulation is of principal importance here [27].
As known, steroid hormones are circulated in conjugation with blood proteins [56]. For instance, blood androgens in humans are conjugated with albumin, mainly with testosterone-estradiol-binding globulin (sex steroid binding globulin, SSBG). It is thought that only free steroids can passively diffuse through cell membrane into cells (owing to their lipophilic properties) upon dissociation of
____________1
2/ \
___________________________1 ____________
Рис. 1. Общая схема метаболизма андрогенов в тканях человека и животных.
1 — 17р-ГСР; 2 — ароматаза; 3 — 5а-Р; 4 — За-ГСР; 5 — зр-ГСР; 6 и 7 — 6е- и 7е-ГСР. Стрелка указывает направление основных реакций метаболизма андрогенов в опухолях костей человека, а относительная толщина стрелок направления реакций показывает сравнительную активность ферментов в опухолях (см. также текст). Знак? указан возле соединений, образование которых в опухолях костей предполагается. Выделенные в рамку андрогены — основные метаболиты, образующиеся в опухолях костей человека.
Fig. 1. Androgen metabolism in human and animal tumors.
1, 17j3-HSR; 2, aromatase; 3, 5a-R; 4, 3a-HSR; 5, 3P-HSR; 6 and 7, 6e- and 7e-HSR. The arrows show directions of principal reactions of androgen metabolism in human bone tumors, the arrow thickness corresponds to enzyme activity (see also the text). The question marks indicate compounds supposedly present in bone tumors. The framed androgens are principal human bone tumor metabolites.
стероидоксидоредуктазы (ГСР) (17fl-I CP, см. рис.1, /) могут превращаться друг в друга. Активность этого фермента в большинстве тканей, в том числе и в ПЖ человека, в норме очень низка, за исключением половых желез, печени, надпочечников и, вероятно, мышц [13, 57]. В большинстве случаев 17[3-ГСР проявляет преимущественно редуктазную активность, однако при некоторых патологических состояниях соотношение редуктазной и оксидазной активностей 17(3-ГСР может значительно изменяться, как это показано, например, для ПЖ человека [14, 28, 50].
С метаболизмом андрогенов тесно связан биосинтез эстрогенов. Как в половых железах (основной источник эстрогенов в норме), так и в периферических тканях при участии ароматазы (см. рис. 1, 2) из А4 и Т образуются соответственно эстрон (Е1) и эстрадиол (Е2) [49]. При определенных условиях образование эстрогенов из андрогенов в периферических тканях может быть основным источником эстрогенов в организме [19].
Одним из основных этапов метаболизма андрогенов в тканях и ключевым в механизме действия андрогенов считается превращение Т (также и А4) под действием 5а-редуктазы (5а-Р, см. рис.1, 3) соответственно в 5а-андростан-3,17-дион (5а-А) и 5а-дигидротестостерон (DHT) (см. рис.1) (в некоторых тканях возможно 5(3-восстановление кольца А молекулы андрогена) [13].
DHT в большинстве тканей-мишеней для андрогенов считается самым активным природным андрогеном, обусловливающим гормональный ответ клетки на действие андрогенного сигнала [9, 57]. Вероятно, поэтому 5а-Р называют ключевым ферментом андро-генеза (метаболизма, катаболизма и в некоторых случаях биосинтеза андрогенов) [57].
За исключением той части клеточного пула DHT, который действует в клетке как основной андроген-гормон (через рецепторную систему), образовавшийся DHT при участии нескольких ферментов может превращаться в другие метаболиты (см. рис. 1). До сих пор неясно, как в клетке-мишени происходит дифференциация пула образовавшегося DHT, какая часть его может экскретироваться из клетки, не подвергаясь метаболизму, и как это регулируется. Нельзя исключить, что нарушение внутриклеточного распределения пула DHT — возможная причина (или следствие?) некоторых патологических изменений в клетке. Кроме того, нельзя упускать из виду, что почти на любом этапе метаболизма в схему биотрансформации могут включаться и экзогенные для данной клетки андрогены из крови, особенно при каких-либо патологиях, что, разумеется, усложняет изучение метаболизма андрогенов, как и изучение биологических эффектов андрогенов. То, что это имеет место, показано в исследованиях после введения разных андрогенов in vivo [29].
Из рис. 1 следует, что концентрация самого активного андрогена — DHT — в клетке может зависеть не только от активности 5а-Р, но и от активностей по крайней мере трех ферментов: 17(3-ГСР, За-ГСР и Зр-ГСР (соответственно 1,4 и 5 на рис. 1), хотя, как было
their complexes with SSBG. However, there is evidence against this common opinion [41]. There are reports demonstrating that the SSBG can also contribute to androgen and estrogen transport through cell membranes [33]. This is likely to be an alternative mechanism of sex steroid penetration into cells. The mechanism of steroid penetration into cells may also depend upon the steroid structure [42].
Upon penetrating into cells the androgens enter a cascade of metabolic transformations. Let us consider the general pathway of androgen metabolism on the example of human prostate (flg.l).
Androgen metabolic reactions in other target cells follow a similar pattern. While, intensity of some metabolic transformations depends to a great degree upon tissue, each normal tissue presenting with only a part of androgen transformations under the effect of enzymes or predominance of some of these reactions.
Testosterone (T) and 4-androstene-3,17-dione (A4) may change into each other under the action of enzyme 17p-hydroxysteroidoxidoreductase (HSR) (17p-HSR, see figs. 1,1). The enzyme activity in most normal human tissues including human prostate is rather low, except for sex glands, liver, adrenals and probably muscles [13,57]. The 17(3-HSR mainly demonstrates reductase activity though in some diseases the ratio of 17P-HSR reductase-to-oxidase activities may be different as in human prostate [14,28,50].
Estrogen biosynthesis is closely related to androgen metabolism. The A4 and T are converted into estrone (El) and estradiol (E2), respectively, under the effect of aromatase (see fig. 1, 2) both in sex glands (the principal estrogen source in the normal body) and peripheral tissues [49]. Under certain conditions the androgen transformation into estrogens in peripheral tissues is the main mechanism of estrogen production [19].
The transformation of T (as well as of A4) into 5a-androstane-3,17-dione (5a-A) and 5a-dihydrotestos-terone (DHT) under the effect of 5a-reductase (5a-R, see fig. 1, 3) (with 5a-reduction of the A ring in the androgen molecule in some tissues) is a principal stage of tissular androgen metabolism and the key mechanism of androgen activity [13].
The DHT is considered the most active natural androgen in most androgen target tissues responsible for cell hormonal response to androgen signal [9,57] and the 5a-R is therefore referred to as the key enzyme of androge-nesis (androgen metabolism, catabolism and, sometimes, biosynthesis) [57].
The generated DHT (except for the pool acting in the cell as the main androgen via receptors) may change into other metabolites under the action of several enzymes (see fig.1). Itis still unclear how the DHT differentiation proceeds in the target cell, what part of the androgen avoids metabolism and is excreted from the cell and how these processes are regulated. It is likely that disregula-tion of the DHT intracellular distribution is a cause (or result?) of some pathological changes in the cell. Besides,
сказано выше, из-за обычно низкой активности 170-ГСР не оказывает существенного влияния при этом. Соотношение активности указанных оксидоредуктаз зависит от ткани, однако почти всегда в норме их можно расположить в ряд За-ГСР > 30-ГСР > 170-ГСР. В большинстве тканей активность За-ГСР (см. рис.1, 4), при участии которой образуется 5а-андрос-тан-За, 170-диол (За-О), очень высока, даже в тех, где отсутствует 5а-Р, например в почках и мышцах [40, 51], в том числе и в сердечной мышце [30].
При участии соответствующей оксидоредуктазы — 3(3-ГСР (см. рис. 1, 5) БИТ может превращаться в 5а-ан-дростан-30,170-диол (3(3-0). В нормальных тканях человека и животных активность этого фермента обычно ниже, чем За-ГСР, и преобладает редуктазная активность 30-ГСР, поэтому в отличие от За-0 только незначительная часть 30-О может превращаться в ОНТ. Вследствие этого равновесие в системе ОНТ <н> 30-0 сдвинуто в сторону образования 30-0, хотя в данном вопросе имеются разногласия [14,44, 48]. Причина полученных противоречивых результатов неясна, но одна из наиболее вероятных, которая затрудняет получение однозначных данных, — высокая активность комплекса ферментов гидроксилирования 30-0 (см. рис. 1,6,7), при участии которых этот андроген в ПЖ человека (и, вероятно, в других тканях) может легко превращаться в несколько триолов (Тг, см. рис.1) — дополнительно гидроксилированных производных 30-0. При этом в основном образуется 5а-андростан-30,6а, 170-триол (30,6а, 170-триол), меньше образуется 5а-андростан-30,7а, 170-триола (30,7а, 170-триол) и 5а-андростан-
30,70,170-триола (30,70,170-триол) [16, 24, 26, 34]. По непонятным пока причинам почти не образуется 5а-андростан-30,60,170-триола (30,60,170-триол), что показано, например, для ПЖ человека [16]. Соотношение образующихся триолов может варьировать в зависимости от организма и типа ткани [25]. Впервые образование гидроксилированных производных 30-0 в эксперименте было показано [2, 20].
Все перечисленные триолы считаются биологически неактивными катаболитами и плохо удерживаются в клетке, что показано на примере ПЖ крыс [34]. Высказано предположение, что гидроксилирование 30-0 не связано с механизмами регуляции содержания ОНТ в клетках, так как активность ферментов, принимающих участие в гидроксилировании 30-0, например в клетках ПЖ человека, существенно не отличается в нормальной ПЖ и при нодулярной гиперплазии ПЖ [24].
Следует отметить, что в некоторых тканях возможно образование андростерона (А) и изо-андростерона (¡во-А) (см. рис.1), однако из-за низкой активности 170-ГСР эти андрогены в норме образуются в незначительных количествах [36,45]. При изменении соотношения редуктазной и дегидрогеназной активностей 170-ГСР (см. выше) образование А и ¡зо-А может быть преобладающим [14, 38].
Следовательно, несмотря на многие возможные реакции взаимного превращения андрогенов, в нормальной
it should be taken into account that exogenic (for this cell) androgens from the blood may contribute to the biotransformation at any metabolism stage, especially in pathology, which makes the study of androgen metabolism still a more difficult task as well as the study of androgen biological effects. This phenomenon was demonstrated in vivo after administration of various androgens [29].
As seen in fig. 1, cellular concentration of the most active androgen DHT may depend upon the activity of 5a-R and the activities of at least three other enzymes such as 170-HSR, 30-HSR and 30-HSR (fig. 1, 1, 4and 5, respectively), though the effect of 170-HSR is low because of weak activity of the enzyme. Ratio of activities of the three oxidoreductases depends upon tissue though in general the normal activities may be presented as 30-HSR > 30-HSR > 170-HSR. The activity of 30-HSR contributing to production of 5a-androstane-3a, 170-diol (3a-D) is high in most tissues including those free from 5a-R (kidneys and muscles [40,51] including cardiac muscle [30] (see fig. 1, 4).
The DHT may turn into 5a-androstane-30,170-diol (30-D) under the effect of oxidoreductase 30-HSR (see fig. 1, 5). The activity of this enzyme in normal human and animal tissues is usually lower as compared to 30-HSR with reductase activity predominating, and unlike 3a-D only a small portion of 30-D may turn into DHT. As a result the DHT<-^30-D balance is shifted towards 30-D though this is a disputable finding [14,44,48]. It is not quite clear why the results are contradictory, one of the probable reasons being the high activity of the 30-D hydroxylation enzymes (see fig. 1, 6,7): under the effect of these enzymes the androgen is easily transformed into several triols (Tr, see fig.l), 30-D hydroxylated derivatives, in human prostate (and probably in some other tissues). The resultant derivatives are 5a-androstane-
30,60,170-triol (30,60,170-triol) for the most part and 5a-androstane-30,70,170-triol (30,70,170-triol) and 5a-androstane-30,70,170-triol (30,70,170-triol) to a much lesser degree [16,24,26,34]. There is almost no production of 5a-androstane-30,60,170-triol (30,60,170-triol) as, for instance, in human prostate [16], the reason of this phenomenon being unclear yet. These triols may be present in various ratios depending upon organism and tissue type [25]. The generation of the 30-D hydroxylated derivatives was first demonstrated in [2,20].
The above-mentioned triols are thought to be biologically inactive catabolites poorly preserved by the cell as shown for the rat prostate [34]. Some investigators believe the 30-D hydroxylation not to be related to cell DHT regulatory mechanisms, because the enzymes participating in the 30-D hydroxylation, e.g. in human prostate, demonstrate the same activity in normal prostate and in benign prostatic hyperplasia [24].
It should be mentioned that androsterone (A) may be generated as a result of transformation of iso-andros-terone (iso-A) in some tissues (see fig.l), though the yield of these androgens in normal organs is low due to the poor activity of 170-HSR [36,45]. However, the
ткани-мишени для половых стероидов при метаболизме образуются преимущественно только некоторые — основные для данной ткани метаболиты андрогенов, а различия в метаболизме андрогенов при нарушении регуляции сводятся чаще всего к соотношению образующихся метаболитов, хотя могут быть и исключения [28]. Более того, «основной набор» ферментов метаболизма андрогенов в большинстве периферических тканей практически одинаков, но большая активность одного фермента (или нескольких) по сравнению с другими (т.е. различная экспрессия ферментов в клетке) обусловливает различие между тканями. В этом, вероятно, и кроется причина половой специфичности ответа тканей на гормональную регуляцию, поскольку во многих случаях показаны половые различия в метаболизме андрогенов в тканях.
Особенно интересно, что в онтогенезе, как показано в ряде случаев, имеют место изменения в метаболизме андрогенов, которые, по-видимому, могут быть связаны с изменениями механизмов регуляции в конкретной ткани в соответствии с возрастными «потребностями» организма [3, 21, 22, 44].
В исследование включены 46 больных со злокачественными и доброкачественными опухолями костей, находившихся на лечении в отделении общей онкологии НИИ клинической онкологии ОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в период 1996—1997 гг. У всех больных клинико-рентгенологический диагноз подтвержден данными гистологического исследования удаленных опухолей. Остеогенная саркома выявлена у 19 больных, хондросаркома — у 10, опухоль Юинга — у 5, гигантоклеточная опухоль — у 7, доброкачественные опухоли — у 5. Возраст больных колебался от 15 лет до 61 года, преобладающее большинство больных были мужского пола.
Образование метаболитов из Т и ОНТ определяли в общем гомогенате опухолей костей, используя описанный ранее метод [3, 21] с некоторыми модификациями. Общий гомогенат получали из опухоли, взятой при операции или биопсии: опухоль измельчали в жидком азоте, суспендировали в натрий-фосфатном буфере (pH 7,4), центрифугировали при 5000 £ с охлаждением и надосадочную жидкость (общий гомогенат) использовали для инкубации с Т или ОНТ при конечной концентрации их в растворе инкубации 10-7 моль/л (в присутствии индикаторных количеств [ЗН]Т или [ЗН]ОНТ). Активность ферментов рассчитывали по количеству соответствующего метаболита, образованного из субстрата 1 мг общего белка гомогената за 1 ч инкубации: активность 5а-Р — по образованию из Т суммы ОНТ, За-О и Зр-О; активность 170-ГСР — по образованию А4 из Т; активность За-ГСР — по образованию За-О из ОНТ; активность Зр-ГСР по образованию Зр-О из ОНТ; активность 6,7-ГСР — по образованию из ОНТ «полярных метаболитов» (соединений, хроматографическая подвижность которых при разделении метаболитов была меньше, чем хроматографическая подвижность 30-0).
above-mentioned shift in 17p~HSR reductase-dehydro-genase activities may result in predominating production of A from iso-A [14,38].
In summary, in spite of the large variety of possible reciprocal androgen transformations, metabolism of most steroids in normal target tissues results in generation of but a part of androgen metabolites characteristic of this or that tissue, the disregulatory differences in androgen metabolism mainly concerning ratios of the resultant metabolites, though there may be exceptions [28]. Moreover, the main set of enzymes contributing to the androgen metabolism is the same in most peripheral tissues, while different tissues demonstrate different activities of individual enzymes (i.e. different expression of cell enzymes). This consideration may account for sex specificity of tissue response to hormonal regulation since there are sex-specific differences in tissular androgen metabolism.
Of much interest is the following observation: there are ontogenetic differences in androgen metabolism seemingly due to changes in the regulatory mechanisms in a particular tissue which occur in accordance with age-specific requirements of the body [3,21,22,44].
A study of androgen metabolism was performed in 46 patients with malignant and benign bone tumors managed at the Institute of Clinical Oncology, N.N.Blokhin CRC RAMS, during 1996-1997. Clinical and x-ray diagnosis was verified histologically in all the cases. The bone lesions were osteogenic sarcoma (19), chondrosarcoma (10), Ewing’s tumor (5), giant-cell tumor (7), benign tumors (5). The patients’ age was ranging from 15 to 61 years, most of the patients were males.
T and DHT metabolites were measured in bone tumor homogenate by the technique described elsewhere [3,21] with some modifications. The total homogenate was prepared from tumor specimens obtained by surgical intervention or biopsy. The tumor samples were triturated in liquid nitrogen, suspended in sodium phosphate buffer (pH 7.4), centrifuged at 5,000 g under cooling; the supernatant (total homogenate) was incubated with T or DHT at an end concentration in incubation solution 10-7 mol/1 (in the presence of indicator quantities of [3H]T or [3H]DHT). Enzyme activity was calculated by amount of the respective metabolite in substratum of 1 mg total homogenate protein after 1-hour incubation, as follows: 5a-R activity by generation of the total of DHT, 3a-D and 3p-D from T; 17P-HSR activity by generation of A4 from T; 3a-HSR activity by generation of 30-D from DHT; 3P-HSR activity by generation of 3p-D from DHT; 6,7-HSR activity by generation of polar metabolites (compounds with chromatographic mobilities upon metabolite separation lowerthan that of 3(-D) from DHT.
Fig. 2 summarizes 5a-R activity measurements in different bone tumors irrespective of patient’s gender or age. The statistical analysis by Student’s /-test failed to discover significant differences in the 5a-R activities with respect to tumor histology. Of note that there was no DHT generation from T though other 5a-reduced metabolites were present (see the technique of 5a-R
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
1
Рис. 2. Активность 5а-Р в опухолях костей различного гистологического строения.
1 — остеогенная саркома (л=14, колебания величин от 570 до 6624); 2 — хондросаркома (п=6, колебания от 1066 до 4898); 3 — гигантоклеточная опухоль (л=5, колебания от 788 до 9281); 4 — опухоль Юинга (л=5, колебания от 786 до 5004); 5 — доброкачественные опухоли (л=5, колебания от 1475 до 8410). Здесь и на рис. 3—6 активность ферментов выражена в фмолях соответствующего метаболита (для 5а-Р — сумма метаболитов), образованного 1 мг общего белка гомогената опухоли за 1 ч, и представлена в виде среднее ± стандартная ошибка средней.
Fig. 2. 5a-R activity in bone tumors of different histology.
1, osteogenic sarcoma (n=14, range 570-6,624); 2, chondrosarcoma (n=6, range 1,066-4,898); 3, giant-cell tumor (n=5, range 788-9,281);
4, Ewing’s tumor (n=5, range 786-5,004); 5, beniqn tumors (n=5, range 1,475-8,410).
Here and in figs.3-6 enzyme activity is indicated as fmols of the respective metabolite (the total of several metabolites for 5(-R) per mg total protein of tumor homogenate produced after a 1 -hour incubation and presented as mean + standard deviation.
600
500
400
300
200
100
I
_V
1 2 3 4 5
Рис. 3. Активность 17Р-ГСР в опухолях костей различного гистологического строения.
1 — остеогенная саркома (л= 15, колебания величин от 4 до 426); 2 — хондросаркома (л=7, колебания от 31 до 658); 3 — гигантоклеточная опухоль (л=7, колебания от 11 до 192); 4 — опухоль Юинга (п=3, колебания от 136 до 735); 5 — доброкачественные опухоли (л=4, колебания от 53 до 277).
Fig. 3. 17P-HSR activity in bone tumors of different histology.
/, osteogenic sarcoma (л=15, range 4-426); 2, chondrosarcoma (n=7, range 31-658); 3, giant-cell tumor (л=7, range 11-192); 4, Ewing’s tumor (n=3, range 136-735); 5, benign tumors (л=4, range 53-277).
На рис.2 представлены данные по определению активности 5а-Р в опухолях костей различного гистологического строения без учета пола и возраста больных. Не получено достоверных различий в активности 5а-Р в опухолях всех вариантов по критерию Стьюдента. Следует отметить, что в некоторых опухолях нами не
8000
7000-
6000-
5000-
4000-
3000-
2000-
1000
о
j
1
Рис. 4. Активность За-ГСР в опухолях костей различного гистологического строения.
1 — остеогенная саркома (л=18, колебания величин от 384 до 15 161); 2 — хондросаркома (л=7, колебания от 450 до 9259);
3 — гигантоклеточная опухоль (л=4, колебания от 1149 до
10 906); 4 — опухоль Юинга (л=7, колебания от 3463 до 9591); 5 — доброкачественные опухоли (л=5, колебания от 2632 до 9348).
Fig. 4. За-HSR activity in bone tumors of different histology.
1, osteogenic sarcoma (n=18, range 384-15,161); 2, chondrosarcoma (л=7, range 450-9,259); 3, giant-cell tumor (n=4, range 1,149-10,906); 4, Ewing’s tumor (л=7, range 3,463-9,591); 5, benign tumors (л=5, range 2,632-9,348).
2500
2000
1500
1000
500^
0
1
Рис. 5. Активность Зр-ГСР в опухолях костей различного гистологического строения.
1 — остеогенная саркома (л=17, колебания величин от 376 до 9365); 2 — хондросаркома (л=8, колебания от750 до 2575); 3 — гигантоклеточная опухоль (л=4, колебания от 2382 до 4106); 4 — опухоль Юинга (л=5, колебания от 2587 до 5407); 5 — доброкачественные опухоли (л=4, колебания от 1260 до 4639).
Fig. 5. Зр-HSR activity in bone tumors of different histology.
1, osteogenic sarcoma (л=17, range 376-9,365); 2, chondrosarcoma (л=8, range 750-2,575); 3, giant-cell tumor (л=4, range 2,382-4,106); 4, Ewing’s tumor (л=5, range 2,587-5,407); 5, benign tumors (л=4, range 1,260-4,639).
activity measurement above). Besides, the same tumors presented with high activities of 3a-HSR and 30-HSR.
The acitivity of 170-HSR was the lowest of all androgen metabolism enzymes studied (fig.3). Statistical analysis by Student’s test discovered significant differences in 170-HSR activity between Ewing’s tumors and osteogenic sarcoma (p=0.03) as well as between Ewing’s tumor and giant-cell tumor (/7=0.01).
As mentioned above, 3a-HSR and 30-HSR play an important role in androgen metabolism (see fig.l). As seen
обнаружено образования ОНТ из Т, однако другие 5а-восстановленные метаболиты определялись (см. выше метод определения активности 5а-Р). Кроме того, в этих же опухолях были высоки активности За-ГСР и 3(1-ГС Р.
Из всех изученных нами ферментов метаболизма андрогенов в опухолях костей активность 170-ГСР была значительно ниже, чем активность остальных ферментов (рис.З). По критерию Стьюдента достоверно отличалась активность 170-ГСР в опухоли Юинга от активности этого фермента в остеогенной саркоме (/>=0,03) и от активности в гигантоклеточной опухоли (/7=0,01).
Выше было указано, что достаточно важными ферментами при метаболизме андрогенов следует считать За-ГСР и 30-ГСР (см. рис.1). Как видно на рис. 4, активность За-ГСР во всех опухолях была выше (в некоторых типах опухолей значительно) активности других ферментов метаболизма андрогенов (см. рис.2, 3, 5 и 6). В хондросаркоме и опухоли Юинга активности За-ГСР различались достоверно (/>=0,05) (см. рис.4). Также достоверными были различия в опухолях этих групп больных между активностями 30-ГСР (/7=0,0002) (см. рис.5).
При инкубации гомогенатов большинства опухолей с ОНТ нами впервые было обнаружено образование «полярных метаболитов», подвижность которых при хроматографии была меньше, чем подвижность самого полярного из всех андрогенов, образование которых мы определяли. Выше было сказано, что в ряде тканей человека и животных из 30-О могут образовываться триолы (Тг, см. рис.1), причем хроматографическая подвижность этих соединений, как следует из их строения, должна быть ниже (при хроматографии в тонких слоях силикагеля), чем подвижность 30-О. Исходя из этого, мы полагаем, что в опухолях костей из ОНТ нами обнаружено образование именно триолов, поскольку активность 30- ГСР в этих опухолях высока (см. рис.5). Полагаем, что активность ферментов, при участии которых образуются «полярные соединения» — триолы, это, вероятно, суммарная активность 6е,7е-ГСР (см. рис. 1). На рис.б показана суммарная активность этих ферментов в опухолях различного гистологического строения, однако достоверных различий по критерию Стьюдента в активности
6,7-ГСР в разных опухолях нами не обнаружено. Следует отметить, что образование «полярных соединений» — триолов (Тг, см. рис. 1) (т.е. суммарная активность 6,7-ГСР) нами обнаружено не во всех опухолях.
Таким образом, из данных рис. 2—6 следует, что в опухолях костей различного гистологического строения могут экспрессироваться основные ферменты метаболизма андрогенов, хотя уровень экспрессии разных ферментов неодинаков.
Экспериментальные исследования и клинические наблюдения указывают на то, что половые стероидные гормоны участвуют в регуляции нормального роста и развития тканей костей у человека и животных и в процессах бластомогенеза [71. Установлено, что действие половых стероидных гормонов связано с диморфизмом скелета, особенно в первые три десятилетия жизни человека 11, 5, 8, 12, 39].
2500
2000'
1500'
1000-
500-■■
Рис. 6. Активность 6,7-ГСР в опухолях костей различного гистологического строения.
1 — остеогенная саркома (л=16. колебания величин от 70 до 1674); 2 — хондросаркома (п=8, колебания от 358 до 3968);
3 — гигантоклеточная опухоль (п=3, колебания от 96 до 1558);
4 — опухоль Юинга (п=4, колебания от79 до 2860); 5 — доброкачественные опухоли (п=4, колебания от 80 до 485).
Fig. 6. 6,7-HSR activity in bone tumors of different histology.
1, osteogenic sarcoma (л=16, range 70-1,674); 2, chondrosarcoma (n=8, range 358-3,968); 3, giant-cell tumor (n=3, range 96-
1,558); 4, Ewing’s tumor (n=4, range 79-2,860); 5, benign tumors {n=4, range 80-485).
in fig.4 the 3a-HSR activity was higher as compared to other enzymes in all tumor types (see also figs.2, 3, 5 and 6). The difference in 3(-HSR activity between Ewing’s tumor and chondrosarcoma was statistically significant (/7=0.05) (see fig.4). The differences in 30-HSR between these tumors were also significant (/7=0.0002) (see fig. 5).
We were the first to discover generation of polar metabolites as a result of the incubation of homogenates of most tumors with DHT. Chromatographic mobility of these metabolites was lower than the mobility of the most polar androgens studied. As mentioned above, 30-D may turn into triols (Tr, see fig. 1) in some human and animal tissues. As follows from structure of these compounds their chromatographic mobility should be lower than that of 30-D (by thin-layer chromatography). Following from this assumption we think that the compounds generated from DHT in bone tumors are triols because the activity of 30-HSR in these tumors is high (see fig.5). We also believe that the activity of enzymes contributing to generation of the polar compounds, i.e. triols, is the total activity of 6e,7e-HSR (see fig.l). Figure 6 demonstrates the total activities of these enzymes in different bone tumors, though the differences in the 6,7-HSR activities with respect to tumor histology as analyzed by Student’s test failed to reach statistical significance. Note, that the polar compounds, triols (Tr, see fig.l) (representing the total activity of
6,7-HSR) were absent in some of the tumors.
Thus, as seen in figs.2-6 bone tumors of different histology demonstrate expression of basic enzymes of androgen metabolism though individual enzymes may differ in degree of the expression.
The experimental and clinical findings suggest that sex steroid hormones participate in regulation of normal
Андрогены играют важную роль в развитии и метаболизме костной ткани, хотя данные о влиянии андрогенов на костную ткань достаточно противоречивы. Дефицит андрогенов вызывает уменьшение массы костей. Однако предполагается, что действие андрогенов в данном случае можетбытьопосредованным, хотя эта регуляция осуществляется с участием РА в кости 115, 18]. На процессы остеогенеза может оказывать влияние не только избыточная концентрация андрогенов в организме, но и недостаток этих гормонов |52|, а результат влияния андрогенов на костную систему зависит от дозы и длительности вводимого гормона 1321.
Ранее было показано, что активность 5ос-Р в костных тканях ниже, чем ее активность в классических андрогензависимых тканях [11, 371. В то же время андрогены могут активно стимулировать пролиферацию остеобластов, причем действие DHT и Т на пролиферацию одинаково [371. Полученные результаты позволили предположить, что Т может оказывать как прямое воздействие на остеобласты без превращения в DHT [37], так и после превращения в DHT [15). Кроме того, предположили 118], что влияние андрогенов на костные клетки in vivo может включать прямую стимуляцию остеобластов на разных стадиях дифферен-цировки. Альтернативно андрогены могут действовать на костные клетки через конверсию в эстрогены [47].
Образование DHT изТ в нормальных костях человека и животных и в опухолях костей человека, т.е. наличие в этих тканях 5а-Р, показано рядом исследователей 111,31,46, 551. Однако вуказанных исследованиях авторы использовали для изучения метаболизма андрогенов в качестве субстрата только Т. Как видно из общей схемы метаболизма андрогенов (см. рис.1), образование DHT из Т важная, но не единственная реакция при метаболизме Т. Более того, определение DHT как единственного продукта реакции для характеристики активности 5а-Р не может быть адекватной, поскольку DHT может быстро превращаться в другие метаболиты (см. рис.1), как и определение активностей За-ГСР и 3(3-ГСР при использовании Т в качестве субстрата. По нашему мнению, только использование как минимум двух субстратов — Т и DHT — способно достаточно полно характеризовать метаболизм андрогенов в ткани, так как позволяет определить образование основных метаболитов и соответственно активность ферментов, участвующих в их образовании.
По результатам, представленным на рис. 2—6, на рис. 1 показаны основные метаболиты, которые образуются в опухолях костей, и направления реакций в условиях инкубации. Сравнительная активность ферментов метаболизма андрогенов в опухолях показана на рис. 1 в виде разной толщины стрелок, указывающих направления соответствующих реакций на схеме.
Следует отметить, что в большинстве случаев самая высокая активность в опухолях нами обнаружена для За-ГСР, хотя другие исследователи не обнаружили активности этого фермента в нормальной кости человека [54].
growth and development of human and animal bone tissues as well as in bone blastomogenesis 17]. The sex steroid effect is found related to skeleton dysmorphism especially during the first three decades of human life 11,5,8,12,39].
Androgens play an important part in bone tissue development and metabolism, though the findings on the androgen effect on bone tissues are equivocal. Androgen deficiency leads to bone mass reduction. However, the supposition is made that the androgen action in this case may be mediated by other factors though the regulation is effected through androgen receptors in the bone 115,18]. The osteogenesis may be affected by both excessive androgen concentrations and androgen deficiency |52], magnitude of the androgen effect on bone tissues depending upon dose and duration of hormonal treatment 132].
As demonstrated previously the 5(-R activity in bone tissues is lower than in classical androgen-dependent tissues 111,371. However, androgens can enhance considerably osteoblast proliferation, the DHT and T effects on the proliferation being practically equal [371. These findings suggest that the T may both act on osteoblasts without 137] and after 115] transformation into DHT. Besides, the supposition was made ] 181 that the androgen in vivo effect on bone cells may include direct stimulation of osteoblasts at various differentiation stages. Alternatively, androgens may act on bone cells via conversion into estrogens ] 47 ].
The DHT generation from T (i.e. the presence of 5a-R) was demonstrated in normal animal and human bones and in human bone tumors [11,31,46,55] although only T was used as a substrate in these studies of androgen metabolism. As shown in the general scheme of androgen metabolism (see fig. 1) the DHT generation from T is an important but not the only T metabolic reaction. Moreover, the measurement of DHT as the only reaction product is not enough to determine 5a-R activity since the DHT may readily turn into other metabolites too (see fig. 1). The same is true as concerns determination of 3a-HSR and 3(3-HSR activities basing on T measurements. We believe that full enough characterization of androgen metabolism in a tissue may be made only basing on at least two substrates such as T and DHT because this technique allows measurement of principal androgen metabolites and therefore activities of the relevant enzymes.
Fig. 1 has been drawn up basing on results summarized in figs.2-6 and presents principal metabolites produced in bone tumors as well as the reactions occurring under incubation. Activities of enzymes participating in androgen metabolism are compared in fig. 1 as arrows of various thickness showing directions of the reactions.
Of note that 3a-HSR demonstrated the highest activity in our studies while other investigators failed to find this enzyme in normal human bone [54].
Some researchers believe that androgens function in the bone tissue via estrogens ] 47] in spite of their important role in skeleton development and the presence of AR in the bone (43,53]. Moreover, the T is thought to be an active androgen in bone tissues [11,35].
Некоторые исследователи [43, 53] полагают, что андрогены действуют в костной ткани через эстрогены [47]. Более того, имеется точка зрения, что в костной ткани действующим андрогеном является Т [ 11, 35].
Приведенные данные литературы и полученные нами результаты позволяют предположить следующее. Возможно, в опухолях костей человека различного генеза протекают интенсивные процессы инактивации не только Т как основного андрогена-регулятора в костной ткани, но и образование в кости ПНТ и других андрогенов, поскольку у больных с опухолями костей во многих случаях обнаружена гиперандрогенемия [8]. Если такое предположение оправданно, то нельзя исключить, что метаболизм андрогенов в опухолях костей направлен на образование других андрогенов (помимо ОНТ), которые могут участвовать в процессах регуляции костной ткани, например За-О и Зр-О, специфическая активность которых интенсивно изучается в последнее время [4].
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Блунк В. //Детская эндокринология. — М., 1981.
2. Дегтярь В. Г., Павлинов С. А., Лосева Л. А., Исаченков В. А. // Пробл. эндокринол. — 1977. — № 4. — С. 70—76.
3. Дегтярь В. Г., Лосева Л. А., Исаченков В. А. // Онтогенез. —
1982.-Т. 13, № 1,-С. 62-70.
4. Дегтярь В. Г., Кушлинский Н. Е. // Известия РАН. Серия биол. — 1998. - Вып. 6. -С.664-669
5. Жуковский М. A. // Нарушения полового развития. — М., 1989.
6. Кушлинский Н. Е., Синюков П. А., Петровичев Н. Н., Васильев
A. В. //Арх. пат. — 1987. — № 5. — С. 52—57.
7. Кушлинский Н. Е., Бассалык Л. С., Ревазова Е. С. // Респ. сборник научи. трудов «Вопросы эндокринологии». — М., 1988. — С. 37—40.
8. Кушлинский Н. Е., Бассалык Л. С., Соловьев Ю. Н. и др. // Вопр. онкол. - 1992. - Т. 38, № 3. - С. 279-290.
9. Мейнуоринг У. // Механизмы действия андрогенов. — М., 1979.
10. Резников А. Г. //Физиология гормональной регуляции. — Л., 1986.-С. 140-164.
11. Сергеев П. В., Чукаев С. А., Горбатенко Е. В., Кушлинский Н. Е. // Бюл. экспер. биол. — 1997. — Т. 124, № 9. — С. 305—307.
12. Смирнова И. О., Соловьев Ю. Н. // Арх. пат. — 1986. — № 1. — С. 82-86.
13. Хефтман Э. Биохимия стероидов. — М., 1972. — С. 66—76; 114—123.
14. Bartsch W., Klein Н., Schiemann U. etal 11 Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1990.-Vol. 595.— P. 53-66.
15. Bellido Т., Jilka R. L., Boyce B. F. etal //J. clin. Invest. — 1995. — Vol. 95. - P. 2886-2895.
16. Celotti F, Melccmgi R. C., Martini L. // Front. Neuroendocr. —
1992.-Vol. 13.-P. 163-215.
17. Chevalier S., Turcotte G., McKercher G. et al. // Ann. N. Y. Acad.
Sci. - 1990. - Vol. 595. - P. 173-183.
18. Czerwiec F. S., Liaw J. J., Liu S. B. et al // Bone. — 1997. — Vol.
21. - P. 49-56.
19. Davis S. R., Burger H. G. //J. clin. Endocr. Metab. — 1996. — Vol.
81.-P. 2759-2763.
20. Degtiar W. G., Pavlinov S. A., Loseva L. A., Isachenkov VA. // Neurosecretion and Neuroendocrine Activity, Evolution, Structure and Function / Eds W. Bergman, A. Oksche, A. Polenov,
B. Scharrer. — Berlin, 1977. — P. 72.
21. Degtiar W. G., Loseva L.A., Isachenkov V.A.// Endocr. exp. — 1981. — Vol. 15.-P. 181-190.
22. DenefC. //J. Steroid Biochem. - 1983. - Vol. 19. - P. 235-239.
23. Forest M. G. // Hormone Res. - 1983. - Vol. 18. - P. 69-83.
24. Gemzik B., Green J., Parkinson A. //Arch. Biochem. Biophys. —
1992. - Vol. 296. - P. 355-365.
25. Gemzik B., Parkinson A. // Ibid. — P. 366—373.
26. Guiraud J.-M., SamperezS., Jouan P. // Steroids. — 1982. — Vol.
40,- P. 625-639.
27. Habib F.K. // Eur. J. surg. Oncol. - 1997. - Vol. 23. - P. 264-268.
28. Hakime J. М., Rondinelli R. H., Schoenberg M. P., Barrack E. R. // WrldJ. Urol. - 1996. - Vol. 14. - P. 329-337.
The published findings and our results suggest the following. It is most likely that the androgen-related processes in human bone tumors include both intensive inactivation ofT as a bone principal regulatory androgen and generation of DHT and other androgens, because many cases with bone tumors present with hyperandro-genemia [8]. It then follows that androgen metabolism in bone tumors may also result in production of androgens other than DHT (e.g. 3a-D and 3[3-D) that may also contribute to bone tissue regulation, and there has been a vast study of these androgens over the last years [4].
29. Harding B, W., Samuels L.T. // Endocrinology. — 1962. — Vol.
70.-P. 109-118.
30. Krieg M., Smith K., Bartsch W. // Ibid. — 1978. — Vol. 103. — P. 1686-1694.
31. Kushlinsky N. E., Degtiar W. G., Babkina Т. V., Trapeznikov N. N.
11 Intern. Congress on Hormonal Steroids, 10-th: Abstracts. — Quebec City, 1998.-P. 148.
32. Malcolm M. M., Arlin L. A. M. // Acta endocr. — 1986. — Vol.
70.-P. 147-149.
33. MeyerS., Brumm C., Stegner H. E., Sinnecker G.H. // Exp. clin.
Endocr. - 1994. - Vol. 102. - P. 334-340.
34. Motftn R. F., DiStefano S., Charles J. P., Floch H. H. // J. Steroid Biochem. - 1980. - Vol. 13. - P. 529-532.
35. Morrison D., Reynolds S. P. et al. // Resp. Med. — 1994. — Vol.
88. - P. 659-663.
36. Moshang Т., Bongiovanni A. M. //J. Steroid Biochem. — 1973. — Vol. 4.-P. 11-15.
37. Nakano Y., Morimoto /., lshida O. et al // Bone Mineral. —
1994. - Vol. 26. - P. 245-259.
38. Negri-Cesi P., Motta M., Mornati O. //J. Steroid Biochem. Molec. Biol. - 1994. - Vol. 51. — P. 89-96.
39. OrwollE.S. //Trends Endocr. Metab. —1996. — Vol. 7. — P. 77— 84.
40. Pasupuleti V., Horton R. //J. Androi. — 1990. — Vol. 11. — P. 161-167.
41. Rao G. S. // Molec. cell. Endocr. - 1981. - Vol. 21. - P. 97-108.
42. ReuterS., Mayer D. //J. Steroid Biochem. Molec. Biol. —
1995. - Vol. 54. - P. 227-235.
43. Ribot C., Tromolliers F. // Ann. Endocrinol. — 1995. — Vol. 56. — P. 49-55.
44. Rivarola M., Podesta E. J., Cheemes H., Calandra R. S.// J. Steroid Bicohem. - 1975. - Vol. 6. - P. 365-369.
45. Sansone-Bazano G., Reisner R. M. //J. invest. Derm. — 1974. — Vol. 62. — P. 660-672.
46. Schweikert H. U., Ruf W., Niederle N. et al // Acta endocr.
(Kbh.). - 1980. - Vol. 95. - P. 258-264.
47. Schweikert H. U„ Wol/L., Romalo G. // Clin. Endocr. - 1995. -Vol. 43. - P. 37-42.
48. Sholl S. A., Robinson J. A., Goy R. W. // Steroids. — 1975. — Vol.
25.-P. 203-215.
49. Simpson E. R., Nichols J. E., Zkao Y. // Intern. Sympos. on DHEA Transformation: Abstracts. — Qubec Sity, 1995. — Abst. S8. — P. 18.
50. Smith C. M., Ballard S. A., Wyllie M. G, Masters J. R W. //
J. Steroid Biochem. Molec. Biol. — 1994. — Vol. 50. — P. 151 — 159.
51. Stenstad P., Eik-Nes K.B. // Biochim. biophys. Acta. — 1981. — Vol. 663. — P. 169-176.
52. Tabuchi Ch., Simmons D., Fausto A. // J. clin. Invest. — 1986. — Vol. 78. - P. 638-642.
53. Vanderschueren D., Bouillon R. // Calcif. Tiss. Int. — 1995. — Vol. 56.-P. 341-346.
54. Vittek J., Altman K., Gordon G. G., Southern A. L. //
Endocrinology. — 1974. — Vol. 94. — P. 325 —329.
55. Vittek J., Gordon G. G., Southern A. L. // Med.Sci.Res. — 1990. — Vol. 18.-P. 67-68.
56. Wheeler M. J. //Ann. clin. Biochem. — 1995. — Vol. 32, Pt 4. —
P. 345-357.
57. Wilson J. D. 11 Prostate. - 1996. - Suppl. 6. - P. 88-92.
Поступила 29.09.98/ Submitted 29.09.98
