CC BY
49
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВНИЯ
CLINICAL INVESTIGATIONS
© Коллектив авторов, 2000
: УДК 616-006.33.04+616-006.83:577.1
В. Г. Дегтярь, Т. В. Бабкина, Н. Е. Кушлинский,
Ю. Н. Соловьев, Н. Н. Трапезников
г АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА
АНДРОГЕНОВ У БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЬЮ ЮИНГА И ХОНДРОСАРКОМОЙ
НИИ клинической онкологии
Как известно, лечение больных с опухолями костей считается сложной проблемой для практической медицины. Среди различных видов комбинированного лечения этой патологии гормональная терапия не нашла еще должного применения. В то же время в литературе [1—3] представлены данные об изменении гормонального статуса больных с саркомами костей, и в частности половых стероидных гормонов. Это дает основание предположить, что у больных с саркомами костей или нарушается регуляция биосинтеза половых стероидов в гонадах (и/или в надпочечниках?), или имет место эктопический биосинтез половых стероидов в саркомах костей. Более того, наличие рецепторов половых стероидов в саркомах костей может указывать на гормональную чувствительность опухолей, при которой эндокринная терапия сможет привести к улучшению результатов лечения.
Разработка адекватных подходов к гормонотерапии предполагает понимание не только механизмов гормональной регуляции роста соответствующей опухоли, но и механизмов регуляции стероидогенеза. Однако, несмотря на важность проблемы по изучению роли половых стероидных гормонов у больных с косте- и хрящеобразующими опухолями, количество исследований, связанных с данной проблемой, невелико.
Недавно нами было показано, что в первичных остеосаркомах костей имеет место метаболизм андрогенов и обнаружена активность основных ферментов их метаболизма [7]. Наличие активности ферментов метаболизма андрогенов дает основание предположить, что андрогены играют определенную роль в патогенезе остеосаркомы. Воздействия на активность указанных ферментов — предпосылка для новых подходов в лечении остеосарком.
Цель настоящего исследования — сравнение активности ферментов метаболизма андрогенов в первичных опухолях у больных хондросаркомой и опухолью Юинга.
VG.Degtjar, T. V.Babkina, N.E.Kushlinsky, Yu.N.Soloviev, N.N. Trapeznikov
ANDROGEN METABOLIC ENZYME ACTIVITY IN PATIENTS WITH EWING’S TUMOR AND CHONDROSARCOMA
Institute of Clinical Oncology
Treatment of bone tumors is a great problem of practical medicine to-day. Hormonal therapy is not yet a recognized treatment modality of these diseases. However, there are publications [1-3] reporting of changes in hormonal status in patients with bone sarcoma, in particular as concerns sex steroid hormones. These changes may relate either to dysreg-ulation of steroid biosynthesis in gonades (and/or adrenals?) or to ectopic biosynthesis of sex steroid hormones in patients with bone sarcoma. Besides, the presence of sex steroid receptors in a bone sarcoma may be indicative of hormonal sensitivity of the tumor and therefore of efficiency of endocrine therapy in this case.
Development of adequate approaches to hormonotherapy must be based on both the knowledge of mechanisms of tumor growth hormonal regulation and regulatory mechanisms of steroid synthesis. However, there are too few studies on the role of sex steroid hormones in osteogenic or chondrogenic tumors in spite of the great significance of this problem.
We reported previously [7] of androgen metabolism in primary osteogenic sarcoma and activity of principal enzymes related to the metabolism. The enzyme activity suggests that androgens play a certain role in sarcoma development. Regulation of the enzyme activity may be a new approach to osteosarcoma treatment.
The purpose of this study was to compare activities of enzymes related to androgen metabolism in primary chondrosarcoma and Ewing's tumor.
Materials and Methods. The study was performed in 10 patients with chondrosarcoma and 9 patients with Ewing's tumor.
The androgens 4-androstene-17p-ol-3-one (T), 5a-androstane-17(3-ol-3-one (DHT), 5<x-androstane-3a,17p-diol (3a-D), 5a-androstane-3p,I7p-diol (3p-D) and 4-androstene-3,17-dione (A4) were supplied by Sigma (USA). [l,2,6,7-JH]-testosterone (PH]-T) (specific radioactivity 80-100 Ci/mmol) and 5a-dihydro-[I,2,6,7-3H]-testosterone ([-’H-DHT]) (specific radioactivity 80-105 Ci/mmol) were supplied by Amersham Int.PLC (United Kingdom).
Материалы и методы. Б исследование было включено 10 больных хондро-саркомой и 9 больных с опухолью Юинга.
Андрогены 4-андростен-17р-ол-3-он (Т), 5а-андростан-17р-ол-3-он (ДГТ), 5а-андростан-За,17р-диол (За-Д), 5а-андростан-Зр,17Ь-диол (Зр-Д) и 4-андростен-3,17-дион (А4) получены из фирмы «Sigma» (США). [1,2,6,7-3Н]-тестостерон ([3Н]-Т) (удельная радиоактивность 80-100 Ки/ммоль) и 5а-дигидро-[1,2,6,7-3Н]-тестостерон ([3Н-ДГТ]) (удельная радиоактивность 80-105 Ки/ммоль) получены из фирмы «Amersham Int. PLC» (Великобритания).
Для разделения метаболитов и для очистки [3Н]-Т и [3Н]-ДГТ использовали пластинки Silufol со слоем силикагеля 100 мк, размером 15x15 см (фирма «Kavalier», Чехия). Хроматографию проводили в системе растворителей бензол: ацетон: этанол (9:1:0,5, по объему) 3 раза.
Образующиеся метаболиты андрогенов в образцах опухолей костей определяли по описанному ранее методу с незначительными модификациями [б]. Кусочки тканей из опухоли растирали в фарфоровой ступке в жидком азоте, добавляли натрий-фосфатый буфер (0,05 моль/л, pH 7,4) из расчета 700 мкл на 200 мг ткани, размораживали и гомогенат центрифугировали 10 мин при 5000 g с охлаждением (центрифуга Optima ТМ TLC, «Beckman», США). Надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов. В стеклянные пробирки 12x70 мм вносили очищенный раствор [3Н-Т] или [3Н-ДГТ] (чистота не менее 98%) из расчета 8—9-104 имп/мин в пробе и соответственно раствор Т или ДГТ в этаноле для получения конечной концентрации стероида 10-7 моль/л в инкубационном растворе (см. ниже). Растворитель выпаривали на водяной бане при температуре не выше 60"С. Во льду в пробирки вносили 50 мкл гомогената опухоли (в контрольную пробу — 50 мкл натрий-фосфатного буфера) и 50 мкл того же буферного раствора, содержащего 100 мкг D-шокозы, 100 мкг D-глюкозо-б-фосфата, по 25 мкг НАДН2 и НАДФН2 и 50 мЕ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Пробы инкубировали 1 ч в водном термостате при 37 "С, затем к каждой пробе добавляли 10 мкл 1н. соляной кислоты и 10 мкл этанольного раствора немеченых андрогенов с концентрацией 1,0 мг/мл каждого определяемого метаболита. После лиофилизации к пробам добавляли 100 мкл смеси абсолютный этанол: бензол (9:1, по объему), хроматографировали, высушивали пластинку 5 мин при 80“С, пятна андрогенов выявляли в парах йода, вырезали и заливали сцинтиллятором во флаконах. Радиоактивность определяли в спектрометре LS 6500 («Beckman», США).
Количество каждого метаболита рассчитывали в фетомолях с учетом концентрации субстрата и соотношения радиоактивности в пятне к общей радиоактивности в вырезанных пятнах. Активность ферментов (А^стеро-ид:НАД(Ф)-оксидоредуктаза (5а-Р), За-гидроксистероид-оксидоредуктаза (За-ГСР), Зр-гидроксистероидоксидоредуктаза (Зр-ГСР), 17р-гидроксисте-роидоксидоредуктаза (17р-ГСР), 6,7-гидроксистероидоксидоредуктазы (6,7-ГСР)) рассчитывали по количеству соответствующего метаболита (или суммы метаболитов), образованного 1 мг общего белка гомогената за 1 ч.
При инкубации с Т активность 5а-Р определяли по образованию 5сс-ДГТ, Зос-Д и Зр-Д, активность 17р-ГСР - по образованию А4; при инкубации с ДГТ активность За-ГСР - по образованию За-Д, активность Зр-ГСР - по образованию Зр-Д, активность 6,7-ГСР - по образованию «полярных» соединений, подвижность которых при хроматографии была меньше, чем подвижность Зр-Д; радиоактивность определяли в вырезанных участках пластинки от линии старта до пятна Зр-Д.
Концентрацию общего белка в гомогенате определяли по методу Lowry [8] на спектрофотометре DU 650 («Beckman», США).
Результаты и обсуждение. При определении активностей 17(3-ГСР и 5а-Р в качестве субстрата использовали Т. Активность 5сс-Р определяли как сумму образовавшихся метаболитов - 5а-ДГТ, За-Д и 3(3-Д. Последнее имеет принципиальное значение для опухолей костей, так как образование указанных метаболитов, т. е. активность 5а-Р, мы обнаружили и в опухоли Юинга, и в хондросаркоме, однако образования 5а-ДГТ среди продуктов метаболизма Т не было обнаружено в ряде опухолей.
При изучении метаболизма андрогенов у больных с опухолью Юинга и хондросаркомой мы обнаружили активность всех указанных ферментов метаболизма, (см. выше). Активность этих ферментов в исследованных опухолях варьировала в широких пределах (см. таблицу).
При сравнении активности ферментов метаболизма андрогенов в этих двух группах выявлено, что наибольшая I
Silufol plates 15x15 cm with a 100m silica gel layer (Kavalier, Czech Republic) were used to separate metabolites and to purify [3H]-T and [3H]-DHT. Chromatography was carried out 3 times using a solvent system ben-zene:aceton:ethanol (9:1:0.5 v/v).
Detection of the resultant androgen metabolites in bone tumor specimens was carried out by a method described elsewhere [5] with minor modifications. Tumor tissue pieces were triturated in liquid nitrogen, Na-phosphate buffer (0.05 mol/1, pH 7.4), 700 mcl per 200 mg tissue, was added to the triturated tumor specimens, the resultant mixture was melted, and the homogenate was centrifuged 10 min at 5,000g under cooling (centrifuge Optima TM TLC, Beckman, USA). The supernatant was used to measure enzyme activity. Purified [3H-T] or [3H-DHT] solutions (purity not less than 98%) 8-9x104 ppm and respective T or DHT ethanol solutions were transferred to glass test tubes 12x70 mm to have a 10-7 mol/1 steroid end concentration in incubation solution (see below). The solvent was evaporated on water bath at a temperature not higher than 60"C. Tumor homogenate, 50 mcl, and the same buffer solution, 50 mcl, containing 100 meg D-glucose, 100 meg D-glucose-6-phosphate, 25 meg NADH2 and 25 meg HADPH2, 50 mE glucose-6-phosphate dehydrogenase were placed in the test tubes on ice. The specimens were incubated 1 h in water thermostat at 37"C, then 10 mcl IN hydrochloric acid and 10 mcl ethanol solution of unlabeled androgens at a 1.0 mg/ml concentration of every metabolite to be determined were added to each specimen. After lyophilization 100 mcl mixture of absolute ethanol and benzene (9:1 v/v) was added to the specimens, the resultant mixture underwent chromatography, the plate was dried 5 min at 80oC, androgen stains were developed in iodine vapor, cut out, placed in vials into which scintillant was added. Radioactivity was measured using an LS 6500 spectrometer (Beckman, USA).
Content of each metabolite was calculated in fmol with respect to substrate concentration and radioactivity ratio and total radioactivity in stains. Activities of enzymes [A‘lsteroid:NAD(P)-oxidoreductase (5a-R), 3a- hydroxysteroi-doxidoreductase (3a-HSR), 3p-hydroxysteroidoxidoreductase (3p-HSR), 17p- hydroxysteroidoxidoreductase (17P-HSR), 6,7- hydroxysteroidoxidore-ductase (6,7-HSR)] were calculated by the content of relevant metabolite (or the total of several metabolites), produced in mg total homogenate protein for 1 h. After incubation with T the activity of 5a-R was determined by production of 5a-DHT; the activities of 3aD, 3p-D and 17p-HSR were determined by production of A4; after incubation with DHT the activity of 3a-HSR was determined by production of3a-D, the activity of 3p-HSR was determined by production of 3p-D, the activity of 6,7-HSR was determined by production of polar compounds with a lower chromatographic mobility as compared to 3p-D; radioactivity was measured in the cut-out plate fragments from the start line to the stain corresponding to 3p-D.
Homogenate total protein concentration was measured by the Lowry technique [8] using a DU 650 spectrophotometer (Beckman, USA).
Results and Discussion. T was used a substrate in measurement of 17p-HSR and 5a~R activities. The 5a-R activity was defined as the total of resultant metabolites 5a-DHT, 3a-D and 3(3-D. The latter condition is of principal importance for bone tumors because production of these metabolites, i.e. 5a-R activity, is also detected in Ewing's tumor and in chondrosarcoma, while 5cc-DHT is not found among T metabolism products in some tumors.
When studying androgen metabolism in patients with Ewing's tumor and chondrosarcoma we found activities of all the above-mentioned metabolism enzymes (see above). The enzyme activities in the tested tumors varied considerably (see the table).
Comparison of the activities in the two tumor types demonstrated that the 3a~HSR activity was the highest and the 17(3-HSR was the lowest (see the figure). Note that the activities of 3a-HSR, 3P-HSR and 17(3 HSR were much higher in Ewing's tumor than in chondrosarcoma, while the 5a-R and 6,7-HSR activities were higher in chondrosarcoma than in Ewing's tumor (see the figure), the differences in the 3p-HSR activities between the two tumors (Student's test) were statistically significant, while the differences in 5a-R were approaching the significance limit (0.005<p<0.01).
Clinical Investigations
Таблица Table
Активность ферментов метаболизма андрогенов в опухоли Юинга и хондросаркоме (М+т)
Androgen metabolic enzyme activities in Ewing's tumor and chondrosarcoma (Mean+S.D.)
Фермент Нозологическая форма
опухоль Юинга (п=9) хондросаркома (n=10)
5cc-P / 5a-R 17Р-ГСР/ 17J3-HSR ЗР-ГСР /ЗР-HSR За-ГСР / За-HSR 6,7-ГСР/6,7-HSR 1731+512 (19—5003) 345±106 (135—734) 4127+715 (1235—7949) 6860+1299 (2304—14664) 988+364 (79—2860) 3064±487 (1065—4898) 158±83 (318—658) 1452±226 (750—2575) 3298±1231 (449—9529) 1352±533 (375—3967)
Enzymes Ewing's tumor (n=9) chondrosarcoma (n=10)
Tumor type
П p и м e ч а и и e. В скобках указаны границы разброса величин. Note. Numbers in parentheses are ranges.
активность была у Зос-ГСР по сравнению с активностью других ферментов. Наименьшая активность была обнаружена у 17р-ГСР (см. рисунок). Необходимо отметить, что активности За-ГСР, 3[3-ГСР и 17Р-ГСР были значительно выше в опухоли Юинга, чем в хондросаркоме, а активности 5а-Р и 6,7-ГСР выше в хондросаркоме, чем в опухоли Юинга (см. рисунок), однако в обеих опухолях достоверно по критерию Стьюдента различалась активность ЗР-ГСР (р=0,004), а различие в активности 5а-Р было на границе достоверности (0,005<р<0,01).
Представленные данные позволяют расположить активности ферментов метаболизма в опухоли Юинга и хондросаркоме в следующем порядке:
опухоль Юинга - За-ГСР>Зр-ГСР>5а-Р>б,7-ГСР> 17Р-ГСР;
хондросаркома — За-ГСР>5а-Р>ЗР-ГСР>б,7-ГСР> 17Р-ГСР.
Опухоль Юинга относительно редкое заболевание нейроэктодермального происхождения, развивается в юном возрасте (в нашем исследовании пациенты были в возрасте от 14 до 19 лет). Хондросаркома встречается в 2 раза чаще опухоли Юинга, возникает в более позднем возрасте, может быть первичной или явиться результатом опухолевой трансформации доброкачественных хрящевых опухолей или хрящевых дисплазий [4] (возраст больных в представленном исследовании от 37 лет до 61 года). Пока трудно ответить однозначно на вопрос, почему при данных патологиях в опухолях значительно отличается только активность двух ферментов метаболизма андрогенов -5а-Р и Зр-ГСР. Можно указать две основные причины этих отличий. Во-первых, изменения активности ферментов метаболизма андрогенов могут быть специфическими для рассмотренных типов опухолей. Во-вторых, эти отличия могут быть связаны со значительным различием в возрасте пациентов: больные с опухолью Юинга были
1 2 3 4 5
Рисунок. Средняя активность ферментов метаболизма андрогенов в опухоли Юинга (светлые столбики) и хондросаркоме (темные столбики).
1 — активность 5а-Р; 2 — 17Р-ГСР; 3 — Зр-ГСР; 4 — За-ГСР;
5 — 6,7-ГСР.
Figure. Mean activities of androgen metabolic enzymes in Ewing's tumor (light bars) and in chondrosarcoma (dark bars).
1, 5a-R; 2, 17P-HSR; 3, 3p-HSR; 4, 3a-HSR; 5, 6,7-HSR.
Our findings suggest that the activities of the metabolic enzymes in Ewing’s tumor and in chondrosarcoma should be arranged in the following order:
Ewing's tumor: 3a-HSR>3P-HSR>5a-R>6,7-
HSR>17p-HSR;
chondrosarcoma: 3a-HSR>5a-R>3p~HSR>6,7-HSR> 17-p-HSR.
Ewing's tumor is a rather rare neuroectodermal disease that develops in juvenile patients (in our study aged 14 to 19 years). Chondrosarcoma is two-fold more frequent than Ewing's tumor and develops at an older age (in our study the patients' age ranged from 37 to 61 years); it may arise as a primary lesion or result from neoplastic transformation of benign cartilaginous tumors or dysplasia [4]. It is difficult to give a definite answer to the question why these tumors demonstrated different activities of only two enzymes involved in androgen metabolism, i.e. 5a-R and 3P-HSR. There may be two reasons for this finding. First, the discovered changes in activities of androgen metabolic enzymes could be specific for the tumor types in question. Second, the differences might be due to the large age variation of the patients with the two tumors in question, cf. 14 to 19 years for Ewing's tumor and 37 to 61 years for chondrosarcoma.
The presented findings suggest that Ewing's tumor and chondrosarcoma express principal enzymes of androgen metabolism and degree of expression of these enzymes varies considerable. It is important that the differences in activity were found for two principal enzymes of androgen metabolism, that is for 5a-R responsible for transformation of T (the main human androgen) into a cell effector androgen DHT and 3p-HSR responsible for DHT inactivation in target cells [5] and therefore may be related to regulation of tumor intracellular DHT content. However, the supposition may also be made that androgen metabolites (not only DHT) play a certain role in pathogenesis of the two tumor types considered, though further study is needed to verify this supposition.
в возрасте от 14 до 19 лет, а больные с хондросаркомой -от 37 лет до 61 года.
На основании представленных результатов можно заключить, что в опухолях Юинга и хондросаркоме имеет место экспрессия основных ферментов метаболизма андрогенов и уровень экспрессии этих ферментов различен. Важно отметить, что отличия в активности связаны с двумя важными ферментами метаболизма андрогенов: 5а-Р, которая превращает основной андроген в организме человека Т в клеточный андроген-эффектор ДГТ, и 3|3-ГСР, которая «инактивирует» ДГТ в клетках-мишенях [5]. Следовательно, это может быть связано с регуляцией внутриклеточного содержания ДГТ в опухолях. В то же время нельзя исключить, что метаболиты андрогенов (не только ДГТ) могут играть определенную роль в патогенезе двух типов исследованных опухолей, однако для доказательства этих предположений необходимы дальнейшие исследования.
© Коллектив авторов, 2000 УДК 616-009.7-085:616-006-05
М. Е. Исакова, 3. В. Павлова, В. В. Брюзгин
КЕТАНОВ В ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО БОЛЕВОГО СИНДРОМА У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
Отделение амбулаторных методов лечения и диагностики РОНЦ им. Н. И. Блохина РАМН
При прогрессировании злокачественных опухолей выраженный болевой синдром возникает у 60—80% больных, что требует регулярного применения анальгетиков. Использование опиоидов в клинической практике было первой попыткой назначения лекарственных препаратов, купирующих боли сильной интенсивности независимо от их этиопатогенеза в связи с наличием выраженного аналге-зирующего эффекта.
Однако, учитывая ряд нежелательных побочных реакций (тошнота, рвота, запоры и т. п.), опиоиды не получили широкого распространения в лечении хронической боли.
В конце 80-х годов ситуация резко изменилась в связи с внедрением в клиническую практику нестероидных противовоспалительных препаратов, одним из представителей которых является кетанов — новый периферический анальгетик, сочетающий в себе такие свойства, как:
1) высокая аналгезирующая активность, равная по степени выраженности препаратам опиоидного ряда;
2) высокая безопасность в связи с отсутствием побочных реакций, характерных для наркотических анальгетиков;
3) пролонгированное действие;
4) возможность применения как орально, так и парентерально.
Кеторолака — трометамин (торадол, кетродол) — пирролозамещенный дериват арилацетиловой кислоты, является действующим ингредиентом препарата кетанов, который
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Корницкий М. А. // Вопр. онкол. — 1974. — Т. 20. — С. 26—31.
2. Кушлинский Н. Е., Бассалык Л. С., Соловьев Ю. Н. и др. //
Там же. - 1992. - Т. 38. - С. 279-230.
3. Кушлинский Н. Е., Соловьев Ю. Н., Амирасланов А. Т. //
Вестн. ОНЦ РАМН. - 1993. - №2. - С. 31-37.
4. Трапезников Н. Н., Подцубная И. В., Артамонова Т. И. и др.
// Справочникпо онкологии. — М., 1996. — С. 169—172.
5. Bartsch W., Klein Н., Schiemann U. et al. //Ann. N.Y. Acad.
Sol. - 1990. - Vol. 595. - P. 53-66.
6. Degtiar W. G., Loseva L. A., Isachenkov V. A. // Endocrinol.
exp. - 1981. - Vol. 15. - P. 181-190.
7. Kushlinsky N. E., Degtiar W. G., Babkina Т. V., Trapeznikov N.
N. / Int. Congress on Hormonal Steroids, 10-th: Abstracts. — Quebec City, 1998. — P. 148.
8. Lowry О. H., Roserbrough N. J., Farr A. L., Randall K. J. //J.
biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
Поступила 22.10.99 / Submitted 22.10.99
M.E.Isakova, Z. VPavlova, V. V.Bryuzgin
KETANOV IN THE TREATMENT OF CHRONIC PAIN IN CANCER PATIENTS
Department of Out-Patient Treatment and Diagnosis, N.N.Blokhin CRC, RAMS
Sixty to eighty percent of patients with progressive cancer experience severe pain requiring regular administration of analgesics. Opioid therapy with a marked analgesic effect was the first attempt to control strong pain irrespective of its cause. However, these agents are not widely used to control chronic pain due to side effects (nausea, vomiting, constipation etc.).
In the late eighties there was a considerable progress in the situation related to the appearance of non-steroid antiinflammatory drugs. Ketanov is a new peripheral analgesic from this class that combines positive properties such as (1) high analgesic activity similar to that of opioids; (2) good safety characteristics, no side-effects specific of narcotic analgesics; (3) long-lasting effect; (4) availability of oral and parenteral formulations.
Ketorolac tromethamine (toradol, ketrodol), a pyrrolo-substituted derivative of arylacetylic acid, is the active ingredient of the drug ketanov supplied by Ranbaxy both in tablets and ampoules.
Ketanov inhibits production of pain mediators prostaglandins through inhibition of cyclooxygenase synthesis. It does not bind to opioid receptors and therefore has no effect on the central nervous system, does not suppress the respiratory center or smooth muscular contractility. Ketanov analgesic effect is greater than its anti-inflammatory, antipyretic and aggregation effects.
