CC BY
1О.О.Бабич, канд. техн. наук С.А. Сухих, канд. техн. наук Л.С. Солдатова, аспирант А.Ю. Просеков, д-р техн. наук, проф.
ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
УДК 663.12/.14
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ВЫХОДА АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ
И АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивировали на молочной сыворотке с дополнительным внесением источников азота, фосфора и глюкозы. Показана высокая биосинтетическая способность дрожжей при росте на молочной сыворотке, обогащенной глюкозой. В этом случае удельная скорость роста дрожжей равна 0,017 ч-1, выход биомассы составляет 1,25 г/г, накопление биомассы - 36,50 г/л. Определены параметры, обеспечивающие максимальный выход алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы: температура культивирования 30°С, продолжительность культивирования 18 ч и отношение объема культуральной жидкости к объему воздушной среды (Укж/Увс) 1:4. Удельная активность алкогольдегидрогеназы равна 20 Е/мг белка и альдегиддегидрогеназы 0,30 Е/мг белка при использовании всех источников питательных веществ.
Ключевые слова: алкогольдегидрогеназа, альдегиддегидрогеназа, культивирование, дрожжи, этиловый спирт, ацетальдегид, биомасса, активатор.
O.O. Babich, Cand. Sc. Engineering, S.A. Sukhih, Cand. Sc. Engineering L.S. Soldatova, P.G., A.Y. Proseckov, D. Sc. Engineering, Prof.
OPTIMIZATION OF CULTIVATION PROCESS OF YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE TO INCREASE ALCOHOL DEHYDROGENASE AND ALDEHYDE DEHYDROGENASE OUTPUT
The yeast Saccharomyces cerevisiae was cultured on whey with making additional sources of nitrogen, phosphorus and glucose. The high biosynthetic capacity of yeast grown on whey, enriched with glucose is shown in the article. In this case, the specific growth rate of yeast is equal to 0.017 h-1, biomass yield is 1.25 g/g, biomass accumulation is 36.50 g/l. Parameters to ensure the maximum yield of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase are defined: cultivation temperature is 30°C, cultivation duration is 18 h. and the ratio of the culture fluid to the air volume is (Ус/Ут) 1:4. The specific activity of alcohol dehydrogenase is 20 U/mg protein and aldehyde dehydrogenase is 0.30 U/mg protein, using all sources of nutrients.
Key words: alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, cultivation, yeast, ethanol, acetaldehyde, biomass, activator.
Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов являются основой для получения продуктов биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии [1, 2]. Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении определенной ферментационной стадии или всего жизненного цикла
[3-5].
Среди отходов пищевой промышленности значительное место занимает молочная сыворотка, получаемая при переработке молока на сыр, творог или казеин. Молочная сыворотка является хорошей средой для выращивания дрожжей [6, 7].
Целью данной работы является оптимизация процесса культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae с целью повышения выхода алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы.
В качестве объекта исследований были выбраны дрожжи S. сerevisiae, обладающие высокой каталитической активностью по отношению к этиловому спирту и ацетальдегиду и являющиеся перспективным сырьем для получения алкогольдегидрогеназы (АДГ) и альдегиддегидрогеназы (АЛДГ) [8, 9].
Для выращивания дрожжей S. сerevisiae применяли молочную сыворотку, полученную при производстве творога. Сыворотку стерилизовали и перед использованием в эксперименте центрифугировали для удаления осадка. Сухие вещества в сыворотке определяли по сахарометру. Поскольку молочная сыворотка характеризуется низким содержанием азотистых соединений, фосфора и глюкозы, в качестве дополнительных источников азота вносили 250 мг/л (NH^SO^ магния - 200 мг/л MgSO4, а также 5,0 г/л глюкозы.
Выращивание дрожжей осуществляли в лабораторных дрожжерастительных аппаратах, снабженных мешалкой с рабочим объемом 5 л. Для экспериментов использовали посевной материал, выращенный на качалке в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды. Величину посева среды в аппарате определяли взвешиванием высушенных до постоянной массы дрожжей, отцентрифугированных из 10 мл культу-ральной жидкости. В аппарат смывали отцентрифугированные дрожжи из двух колб. Условия выращивания были следующими: температура 32-34°С, рН среды 4,5-5,5, аэрация воздухом - 100 л/мин при скорости вращения мешалки 1000 об/мин.
Время окончания роста дрожжей первоначально определяли по прекращению накопления биомассы.
Биомассу дрожжей определяли как разницу биомассы до и после культивирования.
Для количественной характеристики культивирования дрожжей S. cerevisiae пользовались показателем удельной скорости роста, которая характеризует часовой прирост на единицу растущей биомассы.
Анализ динамики роста дрожжей проводили путем отбора из аппарата через заданные промежутки времени 20 мл культуральной среды и центрифугированием ее с последующим установлением количества дрожжей весовым методом.
Массовую долю жира в дрожжах определяли кислотным методом Гербера по ГОСТ 5867.
Для определения содержания белка использовали анализатор общего азота (белка) «Rapid N cube» и метод Дюма.
Наличие ферментов алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в дрожжах и культуральной жидкости определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
Каталитическую активность алкогольдегидрогеназы оценивали по скорости окисления кофермен-та никотинамиддинуклеотида восстановленного (НАДН), которую регистрировали на самописце спектрофотометра по убыли величины оптической плотности при длине волны 340 нм.
Каталитическую активность альдегиддегидрогеназы определяли методом Б.М. Кершенгольц и Е.В. Серкиной [10], регистрируя начальную скорость образования НАДН при окислении ацетальдегида с образованием уксусной кислоты.
Выращивание дрожжей S. cerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, фосфора и глюкозы, сопровождалось интенсивным нарастанием биомассы. Результаты, полученные при выбранных параметрах, представлены в таблице 1. Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что удельная скорость роста дрожжей возросла в 1,2 раза при выращивании на молочной сыворотке с дополнительным источником азота, 1,5 раза при выращивании с дополнительным источником фосфора и в 1,7 раз при выращивании с дополнительным источником глюкозы по сравнению с контролем. В качестве контроля использовали молочную сыворотку. При этом выход биомассы увеличился в 1,17; 1,85 и 2,1 раза при использовании дополнительного источника азота, фосфора и глюкозы, соответственно. Из таблицы 1 также следует, что повышения активности АДГ и АЛДГ в результате внесения дополнительных источников азота, фосфора и глюкозы не наблюдалось. Из представленных данных можно сделать вывод о том, что оптимальной средой для выращивания дрожжей S. cerevisiae является молочная сыворотка, содержащая дополнительное количество глюкозы.
Таблица 1
Характеристика процесса культивирования дрожжей штамма S. Cerevisiae
Характеристика Контроль Наименование элементов
(NH4)2SO4 MgSO4 Глюкоза
Удельная скорость роста, ч-1 0,010±0,0007 0,012±0,0008 0,015±0,0009 0,017±0,0009
Выход биомассы, г/г 0,60±0,03 0,70±0,04 1,11±0,05 1,25±0,07
Накопление биомассы дрожжей, г/л 19,80±1,20 24,10±1,45 30,70±1,54 36,50±2,20
Удельная активность АДГ, Е/мг белка 20,00±1,20 20,00±1,20 20,00±1,20 20,00±1,20
Удельная активность АЛДГ, Е/мг белка 0,30±0,02 0,30±0,02 0,30±0,02 0,30±0,02
Состав биомассы дрожжей, % массовая доля белка 42,00±2,50 50,80±3,05 75,30±4,50 75,30±4,50
массовая доля жира 11,60±0,70 9,50±0,60 3,40±0,25 3,40±0,25
Изучение кинетики рассматриваемых явлений (рис. 1) показало, что после введения в среду активатора следует стадия задержки роста дрожжей. Так, для культур, активируемых источником азота, рост начинается через 4,5 ч после внесения активатора. Культуры, активируемые источником магния и глю-
козой, имеют сходный по продолжительности период задержки роста. Во всех опытах длительность этого периода составляет 1,5-2,0 ч. Задержку роста можно объяснить перестройкой биохимических систем клетки при переходе от низкой скорости роста биомассы к максимальной, связанной с синтезом дополнительных ферментов и других компонентов клетки.
1,4
1,2
0,6
т 0,4
3
2
1
/
• /
3
Время, ч
Рис. 1. Кривые роста дрожжей 8. сегеу1$1ае на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники:
1 - азота, 2 - магния, 3 - глюкозы
0
2
4
5
6
Таким образом, популяция дрожжей в течение 4,5 ч способна увеличить скорость размножения до максимального уровня, что свидетельствует о высоких адаптивных возможностях дрожжей рода S. сегеу1я1ае.
Для всех опытов по активации роста любым из трех источников питания характерно скачкообразное увеличение скорости роста после стадии задержки. При этом в первые 1,0-2,5 ч после начала роста его скорость близка к максимальному значению. Изучение динамики изменения возрастного состава изучаемых популяций показало также наличие стадии задержки. Однако продолжительность этого периода почти не зависит от предыстории культуры и природы фактора активатора. Во всех экспериментах почкование начинается через 2,0-4,5 ч после активации. При этом в первые 6 ч доля ювенильных почек достигает значения 25-40%, в то время как у стационарных культур величина этого показателя не превышает 10%. Для культур, активированных источником азота, максимальные концентрации юве-нильных почек отмечаются в период задержки размножения клеток. Высокая концентрация почкующихся клеток свидетельствует об увеличении продолжительности данного периода, то есть увеличении времени, необходимого для прохождения клеткой ранних стадий митоза, профазы и метафазы, в сравнении с нормой.
Дальнейшие исследования направлены на изучение влияния условий культивирования дрожжей рода Х сетеу181ав на уровень секреции ферментов АДГ и АЛДГ. Из литературных данных известно, что условия культивирования дрожжей - интенсивность аэрации, время и температура, концентрация основных компонентов среды могут влиять на количественный выход белков и каталитическую активность ферментных систем. Результаты собственных исследований показывают, что максимальный выход биомассы наблюдается при отношении объема культуральной жидкости к объему воздушной среды (Укж/Увс), равном 1:4, что свидетельствует о важности процессов дыхания в метаболизме дрожжей. В то же время оказалось, что на стадии индукции синтеза белка оптимальными являются отношения 1:2 (рис. 2).
В следующей серии опытов определяли влияние температуры на процесс культивирования дрожжей и синтез АДГ и АЛДГ. Результаты, полученные в ходе проведения исследований, представлены на рисунке 3.
Результаты, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о значительных колебаниях величины удельной скорости дрожжей в зависимости от температуры. Видно, что при повышении температуры во всех экспериментах наблюдаются длительные периоды, при которых удельная скорость роста значительно превышает ее значение при исходной и конечной температуре, установленной у культуры, растущей при постоянном температурном режиме. Наблюдаемое явление можно объяснить тем, что дрож-
жи, находящиеся в различных стадиях развития, по-разному реагируют на изменение температуры, что, в свою очередь, приводит к значительному изменению возрастного состава культуры при температурных переходах.
1:1 1:2 1.3 1:4 15
УкжА/вс
Рис. 2. Влияние интенсивности аэрации на выход биомассы дрожжей 8. сегеу1$1ае на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники: Н - азота, - магния, ■ - глюкозы
0,018
14 и 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Температура, °С
Рис. 3. Влияние температуры на культивирование дрожжей 8. сегеу1Б1ае на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники: - азота, - магния, - глюкозы
Из рисунка 3 также следует, что оптимальной температурой роста дрожжей рода & сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, магния либо глюкозы, является температура 30°С.
На следующем этапе исследования определяли продолжительность культивирования дрожжей, обеспечивающую максимальный выход алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогензы с учетом параметров, выбранных ранее. Результаты представлены в таблице 2. Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что оптимальной продолжительностью культивирования дрожжей & сerevisiae на молочной сыворотке, содержащей дополнительные источники азота, магния и глюкозы, является 18 ч, поскольку дальнейшее увеличение продолжительности культивирования не приводит к повышению активности ферментов АДГ и АЛДГ.
Таким образом, проведены исследования, направленные на изучение условий культивирования дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, обеспечивающих максимальный выход алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогензы. В качестве среды была использована молочная сыворотка, обогащенная дополнительными источниками азотистых соединений, фосфора и глюкозы в количествах: (N^^80^ 250 мг/л, источников магния MgS04 - 200 мг/л и глюкозы - 5,0 г/л. Максимальные величины удельной скорости роста дрожжей и активности АДГ и АЛДГ при использовании всех исследуемых источников питательных веществ наблюдаются при температуре 30°С, продолжительности культивирования 18 ч и
Таблица 2
Активность ферментов АДГ и АЛДГ, продуцируемых дрожжами 8. сегеу1$1ае
Продолжительность культивирования, ч Удельная активность ферментов, Е/мг белка
АДГ АЛДГ
Молочная сыворотка, содержащая (КН4)2804
2 1,30±0,08 0,04±0,003
4 2,50±0,15 0,04±0,003
8 9,00±0,54 0,09±0,006
12 12,70±0,76 0,13±0,009
16 17,60±1,06 0,21±0,01
18 20,00±1,20 0,30±0,02
20 20,00±1,20 0,30±0,02
Молочная сыворотка, содержащая MgS04
2 1,05±0,06 0,09±0,005
4 1,90±0,11 0,11±0,007
8 7,85±0,47 0,15±0,009
12 10,40±0,62 0,21±0,01
16 15,70±0,94 0,23±0,01
18 20,00±1,20 0,30±0,02
20 20,00±1,20 0,30±0,02
Молочная сыворотка, содержащая глюкозу
2 1,78±0,11 0,14±0,008
4 2,89±0,17 0,19±0,01
8 10,70±0,64 0,24±0,02
12 14,60±0,88 0,36±0,02
16 18,65±1,12 0,42±0,03
18 20,00±1,20 0,30±0,02
20 20,00±1,20 0,30±0,02
отношении объема культуральной жидкости к объему воздушной среды (Ркж/Рвс), равном 1:4. При этом максимальная удельная скорость роста дрожжей cerevisiae, равная 0,017 ч-1, наблюдается при использовании в качестве питательной среды молочной сыворотки, обогащенной глюкозой. Для описанного случая характерны также максимальные величины выхода биомассы (1,25 г/г) и накопления биомассы дрожжей (36,50 г/л). В связи с этим перспективным является использование в качестве питательной среды для выращивания дрожжей X. cerevisiae, являющихся продуцентами алкогольдегидроге-назы и альдегиддегидрогензы, молочной сыворотки с дополнительным источником глюкозы.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, гос. контракт №16.740.11.0192 от 24 сентября 2010 г.
Библиография
1. Антипова, Л.В. Прикладная биотехнология / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, А.И. Жаренов.- Воронеж, 2000.- 332 с.
2. Владимирова, И.С. Интенсификация процессов аэробного культивирования микроорганизмов / И.С. Владимирова, В.М. Емельянов, Н.К. Филиппова // Вестник Казанского технологического университета.- 2009.- №2.- С. 90-95.
3. Самыгин, В.М. Бактериологический контроль воздушной среды в установках для культивирования микроорганизмов / В.М. Самыгин, Т.А. Гришкина, Л.К. Жога // Экологические системы и приборы.- 2009.- №8.- С. 1216.
4. Смирнова, В.Д. Интенсификация процесса биоконверсии отходов пищевой промышленности в дрожжевую биомассу кормового назначения / В.Д. Смирнова, И.В. Балакирев, Е.В. Башашкина // Химическая промышленность сегодня.- 2010.- №8.- С. 10-15.
5. Маркова, Ю.А. Вариабельность ферментативного аппарата энтеробактерий в зависимости от температуры культивирования / Ю.А. Маркова, Л.А. Беловежец, А.Л. Алексеенко // Известия Иркутского государственного университета. Серия: Биология. Экология.- 2008.- Т. 1.- №1.- С. 18-21.
6. Гаврилова, Н.Б. Ферментированная молочная сыворотка / Н.Б. Гаврилова // Молочная промышленность. -2006.- №6.- С. 30.
7. Хамнаева, Н.И. Культивирование микробных консорциумов в молочной сыворотке / Н.И. Хамнаева, И.Л. Баташева // Успехи современного естествознания.- 2004.- №4.- С. 135-136.
8. Tani, A. Thermostable NADP(+)-dependent medium-chain alcohol dehydrogenase from Acinetobacter sp. strain M-1: purification and characterization and gene expression in Escherichia coli / A. Tani, Y. Sakai, T. Ishige // Appl. Environ. Microbiol.- 2000.- №66.- Р. 5231-5235.
9. Yoshida, A. Genetic polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes related to alcohol sensitivity and alcoholic diseases / A. Yoshida // Alcohol and Alcoholism.- 1994.- №29.- Р. 693-696.
10. Кершенгольц, Б.М. Некоторые методические подходы к изучению метаболизма этанола / Б.М. Кершенгольц, Е.В. Серкина // Лабораторное дело.- 1981.- №2.- С. 126.
Bibliography
1.AntipovaL.V. Applied Biotechnology / L.V. Antipova, I.A. Glotova, A.I. Zharenov.- Voronezh, 2000 .- 332p.
2. Vladimirova I.S. Intensification of the aerobic cultivation of microorganisms / I.S. Vladimirova, V.M. Emelianov, N.K. Filippova // Bulletin of the Kazan Technological University .- 2009 .- № 2 .- P. 90-95.
3. Samygin V.M. Bacteriological monitoring of ambient air in plants for the cultivation of microorganisms / V.M. Samygin, T.A. Grishkina, L.K. Zhoga // Ecological Systems and Devices .- 2009 .- № 8 .- P. 12-16.
4. Smirnova V.D. Intensification of food waste bioconversion in the yeast feed biomass / V.D. Smirnova, I.V. Balakirev, E. V. Bashashkina // Khimicheskaya promyshlennoct segodnya.- 2010 .- № 8 .- P. 10-15.
5. Markova Y.A. The variability of enzymatic apparatus Enterobacteriaceae according to the temperature of cultivation / Y.A. Markova, L.A. Belovezhets, A.L. Alekseenko // Proceedings of the Irkutsk state university. Series: Biology. Ecology.- 2008 .- Vol.1 .- № 1 .- P. 18-21.
6. Gavrilova N.B. Fermented whey / N.B. Gavrilova // Dairy Industry - 2006 .- № 6 .- P. 30.
7. Hamnaeva NI. Cultivation of microbial consortia in the whey / N.I. Hamnaeva, I.L. Batasheva // Uspehy sovremennogo estestvoznaniya.- 2004 .- № 4 .- P. 135-136.
8. Tani, A. Thermostable NADP (+)-dependent medium-chain alcohol dehydrogenase from Acinetobacter sp. strain M-1: purification and characterization and gene expression in Escherichia coli / A. Tani, Y. Sakai, T. Ishige // Appl. Environ. Microbiol .2000 .- № 66 .- P. 5231-5235.
9. Yoshida, A. Genetic polymorphisms of alcohol metabolizing enzymes related to alcohol sensitivity and alcoholic diseases / A. Yoshida // Alcohol and Alcoholism .- 1994 .- № 29 .- P. 693-696.
10. Kershengolts B.M. Some methodological approaches to the metabolism of ethanol study / B.M. Kershengolts, E.V. Serk-ina // Laboratornoye delo.- 1981 .- № 2 .- P. 126.
