Оптимизация процесса экстракции биологически активных веществ из сбора для лечения заболеваний почек Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 615.2./3.8.07

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ЭКСТРАКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ СБОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК

© Л.М. Федосеева, М.В. Бабаева'

Алтайский государственный медицинский университет, пр. Ленина, 40,

Барнаул, 656099 (Россия). E-mail: [email protected]

Для разработки технологической схемы получения сухого экстракта сбора для лечения заболеваний почек с помощью симплексного метода математического планирования эксперимента найдены оптимальные условия процесса экстракции: соотношение сырья и экстрагента 1 : 10, продолжительность экстракции 30 мин, число мацераций 3, температура 100 °С, технологический выход по экстрактивным веществам составил 95%.

Ключевые слова: экстракт, экстракция, оптимальные условия экстракции, технологический выход.

Введение

Сборы - древнейшая лекарственная форма, сохраняющая свою актуальность и в настоящее время. Они содержат комплекс биологически активных веществ, обладающий поливалентным действием.

Сборы предназначены для приготовления в домашних условиях настоев или отваров, что связано с неудобствами дозирования, приготовления, хранения.

Рационально из сборов получать сухие экстракты. Экстракты обладают рядом преимуществ: точностью дозирования, удобством применения, увеличением срока хранения. Экстракты - это концентрированные вытяжки из лекарственного растительного сырья, позволяющие получить комплекс биологически активных соединений с достаточно высоким технологическим выходом.

Нами разработан сбор состава: цветки ромашки, цветки календулы, листья бадана, трава мелиссы, соплодия хмеля, плоды шиповника.

Проведен фитохимический анализ сбора и установлено содержание флавоноидов, флороглюцидов, фе-нологликозидов, дубильных веществ, сапонинов, антраценпроизводных, водорастворимых витаминов (аскорбиновая кислота). Алкалоиды и кумарины не обнаружены [1]. Доказана его антимикробная и мочегонная активность данного сбора [2]. Для разработки технологии экстракта сбора необходимо подобрать оптимальные условия экстрагирования.

Цель работы - оптимизация процесса экстракции биологически активных веществ из сбора для лечения заболеваний почек.

Для оптимизации процесса экстракции использовали симплексный метод математического планирования эксперимента, имеющий широкое применение в фармации [3].

Экспериментальная часть

Сбор готовили из сырья, заготовленного в Горном Алтае в 2006-2007 гг. Установили показатели подлинности и доброкачественности сбора: влажность, зола общая, зола, нерастворимая в растворе хлористоводородной кислоты, содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, очищенной по общепринятым методикам [4]. Количественное содержание дубильных веществ определили спектрофометрически по цветной реакции танидов с раствором аммония молибдата 2% [5].

* Автор, с которым следует вести переписку.

Для определения максимального выхода экстрактивных и биологически активных веществ необходимо подобрать оптимальный эктрагент. В качестве экстрагента использовали воду очищенную и спирт этиловый различных концентраций (40, 70, 95%). В результате исследования установлено, что вода очищенная извлекает максимальное количество экстрактивных и дубильных веществ. В последующем в качестве экстрагента использовали воду очищенную.

Получение экстракта проводили методом ремацерации.

Переменными факторами, влияющими на выход экстрактивных и действующих веществ, явились: соотношение сырья и экстрагента, продолжительность одной мацерации, число мацераций и температура настаивания. Для поиска оптимальных значений переменных факторов использовали симплексный метод математического планирования эксперимента.

Исходя из теоретических основ экстракции в равновесных условиях [6] ввели следующие ограничения на уровни переменных факторов: соотношение сырья и экстрагента (х^ от 1 : 5 до 1 : 15; время одной мацерации (х2) от 15 до 45 мин; число мацераций (х3) от 2 до 4; температура (х4) от 20 до 100 °С. Параметром оптимизации служило истощение сырья по экстрактивным веществам (табл. 1).

Таблица 1. Уровни переменных факторов экстракционного процесса сбора

Факторы Уровни варьирования Интервал варьирования (с;)

нижний основной (а;) верхний

Соотношение сырья и экстрагента (х^ 1 : 5 1 : 10 1 : 15 5

Продолжительность экстракции (х2), мин 15 30 45 15

Число мацераций (х3) 2 3 4 1

Температура (х4), оС 20 60 100 40

План эксперимента строили с использованием симплексного метода планирования эксперимента. Сущность метода в том, что в случайным образом выбранной части значений факторов ставится минимальное число опытов к+1, при к независимых переменных факторах. Все значения к-факторов, при которых ставится опыт, образуют выпуклую фигуру - симплекс. Для определения вершин симплекса строят симплекс-план. С целью построения симплекс-плана выбирают основной уровень (а!) для каждого фактора (х1) и интервал варьирования (с1). Кодовые значение переменных факторов (х1) (табл. 2) рассчитывают по формулам

1 .

Г = ^2к-{к +1) . (1)

Як = к ■ Гк.

(2)

где г к - радиус вписанной сферы, Як - радиус описанной сферы около правильного симплекса. Переход от кодовых к натуральным значениям факторов осуществляется по формуле

х. = а, + е, - х,

(3)

где а1 - основные уровни варьирования переменных факторов, с1 - интервалы варьирования переменных факторов, х1 -переменные факторы.

Натуральные значения факторов используют для постановки опытов в вершинах исходного симплекса. По результатам опытов путем сравнения находят точку с худшим результатом, которую отбрасывают. Образование нового симплекса заключается в присоединении к оставшимся вершинам предыдущего симплекса новой вершины, симметричной отброшенной в предыдущем симплексе. Значение к-факторов для новой вершины рассчитывают по формуле

X,

к+1

отбр.

V і=1

— X

і .отбр..

(4)

к+1

где ^ X, ^ - сумма всех значений факторов х1; Х^н - новое значение фактора х1; Х1, отбр. - отброшенное зна-

}=1

чение фактора - х1.

Используя данные по значениям переменных факторов, составили рабочую матрицу симплекс-плана (табл. 2). Реализацию рабочей матрицы симплекс-плана проводили по единой схеме. В качестве примера опишем эксперимент для симплекса 80 (вершина 1). 15,00 сбора (точная навеска) помещали в плоскодонную колбу, заливали 117 мл воды очищенной (коэффициент поглощения сбора К=1,8), нагревали до 55 °С и настаивали в течение 23 мин. По истечении срока настаивания сливали свободно стекающее извлечение, а в колбу вновь заливали 90 мл воды очищенной той же температуры и вновь настаивали 23 мин. После слива второй вытяжки проводили третью мацерацию в тех же условиях. Все три слива объединили и присоединили отжим из шрота. Общий объём извлечения составил 240 мл. После фильтрации в извлечении проводили определение содержания экстрактивных веществ, которое составило 24,3%, что по отношению к исходному в сборе (73%) - параметр оптимизации. По аналогичной схеме проведены опыты всех 12 вершин симплекс-плана.

Результаты реализации симплекс-плана представлены в таблице 2. При вращении симплекса в факторном пространстве найдена вершина 10 с переменными факторами х^12, х2 = 35, х3 = 3, х4 = 90, которые лежат в области предполагаемого оптимума.

Для описания эксперимента в области оптимума и составления уравнения поверхности отклика поставили неполный факторный эксперимент типа 24-2. В каждой точке плана проводилось по пять независимых опытов, в таблице 3 приведено среднее арифметическое значение пяти опытов (У экспериментальное).

Расчет переменных факторов для реализации опытов проводили по формуле (3). Реализация первого опыта осуществлялась при следующих значениях переменных факторов: х^12, х2=35, х3=3, х4=90. Содержание экстрактивных веществ (У экспериментальное) при этом составило 89,4%. Все последующие опыты проводили в соответствии с матрицей плана неполного факторного эксперимента (табл. 3) по описанной схеме.

Реализовав матрицу неполного факторного эксперимента и рассчитав коэффициенты уравнения регрессии, получили уравнение экстракционного процесса, которое позволило рассчитать У расчетное в таблице 3.

У = 88,19 -1,8 • х1 +1,42 • х2 + 0,44 • х3 + 2,43 • х4, (5)

где х! - соотношение сырья и экстрагента, х2 - время одной мацерации (мин); х3 - число мацерации (шт.); х4 - температура (°С).

Расчет коэффициентов уравнения проводили по формуле

где п - 8; У1 - значение параметра оптимизации экспериментального; Х1 - значения переменных факторов.

Таблица 2. Рабочая матрица симплекс-плана

Симплекс Вершина симплекса Переменные факторы Параметр оптимизации, у %

Х1 Х2 Х3 Х4

1 6 23 3 55 73,0

2 14 23 3 55 76,9

Во 3 10 44 3 55 76,2

4 10 30 4 55 73,5

5 10 30 3 85 77,9

Б1 (2,3,4,5) 6 16 40 3 70 75,9

Б2 (2,4,5,6) 7 15 18 3 78 77,3

Б3 (2,5,6,7) 8 17 26 2 90 77,8

Б4 (2,5,6,7) 9 11 30 3 55 78,3

^5 (5,6,7,9) 10 12 35 3 90 88,6

Бб (5,7,9,10) 11 12 25 3 100 88,3

Б7 (5,9,10,11) 12 5 40 3 100 88,1

Таблица 3. Матрица плана неполного факторного эксперимента типа 24-2

Показатель Переменные факторы Параметр оптимизации, у %

Х1 Х2 Х3 Х4 У ^ эксперим. V 1 расчетное

Основной уровень (а1) 12 35 3 90

Интервал варьирования (с1) 2 5 1 10

1. - - - + 89,4 90,6

2. - + - - 89,3 88,6

3. + - - - 83,6 82,1

4. + + - + 88,8 89,8

5. - - + + 92,6 91,4

6. - + + - 88,7 88,4

7. + - + - 81,5 83,0

8. + + + + 91,7 90,7

Проверка значимости коэффициентов уравнения (5) по 1-критерию Стьюдента при достоверной вероятности 0,95 позволила отбросить коэффициенты, незначимо отличающиеся от нуля, и привести уравнение (5) к следующему виду:

У = 88,19 -1,8 • х1 +1,42 • х2 + 2,43 • х4, (7)

где У - выход экстрактивных веществ, %; х1 - соотношение сырья и экстрагента; х2 - время одной мацерации (мин); х - температура (°С).

Проверка уравнения (7) по критерию Фишера подтвердила его адекватность результатам эксперимента Рэксп. = 0,562, меньше Ртабл. 0 05 (4дб) = 3,01. Уравнения (5) и (7) дают представление о количественном влиянии каждого фактора на выход экстрактивных веществ в процессе экстракции и показывают возможность управления этим процессом.

С целью экономии экстрагента и времени производства экстракта в ходе дальнейших технологических исследований были конкретизированы условия экстракции и установлен оптимальный режим экстрагирования по методу крутого восхождения по поверхности отклика с использованием линейного уравнения (7). Сущность метода заключается в том, что по небольшому числу опытов, поставленных по определенному плану, можно рассчитать наиболее крутое направление, в котором ставится опыт. Для этого, учитывая основной уровень (а1), интервал варьирования (с1) и коэффициенты регрессии (Ь1), рассчитывают шаг И = с1 Ь1/2, а далее и условия проведенных мысленных опытов (а1 + Ь1), данные представлены в таблице 4.

Из рассчитанных трех мысленных опытов был воспроизведен 1-й при Х1=8, х2=33, х3=3, х4=100, а также второй опыт при х!=6, х2=36, х3=3, х4=100. При реализации первого опыта истощенность сырья составила 95,2%, что в пределах ошибки опыта и близко к теоретическому 100%. Уменьшение соотношения «сырье : экстрагент» ведет к уменьшению выхода экстрактивных веществ, т.е. проведение третьего опыта не имело смысла. Это позволило считать эксперимент завершенным.

Обсуждение результатов

Установлены показатели подлинности и доброкачественности сбора: влажность - 7,19 ± 0,06%; зола общая - 7,62±0,01%; зола, нерастворимая в растворе хлористоводородной кислоты 10% - 0,63 ±0,06%; содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой очищенной - 33,24 ± 0,06%; содержание дубильных веществ в сборе - 8,55 ± 0,06%.

В таблице 5 представлены данные определения влияния экстрагента на выход экстрактивных и дубильных веществ сбора.

Вода очищенная извлекает максимальное количество экстрактивных и дубильных веществ сбора, соответственно - 33,3 и 8,55%.

Исходя из полученных данных и экономической целесообразности установлены следующие оптимальные условия экстракции сбора: экстрагент - вода; метод экстракции - ремацерация; соотношение сырья и экстрагента - 1 : 10; продолжительность экстракции - 30 мин; число мацераций - 3; температура - 100 °С. Технологический выход по экстрактивным веществам составил 95%.

Таблица 4. Крутое восхождение поверхности отклика

Характеристики Х1 Х2 Х4 У%

Основной уровень (а;) 10 30 100

Интервал варьирования (с;) 2 5 10

Коэффициент (Ъ;) -1,8 1,42 2,43

с • Ъ -3,6 7,1 24,3

Расчет шага с;- Ъ;/2 -2 3,55 12,15

Шаг И; -2 3 12

Мысленные опыты 1 8 33 100 95,2

2 6 36 100 94,7

3 4 39 100

Таблица 5. Влияние экстрагента на выход экстрактивных и дубильных веществ из сбора

Экстрагент Экстрактивные вещества, % (п = 5; Р = 95%; 1 р = 2.78) Дубильные вещества, % (п = 5; Р = 95%; 1 р = 2.78)

Вода очищенная 33,24±0,06 8,55±0,06

Этиловый спирт 40% 29,95±0,61 6,97±0,04

Этиловый спирт 70% 28,82±0,63 5,87±0,08

Этиловый спирт 95% 27,66±0,43 3,21±0,04

Получено линейное уравнение экстракционного процесса, дающее представление о количественном влиянии каждого фактора на выход экстрактивных веществ в процессе экстракции сбора.

У = 88,19 -1,8 • х1 +1,42 • х2 + 2,43 • х4,

где У - выход экстрактивных веществ, %; х1 - соотношение сырья и экстрагента; х2 - время одной мацерации (мин); х4 - температура (°С).

Результаты исследований будут использованы в ходе разработки технологии и схемы производства экстракта сбора для лечения заболеваний почек.

Выводы

1. Установлены показатели подлинности и доброкачественности сбора: влажность - 7,19 ± 0,06%; зола общая - 7,62 ± 0,01%; зола, нерастворимая в растворе 10% хлористоводородной кислоты - 0,63 ±0,06%; содержание экстрактивных веществ, извлекаемых очищенной водой - 33,24 ± 0,06%; содержание дубильных веществ в сборе - 8,55 ± 0,06%.

2. Подобран оптимальный экстрагент - вода очищенная, извлекающий максимальное количество экстрактивных и дубильных веществ сбора. Выход экстрактивных веществ - 33,3 ± 0,07%, дубильных -8,55±0,6%.

3. Найдены оптимальные условия процесса экстракции сбора: экстрагент - вода; метод экстракции - ремацерация; соотношение сырья и экстрагента (1 : 10), продолжительность экстракции (30 мин), число мацераций (3), температура (100 °С).

4. Получено линейное уравнение экстракционного процесса, показывающее количественное влияние каждого фактора на выход экстрактивных веществ в процессе экстракции сбора, дающее возможность управлять этим процессом.

Список литературы

1. Федосеева Л.М., Сивова Ю.С. Фитохимический анализ сбора на основе листьев бадана толстолистного // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: матер. III Всерос. научн. конф. Барнаул, 2007. С. 254-259.

2. Бабаева М.В., Федосеева Л.М., Юрова В.А. Изучение антимикробной активности сухих экстрактов №1, 2, 3 для применения в комплексной терапии инфекционных заболеваний почек // Актуальные вопросы инфекционной патологии: юбилейный сборник научных работ, посвященный 50-летию кафедры инфекционных болезней АГМУ. Барнаул, 2009. С. 30-36.

3. Беликов В.Г., Пономарев В.Д., Коковкин-Щербак Н.И. Применение математического планирования эксперимента и обработка результатов эксперимента в фармации. М., 1973. 232 с.

4. Государственная фармакопея СССР: в 2 т. Т. 2.Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. М., 1989. 400 с.

5. Китанов Г. Изучение условий определения дубильных веществ // Фармация. 1997. Т. 37. №2. С. 34-40.

6. Пономарев В. Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М., 1976. 204 с.

Поступило в редакцию 17 марта 2009 г.