CC BY
38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Захарова Ю.В., Леванова Л.А.
Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИНЦИПОВ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ МИКРОФЛОРЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ У ЖИТЕЛЕЙ КЕМЕРОВСКОЙ ОБЛАСТИ
На основании анализа результатов оценки биологических свойств условно-патогенных бактерий научно обоснованы принципы коррекции микрофлоры толстой кишки с учетом факторов персистенции бактерий и степени дисбиотических состояний.
Ключевые слова: персистенция, устойчивость к антибиотикам, коррекция.
Zakharova J.V., Levanova L.A.
Kemerovo State Medical Academy,
Kemerovo
OPTIMIZATION PRINCIPLES OF CORRECTION DYSBACTERIOSIS OF THE LARGE INTESTINE IN CITIZEN OF KEMEROVO REGION
On the basis of analysis of biological properties opportunistic microorganisms principles corrections microflora of the large intestine by persistence bacteria and the degree of dysbacteriosis are scientifically proved.
Key words: persistence, resistance to antibiotics, correction.
При различном характере дисбиотических из- выбор которых осуществляется эмпирически с уче-менений в кишечнике возрастает частота и том сформировавшейся резистентности, обусловлен-интенсивность колонизации слизистой различ- ной тактикой использования антимикробных препа-ными условно-патогенными бактериями [1, 2]. Чаще ратов в лечебно-профилактических учреждениях и всего при микроэкологических нарушениях из со- интенсивностью циркуляции резистентных штаммов держимого кишечника выделяются клебсиеллы, про- в популяции. При этом не учитывается степень дис-теи и золотистые стафилококки. Данные условно- бактериоза, тогда как микроорганизмы при различной патогенные бактерии обладают такими факторами глубине микроэкологических нарушений характери-персистенции, как антилизоцимная, антиинтерферо- зуются разными персистентными характеристиками, новая активность, что ведет к аллергизации организ- биохимической активностью [1-2] и, возможно, об-ма, снижению иммунологической реактивности [3-6]. ладают разной чувствительностью к антимикробным В связи с этим, при коррекции микроэкологических препаратам.
нарушений требуется элиминация условно-патоген- Цель работы — сравнительное изучение активнос-ных энтеробактерий и золотистых стафилококков из ти бактериофагов и антибиотиков in vitro в отноше-содержимого кишечника. нии клебсиелл, протея и золотистого стафилококка,
С этой целью многие авторы предлагают исполь- выделенных при разных степенях дисбиотических зовать либо антибиотики, либо бактериофаги [1, 7], нарушений для оптимизации выбора антимикробных
_____________________________________________ препаратов при коррекции микроэкологических на-
Корреспонденцию адресовать: рушений.
Захарова Юлия Викторовна,
650029, Кемерово, ул. Ворошилова, 22 А,
ГОУ ВПО «Кемеровская государственная МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
медицинская академия»
Тел. раб. 8 (3842) 73-28-71. В работе использованы 100 штаммов клебсиелл,
E-mail: [email protected] 125 штаммов золотистого стафилококка и 50 штам-
Мп т nnnn СууШтна
30 № 2 2009 в Кузбассе
мов протея, изолированных из кишечника людей при различных степенях дисбактериоза. Бактериологическое исследование содержимого толстой кишки проводили в соответствии с общепринятой методикой [8-9]. Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом согласно МУК 4.2. 1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Изучение чувствительности бактерий к бактериофагам проводили качественным методом на плотной питательной среде, с использованием специфических бактериофагов. Определение антилизоцимной и антиинтер-фероновой активности у клебсиелл проводили с помощью метода отсроченного антагонизма в агаре по P.M. Muriana, T.R. Klaehammer (1987) в модификации О.В. Бухарина (1999). Для статистической обработки полученных данных использовали общепринятые методы вариационной статистики [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований установлено, что частота колонизации слизистой толстой кишки золотистыми стафилококками при дисбактериозах достигала 54 %, клебсиеллами — 30 % (р < 0,05), а протеем не превышала 3 % (р > 0,05). Все выделенные клебсиеллы характеризовались наличием ан-тилизоцимной активности (АЛА) и 72 % штаммов обладали антиинтерфероновой активностью (АИА). Средний уровень АЛА, составивший 5-6 мкг/мл, регистрировали у 61 % клебсиелл, высокие значения АЛА (8-9 мкг/мл) — у 26 % штаммов. Из клебси-елл, способных инактивировать бактерицидный компонент интерферона, 26,4 % штаммов обладали средними уровнями АИА (2-3 ед), 5,5 % штаммов — высокой АИА (4-6 ед).
Широкая распространенность факторов персис-тенции у клебсиелл обусловливает высокую частоту колонизации данными бактериями слизистой кишечника детей до 1 года (26,7-60,4 %), с 1 года до 2 лет (26,1 %), а также лиц старше 60 лет (35 %). При этом уровень АЛА и АИА коррелирует со степенью дисбиотических нарушений (г = 0,6). Иными словами, чем выше значения АЛА и АИА, тем тяжелее микроэкологические нарушения. Установлено, что клебсиеллы с низким уровнем АЛА (менее 5 мкг/мл) в 69,2 % случаев выделяются из кишечника при 1 ст. дисбактериоза. При 2 ст. микроэко-логических нарушений основная часть штаммов (41 % и 47,4 %) обладала средними значениями АЛА и АИА. При 3 ст. дисбактериоза 42,3 % клебсиелл обладали высоким уровнем АЛА (8-9 мкг/мл), 50 % — высокой АИА (4-6 ед).
Анализ чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам показал, что наибольшей активностью в отношении клебсиелл, протеев и стафилококков обладали фторированные хинолоны. К офлок-сацину были чувствительны 93 %, 80 % и 100 % штаммов, соответственно, к ципрофлоксацину — 88 %, 71 % и 100 % (р < 0,05). В отношении золотистых стафилококков были эффективны также цефурок-сим и ристомицин (по 100 %). При этом среди протеев только 66,7 % штаммов, а среди клебсиелл только 42,1 % были чувствительны к цефуроксиму.
Клебсиеллы проявляли высокую чувствительность к сизомицину (70,7 %), а протеи — к цефтриаксону (80 %) и гентамицину (83,3 %). Среди золотистых стафилококков 79 % штаммов были чувствительны к гентамицину, 75,8 % — к доксициклину, 72,9 % — к линкомицину. При этом цефтриаксон ингибировал рост и размножение только 21,4 % золотистых стафилококков. Среди клебсиелл сформировалась высокая устойчивость к гентамицину, так как к нему были чувствительны 53,7 % штаммов, а чувствительность протеев к доксициклину не превышала 13 %.
Цефазолин угнетал рост и размножение 49,1 % выделенных штаммов золотистого стафилококка, 48,5 % штаммов клебсиелл и только 36,4 % штаммов протеев (р < 0,05). Левомицитин был наиболее эффективным в отношении клебсиелл (48,7 % штаммов). При этом данный антибиотик проявлял активность только в отношении 22,2 % штаммов протеев и 10 % золотистых стафилококков.
В связи с тем, что полимиксин М является антибиотиком узкого спектра, действующим только на грамотрицательные микроорганизмы, на чувствительность к нему тестировали клебсиеллы и протеи. При этом 61,9 % штаммов клебсиелл были чувствительны к данному антибиотику, а среди протеев — только 20 % (р < 0,05).
Установлена высокая резистентность золотистого стафилококка к ампициллину, так как 93,2 % штаммов были устойчивы к данному препарату. Дополнительно определяли чувствительность золотистых стафилококков к олеандомицину, эритромицину, ок-сациллину, карбенициллину. Наиболее активным из данных препаратов оказался олеандомицин, чувствительность к которому среди золотистых стафилококков составила 48,7 %, к оксациллину выявлено 19,8 % чувствительных штаммов, к карбенициллину — 17,2 %, к эритромицину — 16,7 % (р < 0,05).
Учитывая разную степень выраженности у клеб-сиелл таких биологических свойств как АЛА и АИА в зависимости от степени дисбиотических нарушений, можно предположить, что чувствительность бактерий к антибиотикам также будет не одинакова у
Сведения об авторах:
Захарова Юлия Викторовна, ассистент кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии ГОУ ВПО КемГМА, г. Кемерово, Россия.
Леванова Людмила Александровна, доктор мед. наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии, иммунологии и вирусологии, г. Кемерово, Россия. E-mail: [email protected]
^— м
ОУШщит ..
вКуэбассе N2 2 2009 31
лиц с разной степенью тяжести микроэкологических нарушений. В связи с этим, нами была изучена ан-тибиотикочувствительность микроорганизмов с учетом степени дисбактериоза. Установлено, что при 1 и 2 степенях полученные значения антибиотикочувс-твительности статистически не различались (р > 0,05). Однако при 3 степени дисбактериоза кишечника число чувствительных к тестируемым антибиотикам штаммов снижалось (р < 0,05). Так, среди клебсиелл, выделенных при 1, 2 и 3 степенях дисбиотических нарушений, все штаммы были чувствительны к препаратам фторхинолонового ряда. Среди цефалоспо-ринов наиболее активным оказался цефазолин, который ингибировал рост 66,7 % штаммов клебсиелл при 1 степени дисбактериоза и 60 % — при 2-й. К це-фуроксиму при 1 степени было чувствительно 55,6 % штаммов клебсиелл, при 2-й — 50 %. При 3 степени микроэкологических нарушений чувствительность к цефазолину и цефуроксиму не превышала 36,7 % и 25 %, соответственно. Из аминогликозидов гентами-цин подавлял рост и развитие 56,6 % штаммов клеб-сиелл при 1 и 2 степени и только 30 % при 3 степени. Чувствительными к полимиксину М оказались 63,3 % клебсиелл, выделенных при 1 степени, и 53,3 % — при 2-й. Однако при микроэкологических нарушениях 3 степени тяжести к данному препарату были чувствительны только 16,7 % клебсиелл. К левоми-цетину проявляли чувствительность 50 % и 53,3 % культур клебсиелл при 1 и 2 степенях дисбактериоза, а в случае развития микроэкологических нарушений 3 степени данный показатель не превышал
16,7 %.
Изучение антибиотикограмм выделенных штаммов протея показало, что наибольшей активностью в отношении данных энтеробактерий обладали цип-рофлоксацин и офлоксацин, к которым были чувствительны 100 % штаммов при 1 и 2 степенях дисбактериоза и 86,7 % при 3 степени тяжести. Из це-фалоспоринов только цефтриаксон обладал 100 % ингибирующей активностью в отношении протеев, выделенных из содержимого толстой кишки при 1 степени дисбиотических нарушений. При усугублении микроэкологических нарушений достоверно снижалась частота колонизации слизистой штаммами, чувствительными к данному препарату, составляя при
2 степени 80 %, при 3-й — только 55 %. Такие це-фалоспорины, как цефазолин и цефуроксим, даже при 1 степени дисбактериоза ингибировали рост и размножение не более 66,7 % и 60 % выделенных штаммов протея. При 3 степени чувствительность не превышала 33,3 % и 40 %, соответственно (р < 0,05). К гентамицину было чувствительно 86,7 % штаммов при 1 степени дисбактериоза, а при 3 степени тяжести данный показатель снижался до 65 % (р < 0,05). Левомицетин подавлял рост микроорганизмов рода Proteus, выделенных из фекалий, только при 1 и
2 степени дисбактериоза; чувствительно к нему было только 50 % штаммов при 1 степени и 20 % штаммов при 2 степени микроэкологических нарушений.
Антибиотикочувствительность золотистых стафилококков также зависела от степени микроэкологи-
ческих нарушений (г = 0,57). При 1 степени дисбактериоза 100 % штаммов золотистых стафилококков проявляли чувствительность к сизомицину и ристо-мицину, а гентамицин подавлял рост 91,4 % штаммов. При усугублении степени дисбиотических нарушений достоверно снижалось количество чувствительных к данным антибиотикам штаммов. Так, чувствительность к сизомицину, ристомицину и гентамици-ну при 2 степени составляла 88 %, 92 % и 78 %, при
3 степени — 70 %, 73,3 % и 66,7 %, соответственно. Среди цефалоспоринов наиболее активными оказались цефуроксим и цефалексин. К ним были чувствительны все штаммы золотистого стафилококка при 1 степени дисбактериоза и 92-88 % при средней степени тяжести. При 3 степени микроэкологических нарушений чувствительность к цефуроксиму составила только 86,7 %, а к цефалексину — 63,3 %. Другие цефалоспорины, такие как цефазолин и цефо-таксим, ингибировали рост только 54,2 % и 51,4 % штаммов золотистых стафилококков, изолированных из содержимого толстой кишки при 1 степени дисбактериоза. При усугублении микроэкологических нарушений отмечали рост числа штаммов, устойчивых к данным антибиотикам, так как уже при 3 степени тяжести цефазолин и цефотаксим были активны только в 40 % и 30 % случаев.
Чувствительность золотистых стафилококков к цефтриаксону была самой низкой среди всех изученных цефалоспоринов. При 1 и 2 степени дисбактериоза данный антибиотик подавлял рост и размножение только 25,7 % и 20 % штаммов, а при глубоких нарушениях микроэкологии толстой кишки чувствительность к нему не превышала 10 %. Чувствительность золотистых стафилококков к таким антибиотикам, как доксициклин, линкомицин и рифампицин, при 1 степени составила 88,6 %, 80 % и 71,4 %, соответственно. При 3 степени микроэкологических нарушений отмечали достоверное снижение чувствительности золотистых стафилококков к доксициклину и линкомицину до 50 %, а к рифампицину до 40 % (р < 0,05). Олеандомицин и неомицин даже при 1 степени дисбактериоза ингибировали рост и размножение не более 50 % выделенных штаммов золотистых стафилококков. При 3 степени чувствительность не превышала 30 % к олеандомицину и 10 % к неомицину. К ампициллину практически все штаммы золотистых стафилококков проявляли устойчивость; так, данный антибиотик был эффективен только в отношении 8,5 % и 6 % штаммов, выделенных при 1 и 2 степенях дисбактериоза. Установлена также высокая распространенность метициллинрезис-тентности среди золотистых стафилококков (MRSA), которая определялась тяжестью дисбиотических нарушений. Так, при 1 степени дисбактериоза частота колонизации MRSA составляла 74,2 %, при 2-й — 82 %, при 3 - 90 % (р < 0,05).
Таким образом, с усугублением процессов в микрофлоре кишечника снижается чувствительность условно-патогенных бактерий к антибиотикам.
Параллельно с определением чувствительности к антибиотикам, у данных штаммов клебсиелл, золо-
I
32
№ 2 2009
Ьйдицж
в Кузбассе
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
тистых стафилококков и протеев изучали способность лизироваться специфическими бактериофагами: клебсиеллезным, стафилококковым и протейным. Результаты исследований показали, что стафилококковый бактериофаг лизировал 78,9 % штаммов, тогда как количество штаммов, чувствительных к клебсиел-лезному и протейному бактериофагам, не превышало
37,5 % и 35,7 %, соответственно.
При этом установлено, что чувствительность к специфическим бактериофагам у энтеробактерий была не одинаковой, в зависимости от видовой принадлежности. Так, среди клебсиелл 57 % идентифицированы как Klebsiella oxytoca, а 43 % — как Klebsiella рпеитош-ae. При этом активность клебсиеллезного бактериофага в отношении Klebsiella pneumoniae составила
51,2 %, Klebsiella oxytoca — только 27,3 % (р < 0,05).
Среди микроорганизмов рода Proteus 64,3 % штаммов были идентифицированы как P. mirabilis, а 35,7 % как P. vulgaris. При этом чувствительность к протейному бактериофагу была выше у P. vulgaris (50 % против 33,3 %).
Анализ фагочувствительности с учетом степени дисбиотических нарушений показал, что при усугублении глубины дисбактериоза снижается чувствительность условно-патогенных бактерий к литичес-кому действию бактериофагов. При 1 ст. чувствительность к специфическим бактериофагам среди клеб-сиелл составила 66,7 %, среди микроорганизмов рода Proteus — 70,6 %, среди золотистых стафилококков — 97 %. При 2 ст. дисбактериоза достоверно уменьшалось количество фагочувствительных штаммов клебсиелл (43,3 %), протеев (52,2 %) (р < 0,05), тогда как среди золотистых стафилококков частота колонизации фагочувствительными штаммами практически не менялась (93,8 %). Наименьшее число чувствительных к бактериофагам штаммов условнопатогенных микроорганизмов регистрировалось при
3 ст. микроэкологических нарушений, так как среди клебсиелл и протеев фагочувствительными были только 26,7 %, среди золотистых стафилококков — только 70 %. Таким образом, фагочувствительность, как и чувствительность к антибиотикам, среди условно-патогенных бактерий снижается при усугублении степени дисбиотических нарушений.
ОБСУЖДЕНИЕ
Условно-патогенные микроорганизмы, изолированные из кишечника жителей Кемеровской области, характеризуются наличием АЛА и АИА, уровень экспрессии которых зависит от степени микроэко-логических нарушений. При 1 ст. дисбактериоза большинство штаммов клебсиелл продуцируют антилизо-цимный фактор с уровнем менее 5 мкг/мл, при 2 ст. АЛА составляет 5-6 мкг/мл, при 3 ст. — 8-9 мкг/мл. Средние значения АИА, составившие 2-3 ед, установлены у 47,4 % штаммов, выделенных при 2 ст. дисбактериоза, а высокие значения (4-6 ед) — у 50 % клебсиелл, полученных от лиц с 3 ст. микроэколо-гических нарушений. При этом, в зависимости от
глубины дисбактериоза, меняются не только персистентные характеристики бактерий, но и чувствительность к антимикробным препаратам. Чем больше выражен дисбактериоз, тем выше резистентность бактерий к антибиотикам и бактериофагам.
Установлено, что при 1 и 2 ст. микроэкологичес-ких нарушений в отношении клебсиелл и протеев наиболее активны фторхинолоны и цефалоспорины: цефазолин, цефуроксим. Помимо этого, клебсиеллы проявляют высокую чувствительность к полимикси-ну, а протеи — к гентамицину. Набор антибиотиков, которые можно рекомендовать для элиминации золотистых стафилококков при 1 и 2 ст. дисбактериоза кишечника, достаточно широк: сизомицин, ристоми-цин, гентамицин, цефуроксим, цефотаксим, докси-циклин. При 1 ст. микроэкологических нарушений отмечается высокая чувствительность условно-патогенных бактерий к специфическим бактериофагам. Клебсиеллезный бактериофаг эффективен в отношении
66,7 % штаммов клебсиелл, протейный — в отношении
70,6 % культур протеев, а золотистые стафилококки лизировались стафилококковым бактериофагом в 97 % случаев. При усугублении микроэкологических нарушений до 2 ст. достоверно снижается число чувствительных к специфическим бактериофагам штаммов клебсиелл (до 43,3 %) и протеев (до 52,2 %), тогда как среди стафилококков чувствительными являются 93,8 % культур (р < 0,05). При 3 ст. дисбактериоза кишечника препаратами выбора являются фторированные хинолоны. К остальным антибиотикам среди условно-патогенных бактерий сформировалась высокая резистентность.
Фторированные хинолоны — это антибиотики широкого спектра, обладающие бактерицидным типом действия, ингибирующие репликацию ДНК бактерий. Фторированные хинолоны действуют преимущественно на аэробные грамотрицательные бактерии и малоактивны в отношении анаэробов, которые составляют основную массу микробного сообщества толстой кишки. В связи с этим, данная группа препаратов имеет преимущество перед другими антибактериальными средствами, так как даже при коррекции микроэкологических нарушений 3 ст. позволяет сохранить стабильность индигенной микрофлоры слизистой кишечника. Однако данные антибиотики имеют возрастные ограничения в применении — их можно назначать только с 14-летнего возраста, поскольку хинолоны способны вызывать артропатии, выражающиеся в возникновении везикул и эрозий на хрящевой поверхности суставов. Поэтому при коррекции дисбиотических состояний 3 ст. тяжести у детей младшего возраста и новорожденных препаратами выбора являются цефалоспорины и ами-ногликозиды. Среди стафилококков, изолированных от лиц с 3 ст. микроэкологических нарушений, чувствительность к таким цефалоспоринам, как цефу-роксим, цефалексин была достаточно высокой (86,7-
63,3 %). Среди протеев чувствительность к цефтри-аксону составляла 55 %, к гентамицину — 40 %. Низкая чувствительность к данной группе препаратов была только у клебсиелл (30 %). Необходимо отме-
ОУШщит ..
в Кузбассе № 2 2009 33
тить, что данные группы антибиотиков вызывают существенные нарушения со стороны индигенной микрофлоры, что требует в дальнейшем обязательного восстановления бифидо- и лактофлоры.
Установлено, что при З ст. микроэкологических нарушений энтеробактерии обладают высокой резистентностью к бактериофагам. Среди клебсиелл и протеев чувствительность к клебсиеллезному поливалентному и протейному фагам не превышала, соответственно, 26,7 %. При этом среди золотистых стафилококков 70 % лизировались специфическим бактериофагом.
При коррекции микрооэкологических нарушений бактериофаги можно комбинировать с приемом антибактериальных средств, особенно у лиц с З ст. дисбактериоза. Непременным условием рационального использования бактериофагов является обязательное определение чувствительности к ним выделенных бактерий.
Таким образом, при коррекции дисбиотических состояний рациональным является определение биЛИТЕРАТУРА:
ологических характеристик условно-патогенных бактерий, которые не одинаковы при различной степени тяжести. При усугублении микроэкологических нарушений увеличивается способность бактерий к персистенции, так как нарастают АЛА и АИА, что позволяет прогнозировать длительное течение дисбактериоза. Параллельно у бактерий возрастает способность противостоять воздействию антимикробных препаратов. Особенно высокий уровень экспрессии данных факторов регистрируется при З ст. дисбактериоза. При этом элиминировать бактерии с выраженными персистентными характеристиками, обладающие высокой устойчивостью к антимикробным препаратам, довольно трудно, что потребует назначения нескольких курсов коррекции. Выбор группы препаратов для селективной деконтаминации должен базироваться на результатах определения штаммо-вой чувствительности бактерий к антибиотикам и бактериофагам, с учетом степени микроэкологичес-ких нарушений и персистентных характеристик микроорганизмов.
1. Крамарь, Л.В. Микробная экология кишечника людей, проживающих в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города /Л.В. Крамарь: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - М., 2001. - 45 с.
2. Леванова, Л.А. Микроэкология кишечника жителей Западной Сибири, коррекция дисбиотических состояний /Л.А. Леванова: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - М., 2003. -48 с.
3. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий /О.В. Бухарин. - М: Медицина, 1999. -366 с.
4. Микробиоценоз слизистой оболочки носа при аллергической риносинусопатии /И.А. Игнатова, О.А. Коленчукова, С.В. Смирнова и др. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 1. - С. 62-64.
5. Семенко, Т.А. Иммунодефицитные состояния как фактор риска развития госпитальной инфекции /Т.А. Семенко, В.Г. Акимкин //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2000. - № 5. - С. 14-17.
6. Commensal bacteria do translocate across the intestinal barrier in surgical patients /BS. Reddy, J. MacFie, M. Gatt et al. //Clin. Nutr. - 2007. - Vol. 26(2). - P. 208-215.
7. Acar, J.F. A comparison of side effects of levofloxacin to othe agents concerning the ecological and microbiological effects on normal human flora /J.F. Acar //Chemotheraphy. - 2001. -Vol. 47(4). - P. 15-23.
8. Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника»: приказ МЗ РФ № 231 от 9 июня 2003 г.
9. Эпштейн-Литвак, Р.В. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника: метод. реком. /Р.В. Эпштейн-Литвак, Ф.Л. Вильшанская. - М., 1970. - 46 с.
10. Мерков, А.М. Санитарная статистика /А.М. Мерков, А.Е. Поляков. - Л.: Медицина, 1974. -385 с.
Мп о оппп СУущщша
34 N2 2 2009 в Кузбассе
