CC BY
58
УДК 582.282.237:619
ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ НА ОСНОВЕ ГРИБА-КСИЛОТРОФА TRAMETES PUBESCENS SHUMACH.:FR.)PILAT
В.А. Чхенкели1' 2, Т.В. Глушенкова1, Н.А. Горяева2, Л.Г. Чхенкели3, А.Е. Калинович2
''Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, Российская Федерация, 664005, г. Иркутск, ул. Боткина, 4. c [email protected]
Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, Российская Федерация, 664038, Иркутская обл., п. Молодёжный. 3Иркутский государстве нный медицинский университет, Российская Федерация, 664003, г. Иркутск, ул. Красного Восстания, 1.
В работе показано, что оптимизация режима культивирования гриба-ксилотрофа T. pubescens с внесением в питательную среду микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), соединений цинка и селена, что позволяет сократить время ферментации продуцента с 10 до 4 суток. Оптимальный режим процесса лиофилизации биологически активной субстанции даёт возможность получать лиофилизи-рованную субстанцию с высокой антимикробной и иммуностимулирующей активностью. Перспективность её использования в качестве основы полифункционального препарата показана при изучении биологических свойств субстанции как in vitro на клинических и референтных штаммах бактерий семейства Enterobacteriaceae, так и in vivo при моделировании экспериментального колибактериоза на 7-14 суточных цыплятах кросса Decalb (Голландия). Ил. 1. Табл. 4. Библиогр. 17 назв.
Ключевые слова: грибы-ксилотрофы, оптимизация, ферментация, лиофилизация, антимикробная активность, иммуностимулирующая активность, желудочно-кишечные болезни, колибактериоз.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы внимание исследователей привлекает возможность использования ксилотрофных базидиомицетов в качестве продуцентов БАВ и разработки на их основе экологически чистых безотходных технологий получения эффективных лекарственных препаратов для медицины и ветеринарии, в том числе обладающих антимикробным, иммуностимулирующим действием [13,17]. В ИФ ИЭВСи ДВ Росельхозакадемии был разработан антимикробный препарат Леван-2 на основе гриба-ксилотрофа Т. риЬввсвпв, п олучае-мый с использованием методов биотехнологии, а также способы профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней телят с его применением [7, 10-12,14].
Изучение влияния препарата Леван-2 на фагоцитарную активность нейтрофилов при моделировании экспер иментального колибак-териоза на белых беспородных мышах показало, что препарат, содержащий наряду с высо-
коактивными внеклеточными полисахар идами, синтезируемыми самим продуцентом, структурный модификат целлюлозы - МКЦ - обладает повышенной иммуностимулирующей активностью [14, 15]. Такой препарат является и более эффективным при лечении желудочно-кишечных болезней телят [7]. В исследованиях по определению содержания микроэлементов в кормовых рационах телят молочного периода на МТФ ГУП «Байкало-Сибирское» Россельхозакадемии установлено, что в рационах существует дефицит микроэлементов - цинка, селена и меди, а также избыток токсичных элементов - свинца, ртути и кадмия [11]. По данным же некоторых исследователей, желудочно-кишечные болезни молодняка осложняются токсическим воздействием кадмия, свинца и других элементов [4,16]. Дефицит или избыток микроэлементов в организме животных приводит к сдерживанию их роста, сниже нию продуктивности, плодовитости, вызывает различ-
ные заболевания и падёж. В сложном процессе обмена веществ макро- и микроэлементы находятся в тесной взаимосвязи и взаимодействии между собой и органическими компонентами, что в полной мере относится и к селену, и к цинку [1]. При этом следует также учитывать, что Иркутская область является биогеохимической провинцией именно по этим элементам (селену и цинку), конечно, не считая йода [12]. Таким образом, введение в новый препарат МКЦ будет способствовать снижению негативного влияния на метаболические процессы в организме токсикантов - свинца, ртути и кадмия, а введение цинка и селена позволит повысить его иммуностимулирующую активность.
Цель настоящей работы состояла в оптимизации методов и режимов культивирования продуцента, а также режима лиофилизации получаемой биологически активной субстанции как основы нового полифункционального препарата на основе базидиального гриба-ксилотрофа T. pubescens штамм 0663, обладающего антимикробным и иммуностимулирующим действием.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали культуру Trametes pubescences (Schumach.:Fr.) Pilat. штамм 0663 [14, 16] из коллекции Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. СПб).
При поиске оптимальных условий и режимов культивирования продуцента с целью введения в препарат МКЦ, соединений цинка (сульфата цинка) и селена (селенита натрия) использовали метод математического планирования полнофакторного эксперимента (ПФЭ) [5]. Анализ культуральной жидкости при жидкофазной ферментации продуцента на содержание цинка проводили атомно-абсорбцио-нным методом с использованием атомно-абсорбционного анализатора «Variant» (Австралия), определение содержания селена -флюориметрическим методом с использованием анализатора жидкости «Флюорат-02-3М» (Россия). Проводили также определение содержания и некоторых токсичных элементов: свинца, кадмия - атомно-абсорбционным методом, ртути - методом атомно-абсорбционной спектрометрии с использованием экспресс-анализатора Milestone DMA-80 в соответствии с ГОСТ Р 51309-99, ГОСТ 30692-2000, ГОСТ 30178-96. Лиофильную сушку субстанций проводили на лабораторной установке LZ-9СP (Чехия) во флаконах по 2 мл при априорном условии создания мягких условий лиофилиза-ции для сохранения биологически активных веществ субстанции [2].
Антимикробное действие биологически активных субстанций изучали методом диффузии в агар. В качестве тест-культур использовали референтные штаммы микроорганизмов,
полученные из ГНИИ стандартизации и контроля медицинских препаратов им Л.А. Тара-севича (г. Москва) и клинические штаммы энте-робактерий, выделенные в бак. лаборатории ФГУ «ИМВЛ» из пат. материала. Микробная нагрузка составляла 1-2*107 КОЕ/мл. Для приготовления инокулята использовали 18-20-ти часовые агаровые культуры.
При изучении лечебно-профилактического действия модифицированной субстанции в качестве препарата сравнения использовали про-биотический препарат Интестевит, применяемый для лечения желудочно-кишечных болезней животных. Эксперименты проводили на 7-14-суточных цыплятах кросса Dekalb (Голландия), содержавшихся в условиях вивария ветеринарной клиники ИрГСХА «Айболит» на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и ГОСТ 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Моделирование коли-бактериоза у цыплят осуществляли путём введения 0,5 мл суспензии биомассы (на физиологическом растворе) патогенного штамма E. coli, выделенного из патологического материала птицы в бак. отделе в ФГУ «ИМВЛ», интра-орбитально в дозе 1 млрд. микробных тел. Для оценки действия препаратов проводили клинические и гематологические исследования с использованием автоматического гематологического анализатора Mek-64109 («Nihoncodon», Япония). Лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) определяли с использованием культуры Micrococcus lyzodeicticus по П.Н. Смирнову с соавт. (1981). Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) определяли по методике С.И. Плященко и В.Т. Сидорова [9].
Математическую обработку результатов экспериментов и оценка достоверности проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 97.
Данные, полученные при экспериментальном моделировании колибактериоза, обработаны с помощью статистической программы Statistica 99 (StatSoft, США). Проверка гипотезы о различии выборок проводилась непараметрическими методами (по U-критерию Манна-Уитни). Различия считали достоверными при p < 0,05. Результаты представлены в виде медианы значений и межквартильного интервала (Ме [25%; 75%]).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Отношение высших базидиальных грибов к различным микроэлементам является одним из наименее изученных аспектов физиологии
питания высших грибов. В литературе имеются лишь единичные работы по изучению влияния микроэлементов (цинка, селена) на культу-рально-морфологические особенности бази-диомицетов, а тем более на биосинтез биологически активных соединений [3, 9]. При оптимизации процесса культивирования гриба-продуцента с использованием МКЦ, соединений селена и цинка прежде всего исходили из потребности организма телят в этих микроэлементах, основываясь на имеющихся разработках по данному вопросу, а также на априорной информации о влиянии этих микроэлементов на рост и развитие базидиальных грибов при жидкофазном культивировании.
При внесении соединений селена и цинка в среду для культивирования гриба-продуцента исходили из существующих суточных норм потребления микроэлементов для молодняка крупного рогатого скота при выращивании и откорме [6]. Основывались также на полученных нами ранее данных по содержание микроэлементов в суточном кормовом рационе телят на молочно-товарной ферме ГУП «Байкало-Сибирское» Россельхозакадемии [12].
Селен вносили в питательную среду для жидкофазного культивирования гриба-продуцента в виде водного раствора селенита натрия, цинк - в виде сульфата цинка. Культивирование продуцента проводили в колбах Эрленмейера в термостатируемом шейкере-инкубаторе ТБ-20 (Латвия) при температуре 28 оС и 220 об/мин. Установлено, что при данном режиме культивирования рост и развитие гриба идёт нормально, при этом процесс ферментации сокращается с 10 до 4 сут. Содержание цинка и селена в исходной (контроль) и модифицированной биологически активной субстанции (опыт), а также некоторых токсичных элементов представлено в табл. 1. Полученные данные, а также проведённые расчёты свидетельствуют о том, что при использовании модифицированной субстанции в качестве основы лечебно-профилактического препарата телята будут получать суточную норму микроэлементов - цинка и селена.
Производство биофармацевтических препаратов практически всегда ограничено их физической или/и химической стабильностью. А
в отношении как активных фармацевтических субстанции (АФС), так и готовых лекарственных форм (ГЛФ) стабильность приобретает решающее значение. Зачастую увеличить стабильность препаратов можно, только превратив их в твёрдую форму с помощью лиофили-зации. Этот процесс позволяет сократить содержание влаги в образце до 3%, иногда и ещё ниже [9]. Однако лиофилизация, по существу являющаяся совокупностью процессов замораживания и сушки, может оказать очень негативное влияние (и даже пагубное) на биологическую активность препарата. В некоторых случаях даже безукоризненно выполненная лиофилизация не может быть гарантом сохранения активности препарата.
Лиофилизацию биологически активных субстанций (контрольной и опытной) проводили в 2 этапа:
1. Замораживание. Биологически активные субстанции разливали по 2 мл в пенициллиновые флаконы, которые устанавливали в дюралюминиевую кассету. Далее кассету устанавливали на предварительно охлаждённую до -40 оС полку. Замораживание проводили в течение 3 ч. Температура полки к концу 1-го ч от начала замораживания составляла -60 оС, температура субстанции составляла -55 оС.
2. Высушивание. Вакуумирование начинали при следующих параметрах: температуре полки -65 оС, температуре субстанции -55 оС, температуре десублиматора -80 оС. В течение первых 2-х ч от начала высушивания температуру полки повышали до 0 оС, каждый последующий час температуру полки повышали на 5 оС. По достижении температуры полки до 25 оС сушку проводили при заданной температуре до 20-го часа от начала высушивания. Досушивание вели при температуре полки 30 оС. При заданных значениях подогрева температура препарата прошла 0 оС между 16-м и 17-м часом от начала высушивания. Общая продолжительность высушивания составляла 25 ч, температура субстанций изменялась от -55 оС до 28 оС, температура десублиматора составляла -(83 + 3) оС, вакуум 13-6 Па (0,1-0,05 мм рт.ст.).
Различные препаративные формы (жидкая и лиофилизированная) субстанций, получаемых при жидкофазной ферментации гриба-
Таблица 1
Содержание некоторых микроэлементов в модифицированной биологически активной субстанции_
Микроэлемент Содержание, мг/кг
Контроль Опыт
Цинк 2,55 + 0,36 237,5 + 3, 2
Селен 0,14 + 0,05 0, 75 + 0,08
Медь 0,15 + 0,07 0,23 + 0,03
Свинец 0,109 + 0,002 0,068 + 0,004
Ртуть 0,0007 + 0,00005 0,0004 + 0,00007
Кадмий 0,007 + 0,0003 0,004 + 0,0002
Мышьяк 0,0001 + 0,00004 0,001 + 0,0003
продуцента, представлены на рис. 1. Для определения антимикробной активности исходной (контрольной) и модифицированной (опытной) субстанций, а также их лиофилизированных форм были использованы патогенные штаммы микроорганизмов, выделенные из патологического материала в ФГУ «ИМВЛ» и идентифицированные в лаборатории биотехнологии и болезней молодняка ИФ ИЭВСиДВ, а также референтные штаммы микроорганизмов. Установлено, что все субстанции обладают антимикробной активностью, но в различной степени, о чём свидетельствуют данные табл. 2. При этом активность модифицированной лиофили-зированной субстанции в отношении бактерий родов Escherichia и Salmonella сохраняется на уровне исходной активности.
При экспериментальном моделировании колибактериоза для изучения биологических
свойств лиофилизированной модифицированной субстанции нами было сформировано 8 групп по 10 цыплят: 1-я группа - контроль; 2-я группа - контроль (с заражением); 3-я группа -животных заражали и на 4-й день модифицированную субстанцию os в дозе 1 мл/ кг живой массы, 5 дней 1 раз в сутки; 4-я группа - цыплят заражали и на 4-й день вводили препарат Интестевит per os в дозе 0,01 г на голову; 5-я группа - цыплят заражали, на 4-й день давали утром модифицированную субстанцию в дозе 1 мл/кг живой массы Интестевит per os в дозе 0,005 г (в водном растворе) на голову в течение 5 дней; 6-я группа - модифицированную субстанцию вводили per os в дозе 2 мл/кг живой массы, на 3-й день цыплят заражали, далее продолжали вводить модифицированную субстанцию per os в дозе 2 мл/кг живой массы; 7-я группа - вводили препарат Интестевит per
Рис. 1. Культивирование гриба-продуцента Т. риЬевсепв методом жидкофазной ферментации и различные препаративные формы биологически активной субстанции
Таблица 2
Антимикробная активность исходной и модифицированной биологически активной
субстанций и их лиофилизированных форм_
Тест-культуры Диаметр зон подавления роста тест-культуры (в мм)
Исходная субстанция Модифицированная субстанция Исходная субстанция (лиофилизированная форма) Модифицированная субстанция (лиофилизированная форма)
E. coli ТИ 26,5 + 0,5 22,5 + 0,7 28,5 + 0,5 28,0 + 0,3
E. coli О4 10,5 + 0,3 11,5 + 0,5 12,0 + 0,1 12,0 + 0,5
S. ente ritidis 28,0 + 0,5 27,5 + 0,4 33,0 + 0,3 27,5 + 0,6
S. ngor 32,5 + 0,2 28,5 + 0,2 29,5 + 0,4 25,5 + 0,7
E.coli 139-1 34,0 + 0,4 32,0 + 0,3 35,0 + 0,4 30,0 + 0,5
E. coli АТСС 5264 12,0 + 0,3 16,0 + 0,4 25,0 + 0,7 21,0 + 0,4
E.coli АТСС 35218 16,0 + 0,6 24,0 + 0,5 24,0 + 0,2 20,0 + 0,3
E.coli АТСС 1176 15,0 + 0,3 17,0 + 0,3 16,0 + 0,5 16,0 + 0,4
Enterococcus faecalis 20,0 + 0,2 16,0 + 0,2 21,0 + 0,3 17,0 + 0,5
os в дозе 0,01 г на голову, на 3-й день цыплят заражали, далее продолжали вводить препарат Интестевит per os в дозе 0,005 г на голову; 8-я группа - на 3 день цыплят заражали, утром вводили модифицированную субстанцию в дозе 2 мл/кг per os, вечером - препарат Интестевит в дозе 0,005 г/голову.
У заражённых цыплят наблюдали повышение температуры тела на 1,5-2,0 оС с резким прогрессирующим угнетением с признаками интоксикации. Затем наступало расстройство желудочно-кишечного тракта, и птица быстро гибла. У павших цыплят отмечали вздутие кишечника, а после удаления кожи на трупах отмечали воспаление в области пуповины и кровенаполнение сосудов, уходящих в желточный мешок. Через сутки после последнего введения изучаемых препаратов производили убой цыплят, осуществляли забор крови, проводили гематологические исследования и иммунологические исследования. Результаты гематологических исследований представлены в табл. 3, иммунологических в табл. 4. Установлено, что в контрольной группе (группа 2) падёж цыплят
составил 80%, при использовании модифицированной субстанции для лечения (группа 3) и профилактики (группа 6), а также при использовании модифицированной субстанции и препарата Интестевит для профилактики (группа 8), препарата Интестевит для профилактики (группа 7) сохранность поголовья составила 100%, при лечении препаратом Интестевит (группа 4) падёж составил 20%.
По окончании эксперимента в опытной группе, в которой применяли Интестевит, у четырёх из 10 цыплят была отмечена стойкая диарея. У цыплят, получавших лиофилизиро-ванную модифицированную субстанцию, не наблюдали клинических признаков колибакте-риоза. При этом отмечали, что общее состояние цыплят улучшалось, клинических признаков колибактериоза не выявлялось, отмечали также повышение количества эритроцитов, содержания гемоглобина в крови. Профилактика модифицированной субстанцией и про-биотическим препаратом Интестевит (группа 8) является, на наш взгляд, достаточно эффективной.
Таблица 3
Гематологические показатели при экспериментальном колибактериозе цыплят
№ Показатели
группы WBC, 109 LYM,% MON,% GRA,% RBC, 1012 HGB, г/л PLT, 109 HCT
1 30,6 97,6 1,7 1,2 0,62 28 39 0,106
[15,5; 98,2] [91,8; 98,7] [0,9;7,0] [0,4; 1,8] [0,45;1,44] [16; 68] [6; 113] [0,066; 0,217]
2 64,3 95,9 3,1 0,9 0,68 37 19 0,184
[22,1; 98,2] [86,8; 98,7] [0,7;10,8] [0,4; 2,4] [0,45;1,52] [18;62] [11 ;51 ] [0,079; 0,277]
3 45,2 96,0 2,9 0,8 1,03 49 45 0,120
[19,7; 84,3] [92,8; 98,4] [0,9; 5,0] [0,4; 4,6] [0,55;1,79] [26; 89] [10;69] [0,067; 0,232]
4 50,1 96,7 2,3 0,7 1,06 46 58 0,167
[42,9; 92,9] [92,7; 98,5] [1,1;6,4] [0,4; 1,3] [0,73;1,70] [33;72] [18;96] [0,111; 0,249]
5 45,2 98,4 1,3 0,3 1,04 48 31 0,156
[17,2; 76,7] [95,5; 99,0] [0,8;3,6] [0,2; 0,9] [0,48;1,34] [26;59] [10;46] [0,073; 0,203]
6 39,6 98,7 1,0 0,3 0,72 42 11 0,128
[12,5; 71,7] [95,8; 99,3] [0,5;3,5] [0,2; 2,0] [0,37;1,45] [17;63] [8;93] [0,105; 0,223]
7 43,8 97,8 1,8 0,5 0,80 38 26 0,122
[20,3; 57,8] [97,0; 99,1] [0,4; 2,2] [0,3; 0,8] [0,25;1,03] [8;49] [18;30] [0,039; 0,154]
8 46,6 97,2 1,2 0,4 0,83 37 24 0,175
[3,9; 66,5] [96,6; 99,0] [0,5;3,0] [0,2; 0,7] [0,30;1,30] [8;60] [7; 41] [0,062; 0,203]
Примечание: WBC - лейкоциты, клеток/л; RBC - эритроциты, клеток/л; HGB - концентрация гемоглобина; HCT - гематокрит; PLT - тромбоциты, клеток/л; дифференцировка лейкоцитов: Lym,% - лимфоциты; Mon, % - моноциты и некоторые эозинофилы; Gra, % - нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.
Таблица 4
Некоторые иммунологические показатели при экспериментальном колибактериозе цыплят
№ группы Показатели
ЛАСК,% БАСК, %
1 25,27 [23,45 26,67] 50,83 [49,47; 51,87]
2 24,96 [24,06 25,98] 49,82 [48,76; 50,05]
3 32,84 [31,07 33,09] 56,30 [55,78; 57,86 ]
4 30,65 [28,06 32,54] 53,26 [52,45 54,67]
5 33,65 [31.87 34,65] 59,98 [58,87 60.34]
6 36,74 [34,76 37,82] 58,24 [57,25 59,43]
7 34,35 [33,54 35,24] 54,76 [53,38 55,79]
8 36,64 [35,87 37,53] 58,75 [57,86 59,87]
ВЫВОДЫ
Инфекционные желудочно-кишечные болезни молодняка имеют повсеместное распространение в хозяйствах Иркутской области, что свидетельствует о необходимости совершенствования системы мер, включающей в себя комплекс зоотехнических, гигиенических, вете-ринарно-санитарных и административных мероприятий с введением в неё использование новых лечебно-профилактических комплексных препаратов. С этой целью может быть предложен полифункциональный препарат на основе модифицированной биологически активной субстанции, получаемой при жидко-фазной ферментации гриба-ксилотрофа Г pu-bescens. Установлено, что внесение в питательную среду соединений селена, цинка и
МКЦ оказывает стимулирующее действие на рост и развитие гриба-продуцента, позволяет сократить процесс ферментации с 10 до 4 сут. Модифицированная субстанция позволит вводить в организм телят суточную норму необходимых микроэлементов (цинка и селена), устранит негативное воздействие токсичных элементов - кадмия, свинца, ртути. При изучении биологических свойств лиофилизированной модифицированной субстанции как in vitro на клинических и референтных штаммах бактерий семейства Enterobacteriaceae, так и in vivo, при моделировании экспериментального колибак-териоза цыплятах кросса Decalb (Голландия), показано, что её уникальные свойства (высокая антимикробная и иммуностимулирующая активность) сохраняются.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Блиннохватов А.Ф., Иванов А.И., Рязанов А.П. Воздействие ионов мышьяка и селена на мицели-альные культуры и адсорбция мышьяка плодовыми телами агарикоидных базидиомицетов // Мат. между-нар конф. «Физиология и биохимия культивируемых грибов», 6-8 июня 2002, Саратов, 2002. С. 22-23.
2. Гусаров А.Д. Лиофилизация биофармацевтических белков (литературный обзор // Биофарм. журн. 2010. Т.5. № 2. С. 3-5.
3. Денисова Г.В. Влияние неорганических соединений селена на рост и развитие базидиальных мак-ромицетов : Дисс. канд. биол. наук. М., 1999. 130 с.
4. Кашин А.С., Черных М. Н., Заздравных М. И. Закономерности развития и система профилактики эшерихиозов телят в современных экологических условиях Сибири // Мат. Междунар. научн. конф. «Современные проблемы эпизоотологии», Новосибирск. 2004. С. 107-110.
5. Клиническое руководство по лабораторным тестам / Под ред. Н.У.Тица. М. : Юнипресс, 2003. 942 с.
6. Макарцев Н.Г. Кормление сельскохозяйственных животных. Калуга : ГУП «Облиздат», 1999. 646 с.
7. Патент № 2429871, Роосийская Федерация. Препарат для лечения желудочно-кишечных болезней телят и способ его применения / В.А. Чхенкели, Н.В. Белова, Н.А. Шкиль, Г.Д. Чхенкели // Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 21.09.2011.
8. Полубояринов П.А. Влияние селеноорга-нических препаратов на формирование урожая ве-шенки устричной : Pleurotus ostreatus (Fr.:Kumm.): Дисс. канд.с/х наук. Пенза, 2006. 109 с.
9. Садовников Н.Д., Придыбайло Н.Д., Верещак Н.А. Общие и специальные методы исследования крови птиц промышленных кроссов. Екатеринбург-СПб : Ур ГСХА, НПП «АВИВАК», 2009. 85 с.
10. Чхенкели В.А. Биологически активные вещества Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. и их использование : монография. Новосибирск: РАСХН, СО РАСХН ИФ ИЭВСиДВ, 2006. 287 с.
11. Лечебно-профилактическая эффективность препарата Леван-2 на основе продуктов глубинного культивирования базидиомицета Trametes pubescens (Schumach.:Fr.) Pilat. при колибактериозе телят / Чхенкели В.А. [и др.] // Вестн. ИрГСХА. 2011. Т. 43. С. 118-125.
12. Чхенкели В.А., Мартынова А.Ю. Лечебно-профилактическая эффективность препарата Леван-2 при желудочно-кишечных заболеваниях телят // Мат. Х Сиб. вет. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Новосибирск, 17-18 февраля 2011 г. С. 105.
13. Чхенкели В.А., Мартынова А.Ю., Чхенкели Л.Г. и др. Некоторые аспекты изучения антимикробной активности грибов-ксилотрофов рода Tra-metes // Сибирский медицинский журнал. № 2. 2011. С. 82-86.
14. Чхенкели В.А., Мартынова А.Ю., Шкиль Н.А. Профилактическая эффективность препарата Леван-2 при желудочно-кишечных болезнях телят // Сиб. вестн. с/х науки. 2011. № 5-6. С. 96-101.
15. Чхенкели В.А., Тихонов В.Л., Шкиль Н.А. Система мероприятий по лечению и профилактике желудочно-кишечных заболеваний в Иркутской области: методические рекомендации. Иркутск, 2010. 63 с.
16. Иммунный статус телят при диарейном синдроме инфекционной этиологии (E.coli) / Шахов А.Г. [и др.] // Вет. патолог. № 1. 2010. С. 35-39.
17. Chkhenkeli V.A. Some aspects of study and use of biologically active substances of wood-rotting mushroom Trametes pubescens (Shumach.)Pilat // Mat. оf XV Congress of Europen Mycologists, St. Petersburg, 2007. Р. 185-186.
