CC BY
34
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО БЕЛКА KU
В ESCHERICHIA COLI
Шадрина Ольга Алексеевна
аспирант факультета биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, 119234, РФ, г. Москва, ул. Ленинские горы, 1, стр. 73 E-mail: oashadrina92@gmail. com
Княжанская Екатерина Сергеевна
канд. биол. наук, с.н.с. химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, РФ, г. Москва, ул. Ленинские горы, 1, стр. 3
E-mail: knyajka@mail. ru
Королев Сергей Павлович
канд. хим. наук, с.н.с. химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, РФ, г. Москва, ул. Ленинские горы, 1, стр. 3
E-mail: spkorolev@mail. ru
THE OPTIMIZATION OF THE PRODUCTION OF HUMAN PROTEIN KU IN ESCHERICHIA COLI
Olga Shadrina
postgraduate student, Faculty of Bioengineering and Bioinformatics,
Lomonosov Moscow State University, 119234, Russia, Moscow, Leninskie gory St., 1,73
Ekaterina Knyazhanskaya
candidate of Biological Sciences, Senior Research Scientist, Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, 119991, Russia, Moscow, Leninskie gory St., 1,3
Sergei Korolev
candidate of Chemical Sciences, Senior Research Scientist, Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, 119991, Russia, Moscow, Leninskie gory St., 1,3
АННОТАЦИЯ
Человеческий белок Ku - один из главных компонентов системы репарации двуцепочечных разрывов ДНК путем негомологичного объединения концов (NHEJ). Он является ДНК-связывающим белком, который неспецифично взаимодействует с концами двуцепочечной ДНК. Функции Ku не ограничиваются участием в NHEJ, показана его роль и в других клеточных процессах: транскрипции, поддержании теломер, У(Б^-рекомбинации. Для изучения многочисленных функций Ku в системах in vitro обычно используется препарат белка, очищенного из эукариотических клеток. Такое получение достаточно дорого и обеспечивает низкий выход целевого белка. Нами был налажен процесс получения Ku в прокариотической системе, методика которого представлена в данной работе.
Aunî1
Лгу\ ХИМ
7universum.com
UNIVERSUM:
ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
ABSTRACT
Human protein Ku is a one of the main components of the DNA double-strand break repair by non-homologous end-joining mechanism (NHEJ). It is a DNA-binding protein that non-specifically interacts with double-strand DNA ends. Ku functions are not limited to participation in the NHEJ as its role was shown in other cellular processes i.e. transcription, telomere maintenance, V (D) J-recombination. For in vitro studies of numerous Ku functions a protein purified from eukaryotic cells is typically used. This technique is expensive and provides a low yield of target protein. In this paper we present a simple method for Ku expression in prokaryotic system and purification.
Ключевые слова: гетеродимер Ku, рекомбинантный белок, прокариотическая экспрессия, бицистронная система экспрессии.
Keywords: heterodimer Ku, recombinant protein, prokaryotic expression, bicistronic expression system.
Введение
Белок Ku является ДНК-связывающим белком. Ku преимущественно связывается сиквенс-неспецифично со свободными концами двуцепочечной ДНК, что определяет его основные биологические функции в эукариотических клетках. В комплексе с каталитической субъединицей DNA-PKcs он формирует ДНК-зависимую протеинкиназу DNA-PK. В ее составе Ku отвечает за связывание с ДНК, которое активирует фосфорилирование белковых субстратов DNA-PK [4, p. 3460; 2, p. 17]. DNA-PK играет ключевую роль в клеточном ответе на появление двуцепо-чечных разрывов ДНК, которые способствуют генным транслокациям, но мешают нормальной репликации ДНК и вызывают апоптоз. Их репарация в основном происходит двумя способами: через гомологичную рекомбинацию или путем негомологичного объединения концов (NHEJ). Участие Ku в NHEJ является наиболее известной и изученной его биологической функцией. Ku связывает концы двуцепочеч-ных разрывов в ДНК, что необходимо как для защиты концов от действия экзонуклеаз, так и для привлечения остальных компонентов комплекса репарации NHEJ [1, c. 568]. Также Ku участвует в различных других клеточных процессах, таких как V(D)J-рекомбинация, перестановка мобильных элементов генома, поддержание теломер, апоптоз, транскрипция [2, p. 20-23].
Белок Ku является гетеродимером и состоит из двух субъединиц массой примерно 70 кДа и 80 кДа, известных как Ku70 и Ku80. В клетках белковые субъединицы Ku70 и Ku80 находятся в виде очень прочного комплекса, который необходим для нормального функционирования белка. Гетеродимериза-ция Ku сильно стабилизирует обе субъединицы, препятствуя их деградации [5, p. 6881].
В связи с участием Ku во многих процессах для изучения его свойств и функций in vitro требуется препарат очищенного белка. Обычно его получают из ядерных экстрактов клеток млекопитающих. Это требует несколько стадий хроматографических очисток, после которых выход белка оказывается низким, кроме того такое получение дорогостоящее. Очистка рекомбинантного His-6-меченного белка, продуцированного в клетках насекомых в бакулови-русной системе, позволяет получать белок с большим выходом, но требует конструирования бакмид, что заметно удлиняет процесс. В этой связи мы наладили
процесс получения рекомбинантного белка Ku в про-кариотической системе, позволяющий получать 0,20,4 мг белка из 1 л первоначальной культуры E. coli.
Результаты
Как отмечено выше, гетеродимер Ku состоит из субъединиц Ku70 и Ku80. Первоначально для получения гетеродимерного белка мы использовали подход, при котором выделяются отдельные субъединицы белка, а затем формируется гетеродимер. Однако такой путь не привел к успеху. Используя штамм E .coli BL21-CodonPlus, содержащий в геноме дополнительные копии генов тРНК к редким в E.coli кодонам, нам удалось наработать субъединицу Ku70, содержащую GST-метку на N-конце. Получить белок Ku80 не удалось по ряду причин: низкий уровень экспрессии, нерастворимость белка, значительный про-теолиз.
С целью повышения растворимости белка Ku80 и уменьшения деградации Ku80 и Ku70, мы решили получать оба белка с одной плазмиды, с тем, чтобы они формировали гетеродимер непосредственно в клетке. Для этого сначала использовали вектор pETDuet-1, позволяющий ко-экспрессировать два гена с двух T7 промоторов. При этом первый белок (в нашем случае это Ku70) должен содержать 6xHis-метку на N-конце для очистки гетеродимера методом аффинной хроматографии на Ni-активированной ага-розе. Тем не менее, ко-экспрессия генов двух белков не помогла избежать их протеолитической деградации и повысить растворимость, что особенно заметно в случае Ku80. Кроме того, нам не удалось добиться стабильной посадки на Ni-активированную смолу белка Ku70, а значит и всего гетеродимера (Рисунок 1).
Рисунок 1. Связывание гетеродимера Ku, экспрессированного с pET-Duet-1, с Ni-NTA-смолой
Вестерн-блот анализ с антителами на 6xHis-Ku70 (a-His) и Ки80 (а-Ки80). М - дорожка с маркерами масс (кДа). Дорожки, обозначенные ИПТГ - содержат клеточный лизат после индукции транскрипции гена продуцируемого белка; осадок - осадок после центрифугирования клеток, разрушенных ультразвуком; проскок - белки, не связавшиеся со смолой; Ni-NTA-смола - смола со связавшимися после инкубации белками.
Есть только одна работа, в которой авторы получали рекомбинантный гетеродимер в бактериях и столкнулись с теми же проблемами, что и мы [3, p. 142]. Тем не менее, им удалось выделить гете-родимер Ки70/Ки80, используя бицистронную систему экспрессии, где кодирующие последовательности обеих субъединиц располагаются в одной мРНК в виде двух цистронов с внутренним сайтом посадки рибосом.
Мы сконструировали вектор для ко-экспрессии белков ^70 и ^80 с одной мРНК, аналогичный примененному в работе [3, p. 142]. В полученный ранее в нашей лаборатории вектор прокариотической экспрессии белка ^70 с 6xHis-меткой на Оконце (на базе вектора прокариотической экспрессии pET-15Ь) было проведено клонирование гена ^80 так,
чтобы в результате транскрипции получалась бици-стронная мРНК с внутренним сайтом посадки рибосом. При этом между двумя цистронами, кодирующими Ки70 и Ки80, находился линкер, содержащий последовательности Шайна-Дальгарно и А/и-бога-тую последовательность. Однако с такой конструкции нам не удалось получить экспрессию гена белка ^80, стоящим вторым.
Была проведена оптимизация полученного вектора так, чтобы экспрессия белка, ген которого стоит вторым в бицистронной конструкции, была сравнима с экспрессией белка с первого цистрона (Рисунок 2). В отличие от описанной в работе [3, p. 142] конструкции, наш новый вектор содержал последовательность Шайна-Дальгарно и А/и-богатую последовательность, расположенные внутри З'-конца первого цистрона (гена Ки70). При этом рамки считывания первого и второго цистрона перекрывались на 1 нук-леотид: старт-кодон Ки80 начинался внутри стоп-ко-дона Ки70 (последовательность TAATG). Такое взаимное расположение цистронов, последовательности Шайна-Дальгарно и A/U-богатой последовательности, согласно работе [6, p. 484], способствует повышению эффективности трансляции второго ци-строна, и мы рассчитывали, что это позволит увеличить выход плохо экспрессирующегося белка Ки80.
Рисунок 2. Схема строения части вектораpET15b-bicis-Ku, кодирующей белки Ки70 и Ки80.
С одного T7 промотора (стрелка) транскрибируется бицистронная мРНК, содержащая две перекрывающихся рамки считывания: указаны начало и конец каждой рамки (start, stop).
После оптимизаций условий экспрессии и выделения белка, описанных в [3, p. 141] нам удалось получить гетеродимер Ku70/Ku80. Факт получения именно этого белка был подтвержден методами масс-спектрометрии и Вестерн-блот анализа с использованием антител к каждой из субъединиц (Рисунок 3).
А
:::
Рисунок 3. Анализ полученного препарата белка Ku. А.
ДСН-полиакриламидный гель, окрашенный Ку-масси. Препарат белка Ku с продуктами его протео-лиза. Б. Вестерн-блот анализ препарата Ku с антителами на 6xHis-меченный Ku70 (a-His-Ku70) и на Ku80 (a-Ku80). М - дорожка с маркерами подвижности белков с массой в кДа.
Низкий выход белка (0,2-0,4 мг/л культуры E. coli), возможно, связан с большим размером суъеди-ниц и наличием в их составе протяженных неструктурированных участков. Все это затрудняет формирование правильной укладки в прокариотичской системе, из-за чего значительная часть белка оказывается в нерастворимом виде. Кроме того, Ku80 подвергается значительной протеолитичексой деградации. От большей части продуктов протеолиза нам удалось освободиться во время очистки, однако полученный препарат белка содержит не только полноразмерный полипептид, но и некоторое количество продуктов деградации, особенно заметное для субъединицы Ku80. Тем не менее, выделенный нами гетеродимер обладает ДНК- и РНК-связывающей активностью сравнимой с литературными данными.
Методика получения белка Ku
Клетки-продуценты BL21(DE3)Codon Plus трансформировали описанным выше вектором про-кариотической экспрессии гетеродимера Ku, сконструированного на базе коммерчески-доступного вектора pET15b. Растили ночную культуру в среде
LB до OD600 ~0.9 ое при 37°С. Объем «ночной» культуры составлял 10% от общего объема при выделении. После получения ночника основной объем культуры (4 л) растили в среде 2YT с Amp (100 мкг/мл) и 1% глицерином при хорошем покачивании при 37°С до OD600 ~0.8-0.9 ое. После этого культуру охлаждали до 18°С во льду и индуцировали экспрессию целевого белка добавлением 0.1 мМ IPTG (или 20 г/л лактозы). Наработка белка происходила в течение 2024 ч при 18°С, через 12-15 ч после индукции клетки подкармливали лактозой (5 г/л). Биомассу осаждали центрифугированием (15мин 5000g), ресуспендиро-вали клеточную массу в лизисном буфере L (50 мМ TrisHCl pH 8.0, 2 мМ Р-меркаптоэтанол, 1 M NaCl, 5% глицерин, 1 мМ PMSF, 0.4 M NH4OAc, 5 мМ ими-дазол, 1 г/л лизоцим) из расчета 1 г культуры на 20 мл буфера. Клетки лизировались 3 циклами заморозки в жидком азоте и оттаивании в ледяной воде с последующей обработкой ультразвуком. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 4°С, 30 мин, 14000g. Метал-аффинную хроматографию лизата на Ni-активированной сефарозе производили бач-методом. К лизату добавляли 1 мМ PMSF и Ni-активированную сефарозу, уравновешенную в буфере для промывания W1 (50 мМ TrisHCl pH 8.0,
2 мМ Р-меркаптоэтанол, 1 M NaCl, 5% глицерин, 1 мМ PMSF, 5 мМ имидазол), качали ночь при 4°С. После связывания смолу осаждали центрифугированием и наносили в колонку. Сорбент промывали дважды 10-кратным объемом колонки буферами W1 и W2(50 мМ TrisHCl pH 8.0, 2 мМ Р-меркаптоэтанол, 50 мМ M NaCl, 5% глицерин, 1 мМ pmsf, 5 мМ имидазол). Элюцию проводили в буфере W2 с добавлением 0.5 M имидазола в течение 0.5-1 ч. Элюирован-ный белок сразу подвергали хроматографической очистке на гепарин-сефарозе. Для этого белок наносили на уравновешенную в буфере A (50 мМ TrisHCl pH 8.0, 2 мМ Р-меркаптоэтанол, 50 мМ NaCl, 5% глицерин, 1 мМ PMSF, 0.5 мМ ЭДТА) 1 мл колонку Hi-Trap heparin (GE). Отмывали от неспецифически связавшихся белков буфером А с градиентом NaCl до 250 мМ. Элюцию проводили буфером В (50 мМ TrisHCl pH 8.0, 2 мМ Р-меркаптоэтанол, 1 M NaCl, 5% глицерин, 1 мМ PMSF, 0.5 мМ ЭДТА). Фракцию элю-ированного белка обессоливали до 250 мМ NaCl и концентрировали на колонке AmiconUltra 30K (Millipore) на холоду. К полученному образцу добавляли глицерин до 20%.
Список литературы:
1. Княжанская Е.С., Шадрина О.А., Анисенко А.Н., Готтих М.Б.. Роль ДНК-зависимой протеинкиназы в репликации ВИЧ-1 // Молекулярная биология. — 2016. — Т. 50. — № 4. — С. 639-654.
2. Fell V.L., Schild-Poulter C. The Ku heterodimer: function in DNA repair and beyond // Mutation research. Reviews in mutation research. — 2015. — V. 763. — P. 15-29.
3. Hanakahi LA. 2-step purification of the Ku DNA repair protein expressed in Escherichia coli // Protein expression and purification. — 2007. — V. 52. — P. 139-145.
4. Hill R., Lee P.W. The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK): more than just a case of making ends meet? // Cell Cycle. — 2010. — V. 9. — I. 17. — P. 3460-3469.
5. Jin S., Weaver D.T. Double-strand break repair by Ku70 requires heterodimerization with Ku80 and DNA binding functions // EMBO J. — 1997. — V. 16. — P. 6874-6885.
6. Osterman I.A., Evfratov S.A., Sergiev P.V., Dontsova O.A. Comparison of mrna features affecting translation initiation and reinitiation // Nucleic Acids Research. — 2013. — V. 41. — P. 478-486.
