CC BY
308
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 576.852.24
Оптимизация метода определения антагонистической активности пробиотических бактерий
Optimization of the method for determining the antagonistic
activity of probiotic bacteria
Доцент A.H. Иркитова, (Алтайский государственный университет) кафедра экологии, биохимии и биотехнологии, тел. 8-961-983-64-81 E-mail: Elenl71987@mail.ru
вед. инженер Е.С. Яценко (Алтайский государственный университет) ИЦ «Промбиотех», тел. 8-903-948-60-38 E-mail: mlprx@mail.ru
Associate Professor A.N. Irkitova, (Altai State University) chair of ecology, biochemistry and biotechnology, tel. 8-961-983-64-81 E-mail: Elenl71987@mail.ru
Management Engineer E.S. Yatsenko (Altai State University) Engineering center of «Prombiotekh», tel. 8-903-948-60-38 E-mail: mlprx@mail.ru
Реферат. Широкое применение пробиотических микроорганизмов в различных отраслях промышленности во многом обусловлено их антагонистическим эффектом по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре. На сегодняшний день в лабораторной практике используется широкий арсенал методов определения антагонистической активности, различающихся по сложности выполнения, производительности, сравнимости и точности получаемых результатов. Наиболее распространенным среди диффузионных методов отсроченного антагонизма является метод перпендикулярных штрихов. Он прост в исполнении и наглядно показывает результаты антагонистического действия пггамма-антагониста по отношению к тест-культуре. Выбор использования того или иного метода обусловлен личным выбором автора исследования в зависимости от поставленных целей и задач. Предложен и подробно описан метод определения антагонистической активности пробиоти-чеких микроорганизмов «антагонистический газон» как альтернатива классическому методу перпендикулярных штрихов. Данный метод позволяет быстро и наглядно оценить зоны лизиса тест-культуры и может быть полезен как в лабораторной практике, так и в других областях народного хозяйства: пищевая и перерабатывающая промышленность, сельское хозяйство, медицина. Модифицированный нами метод отработан и апробирован на изучении антагонистической активности коллекционных штаммов Bacillus subtilis по отношению к тест-штаммам Escherichia coli. Результаты получились сопоставимы при постановке аналогичного эксперимента классическим методом перпендикулярных штрихов, поэтому модифицированный метод «антагонистический газон» может быть рекомендован для работы при отборе антагонистически активных пробиотических штаммов.
Summary. Wide application of probiotic microorganisms in various industries largely due to their antagonistic effect against pathogenic and conditionally pathogenic microflora. To date, the laboratory uses a wide range of methods for the determination of antagonistic activity, which differ in complexity of implementation, performance, comparability and accuracy of results. The most common among the diffusion methods of deferred antagonism is a method of perpendicular strokes. It is simple to implement and it demonstrates results of antagonistic action of strain-antagonist in relation to a test culture. A choice of using one method over another due to personal choice of an author of a study depending on goals and objectives. The paper proposes and describes in detail a method of determination of antagonistic activity of microorganisms probiotics "antagonistic lawn" as an alternative to the classical method of perpendicular strokes. This method allows you to quickly and visually assess the zone of lysis of the test culture and can be useful in laboratory practice and in other fields of national economy: food and processing industry, agriculture, medicine. The modified method we have perfected and tested on the study of antagonistic activity of collection strains of Bacillus subtilis isolates against test strains of Escherichia coli. The results were comparable in the formulation of a similar experiment by the classical method of perpendicular strokes, therefore the modified method of "antagonistic lawn" can be recommended for the selection of antagonistic active probiotic strains.
€> Иркитова A.H., Яценко E.C., 2017
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности АПК-продукты здорового питания, Nq 5, 2017
Ключевые апова: микробный антагонизм, метод перпендикулярных штрихов, сельское хозяйство, пищевая промышленность.
Keywords: microbial antagonism, the method of perpendicular strokes, agriculture, food industry.
Способность пробиотических бактерий (молочнокислых, бифидобактерий, Bacillus subtilis и др.) образовывать антибиотические вещества и за счет этого оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие на вредную микрофлору широко используется в пищевой промышленности, медицине, фармакологии, ветеринарии и в сельском хозяйстве. Например, в сыроделии применяют штаммы молочнокислых бактерий - антагонисты к кишечной палочке и маслянокислым бактериям, вызывающим раннее и позднее вспучивание сыров [1]; в медицине применяют штаммы бифидобактерий - антагонисты к Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, E.Colin др. микроорганизмам, вызывающим инфекционные заболевания человека [2, 3]; в сельском хозяйстве широкое применение нашли штаммы Bacillus subtilis - антагонисты к широкому кругу патогенных и условно-патогенных бактерий, циркулирующих на животноводческих комплексах [4].
Известно, что антагонистическая активность бактерий осуществляется с помощью разных (зачастую очень тонких) молекулярных механизмов, а ее проявление зависит от ряда факторов, среди которых, прежде всего, следует назвать разнообразие взаимодействий антагониста и его жертвы в конкретных условиях внешней среды. Неудивительно поэтому, что исследователи, определяя антагонистическую активность микроорганизмов, используют разные методы, различающиеся по сложности выполнения, производительности, сравнимости и точности получаемых результатов [5].
Все разработанные к настоящему времени методы определения антагонистической активности микроорганизмов традиционно принято делить на две группы: методы in vitro (в искусственных условиях) и методы in vivo (в живом организме). На первых этапах исследования используют в основном методы in vitro. Они позволяют отсеять не представляющие интереса неактивные или малоактивные штаммы. Дальнейшее исследование с помощью методов in vivo проводят, как правило, с единичными наиболее перспективными штаммами. Зачастую на этом этапе используют уже не чистые культуры штаммов-антагонистов, а препараты на их основе.
Методы in vitro позволяют довольно просто и быстро проверить большой массив штаммов-антагонистов и/или тест-культур нежелательных микробов (санитарно-показательных, патогенных или технически-вредных). Среди этой группы методов в лабораторной практике наиболее часто используют диффузионные методы или методы отсроченного антагонизма, при использовании которых осуществляют подсев тест-штаммов на плотную питательную среду через определенный период после посева испытуемой культуры: метод перпендикулярных штрихов, метод блоков или лунок, метод капель и др. Все эти методы основаны на диффузии антибиотических веществ, образуемых испытуемыми штаммами-антагонистами, в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру и подавляющей рост последней.
Согласно широко используемому в микробиологии методу перпендикулярных штрихов [6, 7], на поверхности агаровой среды в чашке Петри высевают штрихом экспоненциальную культуру исследуемого штамма-антагониста и инкубируют при оптимальной для него температуре (30 и 37 "С соответственно для мезофильных и термофильных форм) в течение определенного времени (например, 24 или 48 ч) для образования и диффузии в агар ингибиторных соединений. Затем перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры-антагониста подсевают штрихом экспоненциальную культуру тест-штамма (например, Е.соЩ, слегка касаясь штриха штамма-антагониста. Чашку вновь инкубируют, но теперь при условиях
Технологии пищевой и перерабатывающей промышленности АПК-продукты здорового питания, Ш 5, 2017
(температура и продолжительность), благоприятных для роста тест-культуры. О наличии и степени антагонистической активности у испытуемого штамма-антагониста судят по величине зоны ингибирования тест-штамма на границе со штрихом роста штамма-антагониста (рис. 1).
Рис. 1. Определение антагонистической активности В.эиЬШз по отношению к Е.соИ методом перпендикулярных штрихов: 1 - штамм-антагонист; 2 - тест-культура; 3 - зона ингибирования
Контролем роста тест-культур служит параллельный посев на чашки с той же средой, но без штамма-антагониста. В соответствии с требованиями к штаммам пробиотических препаратов зоны угнетения роста тест-культур должны составлять не менее 20 мм [8]. На одной чашке к штамму-антагонисту можно подсеять несколько тест-культур и выявить спектр антагонистического действия данного штамма-антагониста. Используемая агаровая среда должна обеспечивать хороший рост как испытуемого штамма-антагониста, так и тест-штамма (или тест-штаммов). Чашки можно инкубировать в аэробных условиях, либо (при необходимости) в анаэростате. Так как размер зон ингибирования тест-культуры в значительной степени зависит от толщины слоя питательного агара, чашки Петри перед розливом среды располагают на строго горизонтальной поверхности, и в каждую чашку наливают одинаковое количество расплавленной среды.
Для объективной оценки антагонистического действия штаммов-антагонистов, выявляемого этим методом, необходимо учитывать, что он дает преимущество штаммам, продуцирующим ингибиторные соединения небольшой молекулярной массы, которые быстрее диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно, дают более обширные зоны ингибирования роста тест-культуры. Этот метод имеет существенный недостаток: продуцент антибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной среде, хотя известно, что не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования им антибиотика, так и для роста тест-организма.
Самым главным достоинством метода перпендикулярных штрихов является его очевидная простота. Но в тех случаях, когда штаммы-антагонисты и тест-культуры растут при одинаковых условиях (время, температура, питательная среда и пр.), данный метод можно модифицировать с целью сокращения времени проведения анализа. Суть модификации заключается в следующем: штамм-антагонист наносится не штрихом вдоль чашки по поверхности питательной среды (как в классическом методе перпендикулярных штрихов), а засевается глубинно «газоном». Сразу же после застывания питательной среды сверху него зигзагообразным штрихом подсевается тест-культура (рис. 2), и посевы инкубируются при определенных условиях, оптимальных для обеих культур.
Рис.2. Опредеяение антагонистической активности В. эиМШв к Е.соИ методом «антагонистического газона»: 1 - тест-кулътура; 2 - штамм-антагонист; 3 - зона ингибирования
Результат оценивают по зоне ингибирования (зона просветления) вокруг тест-культуры. Смотреть зоны следует при подсвечивании чашки Петри снизу проходящим потоком света. Контролем служит газон тест-культуры без штамма-антагониста. При применения данного метода упрощается методика проведения анализа (нет необходимости в точном и аккуратном нанесении штрихов) и сокращается время получения результатов (с 96 до 48 ч). Сравнительная характеристика методов представлена в табл. 1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика способов определения антагонистической активности микроорганизмов
Параметр Метод перпендикулярных штрихов Простой штрих
Продолжительность Определения, ч 96 48
Трудоемкость проведения Средняя Низкая
Наглядность результатов + +
Для проверки достоверности модифицированного метода мы провели опыт по определению антагонистической активности В. subtilis к E.coli и получили результаты, не противоречащие результатам, полученным при использовании классического метода перпендикулярных штрихов (табл. 2).
Таблица 2
Антагонистичекая активность В. subtilis к E.coli
Штамм- антагонист Зона ингибирования тест-штамма E.coli, см
Метод перпендикулярных штрихов «Антагонистический газон»
Bacillus subtilis В-5449 од од
Bacillus subtilis В-1323 0,3 0,2
Bacillus subtilis B-2895 3,0 3,0
Bacillus subtilis B-2896 2,0 2,0
Bacillus subtilis B-4828 0,4 0,5
Таким образом, результаты, полученные при использовании модифицированного нами метода «антагонистический газон», не противоречат результатам, полученным при применении классического метода. Поэтому его можно использовать в лабораторной практике для определения антагонистической активности пробиоти-ческих микроорганизмов. ,
промытк гнности
ЛИТЕРАТУРА
1. Скрябина, М.П. Антагонистическая активность кисломолочных продуктов, обогащенных пробиотическими штаммами [Текст]/ М.П. Скрябина, Н.П. Тарабуки-на, М.П. Неустроев [и др.] // Санитарная микробиология,- 2016. - № 3 (19).
2. Лазовская, A.A. Антагонистическая активность споровых пробиотиков и влияние на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза [Текст]/ A.A. Лазовская, З.Г. Воробьева, К.Н. Слинина [и др.] // Вестник РУДН. Серия Медицина,- 2010. - № 1. - С. 18-24.
3. Чижаева, A.B. Научный обзор: теоретические и практические аспекты конструирования пробиотических препратов [Текст]/ A.B. Чижаева, Т.Н. Дудикова // Научное обозрение. Биологические науки,- 2017. - № 2. - С. 157-166.
4. Феоктистова, Н.В. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве [Текст]/ Н.В. Феоктистова, A.M. Марданова, Г.Ф. Хадиева, М.Р. Шарипо-ва // Ученые записки Казанского университета, серия естественные науки,- 2017. -Т. 159. - С. 85-107.
5. Иркитова, А.Н. Методы определения антагонистической активности молочнокислых бактерий [Текст]/ А.Н. Иркитова, Я.Р. Каган // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. - Вып. 8. - 2012. - С. 226-236.
6. Леляк, A.A. Антагонистический потенциал сибирских штаммов Bacillus ssp. В отношении возбудителей животных и растений [Текст]/ A.A. Леляк, М.В. Штерн-шис //Вестник Томского государственного университета. Биология,- 2014. - № 1 (25).-С. 42-55.
7. Споровые пробиотики. ОФС.1.7.1.0009.15.
8. Пробиотики. ОФС. 1.7.1.0008.15.
1. Skiyabina M.P., Tarabukina N.P., Neustroev M.P. Antagonistic he skay a ak-tivnost' kislomolochnykh produktov, obogashchennykh probioticheskimi shtammami [Antagonistic activity of daiiy products enriched with probiotic strains] Sanitarnaya mikrobiologiya, 2016, No 3 (19), pp. 57-62 (Russian).
2. Lazovskaya A.L., Vorobyov Z.G., Slinina K.N., Grishina N.V., Kulchitskaya M.A., Vasilyeva E.A. Antagonisticheskaya aktivnost' sporovykh probiotikov i vliyanie na le-karstvennuyu chuvstvitel'nost' mikobakteriy tuberkuleza [Antagonistic activity of spore forming probiotics, and the effect of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis] Vestnik RUDN. Seriya Meditsina, 2010, No 1, pp. 18-24 (Russian).
3. Chigaeva A.V., Dudikova G.N. Nauchnyy obzor: teoreticheskie i prakticheskie aspekty konstruirovaniya probioticheskikh prepratov [Scientific review: theoretical and practical aspects of designing probiotic preparatov] Nauchnoe obozrenie. Biologic he skie nauki, 2017, No 2, pp. 157-166 (Russian).
4. Feoktistova N.V., Mardanova A.M., Hadieva G.F., Sharipova M.R. Probiotiki na osnove bakteriy roda Bacillus v ptitsevodstve [Probiotics on the basis of bacteria of the genus Bacillus in poultry production] Uchenye zapiski Kazanskogo universiteta, seriya estestvennye nauki, 2017, T. 159, pp. 85-107 (Russian).
5. Irkitova A.N., Kagan J.R. Metody opredeleniya antagonisticheskoy aktivnosti molochnokislykh bakteriy [Methods for the determination of antagonistic activity of lactic acid bacteria] Aktual'nye problemy tekhniki i tekhnologii pererabotki moloka,2012, Vyp. 8, pp. 226-236 (Russian).
6. Lelyak A.A., Shternshis M.V. Antagonisticheskiy potentsial sibirskikh shtam-mov Bacillus ssp. V otnoshenii vozbuditeley zhivotnykh i rasteniy [Antagonistic potential of Siberian strains of Bacillus ssp. Against pathogens of animals and plants] Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Biologiya, 2014, No 1 (25), pp. 42-55 (Russian).
7. Sporovye probiotiki [Spore probiotics]. OFS. 1.7.1.0009.15.
8. Probiotiki [Probiotics]. OFS. 1.7.1.0008.1
C. 57-62.
REFERENCES
