CC BY
0ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИООБЪЕКТОВ
Оптический мониторинг развития культур микроводорослей
Dunaliella salina
В.А. Богатырев и, Д.А. Пузанов1, Л.А. Дыкман \Н.Г. Хлебцов1,2
'Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия 2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия
Разработан метод оперативного мониторинга динамики численности и изменения пигментного состава в культуре микроводоросли Dunaliella salina. Метод основан на спектрофотометрическом (SP) и цифровом фотоколориметрическом (DPC) анализе спектров ослабления света живых суспензий. Предложенный нами метод DPC основан на анализе гистограмм распределения интенсивности сигнала в цветовой аддитивной модели RGB по любой выбранной области изображения, полученного в стандартных условиях в проходящем свете. В качестве источника равномерного освещения мы использовали экран монитора ноутбука, а в качестве фотодетектора - камеру смартфона. Данные обоих способов хорошо коррелируютмежду собой и с данными методов сравненияс преимуществом цифрового фотоколлориметрического способа при определении числовой концентрации клеток и спектрфотометрического метода при определении пигментного состава.
DOI:
ВВЕДЕНИЕ
Dunaliellasalina-биотехнологически важный продуцент Р-каротина [1]. Вопросы культивирования в лабораторных условиях с высоким выходом целевого продукта в достаточно большой степени пока не решены. Для решения многопараметрических задач управления культивированием традиционно используют микропланшетные оптические ридеры, поскольку многолуночные планшеты позволяют изменять одновременно несколько параметров культивирования. Однако при переходе от сбалансированного роста к развитию под действием стрессоров существенно меняются морфофизиологические параметры культур [2]. При достижении критической плотности популяции, при переходе к каратиногенезу, апоптозу, переживающему состоянию изменяются размер клеток содержание пигментов, показатель преломления. В некоторых случаях клетки становятся склонны к конгломерации, седиментации и флотации с неравномерным распределением по объему лунки. Это может критическим образом сказываться на спектрах ослабления света за счет неконтролируемого вклада светорассеяния при регистрации на спектрофотометрических ридерах, рассчитанных на измерение коллимированного пропускания.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Поглощение основных растительных пигментов проявляется в спектрах экстинкции суспензий микроводорослей в виде сглаженных пиков и плечей. В области 440 нм хлорофилл-а, 470 нм перекрывающиеся пики хлорофилла-б и Р-каротина, 484 нм -общих каротиноидов, 650 нм - хлорофилл-б и 680 - хлорофилл-а. В области 750 нм регистрируется мутность суспензии микроводорослей, зависящая от концентрации клеток и слабо зависящая от пигментного состава [3, 4].
В качестве альтернативного способа измерения фотометрических характеристик живых суспензий микроводорослей мы предлагаем цифровой фотоколориметрический метод, основанный на анализе гистограмм распределенияинтенсивности сигнала в цветовой аддитивной модели RGB по любой выделенной площади изображения, полученного в стандартных условиях в проходящем свете. В качестве источника равномерного освещения мы использовали экран монитора ноутбука, в качестве фотоприемника - камеру смартфона. Альтернативно, культуральныепланшеты были сканированы с помощью фото сканера EPSON Perfection V700.
Мы исходили из предположения выполнимости закона Бугера-Ламберта-Бера для каждого из трех цветовых каналов RGB фотокамеры. Для проверки использовали диметилсульфоксидные экстракты микроводорослей, выращенных до стадии раннего и позднего стационара, обозначаемые как D 209 G (green) и D 209 Y (yellow), соответственно.
На Рис. 1, а. показаны флаконы с культурами D. salina, выращенными для этого эксперимента. На врезке панели Рис. 1, b. Показаны пробирки с DMSO экстрактами микроводорослей, а на самом рисунке приведены спектры экстинкции этих экстрактов. Для наглядности спектры нормированы на величину локального минимума 540 nm. Можно видеть, что при такой нормировке, пики соответствующие Р-каротину и общим каротиноидам достаточно близки по величине у обоих штаммов, в то время как пики хлорофилла а существенно выше у штамма D 209 G.
В результатах DPC измерений (EPSON Perfection V700) эта зависимость проявляется таким образом, что данные R и G каналов у культуры D 203 Y перекрываются на графике зависимости измеренной экстинкции от концентрации (Рис. 2, a, b.). Следует отметить, что для планшетных ридеров, при горизонтальном расположении оптического слоя и при условии соблюдения закона Бугера-Ламберта-Бера, изменение концентрации эквивалентно изменению длины оптического пути.
Несколько иная картина наблюдается при DPC измерениях с помощью смартфона и ноутбука. В этом случае линейная зависимость регистрируемого сигнала от
концентрации раствора проявляется только для красного и зеленого каналов (Рис. 2, С, D.). Для голубого канала эта зависимость носит S-образный характер. Можно отметить, что задача повышения точности фотометрирования DPC способом может быть решена методом калибровочного графика, либо цифровой линеаризации. Хорошей предпосылкой к этому являются низкие значения стандартных отклонений, на графиках, не выходящих за габариты маркеров.
Рис. 1. Фото сосудов с культурами D.salina: D 294 G (green) на ранней стационарной фазе роста и D 209 Y (yellow) на поздней стационарной фазе роста (А); Спектры экстинции DMSO-эксрактов D 294 G и D 209 Y
(B).
Следует отметить, что фотометрические характеристики растворов экстрактов микроводоросли близки для обоих способов DPC измерений для R и G каналов. При этом достоверность линейной аппроксимации для R канала комбинации смартфон/ноутбук даже выше, чем для профессионального фото сканера, 0.94 versus 0.78 (Рис.2. A., C).
Таким образом, мы показали, что закон Бугера-Ламберта-Бера в DPC измерениях выполняется вплоть до оптических плотностей ~ 3(для B канала) при использовании фото сканера EPSON Perfection V700.
Затем для SP и DPC измерений был использован 96-луночный планшет,. В дуплицированные ряды A, B и D, E внесены пробы культур микроводоросли D 203 Yи D 294 G, соответственно. Ряд С представляет собой ряд бланков - эквивалентный объем растворителя без аналита.
В колонки 1 - 3 внесены по 100, 200, 300 стоковых суспензий микроводорослей с доведением объема до 300 ц1культуральной средой.
На рис. 3 B, D приведены концентрационные зависимости спектрофотометрических параметров A470, A640 и A672, определяемые как разность
- л 470 Т-.470 ^750 А 640 ^640 ^750 А 672 ^672 ^750
величин измеренных экстинкции: А = Е - Е , А = Е - Е и А = Е - Е. Аналогичные зависимости по данным DPC измерении приведены на Рис. 3 А, С.
Наиболее заметны отклонения от линейности для культуры D 203 Y, особенно при SPизмерениях. Это объяснимо явлением многократного рассеяния, при значительно большей мутности D 203 Yпо сравнению с D 294 G, отражающейся в больших значениях поглощения при 750 нм.
Рис. 2. Зависимости экстинкции БМ80 экстрактов Б 203 Y (А, С) и Б 294 в (В, Б); от концентрации, как количества экстракта, добавленного в лунку 96-луночного планшета при регистрации с помощью фото сканера (А, В) и комбинации смартфон/ноутбук (С, Б).
С целью определения концентрации пигментов в суспензии микроводоросли D. salina были использованы штаммы D-294 New (возраст: 7 дней) D-294 Old (возраст: 14 дней)
При равной численной концентрации суспензии обоих штаммов имеют схожие спектры экстинкции в области 400 - 750 nm, регистрируемые планшетным ридером BioTek.
Анализ гистограмм распределения клеток по размерам, полученных на счетчике клеток BioRadTC-20, показывает, что клетки переживающей культуры D-294 Old имеют в полтора раза больший объем по сравнению с D-294 New при большем количестве клеток последней (см. табл. 1).
В то же время, удельное содержание общих каротиноидов и общего хлорофилла, рассчитываемого по спектрам экстинкции DMSO экстрактов, различаются в 1.2 и 1.6 раза, соответственно, для этих двух культур.
Такое различие в удельном объеме клеток объясняется бимодальным распределением по размеру для культуры D-294 old (рис. 4 B).
DPC оценка в RGB пространстве дает схожие с SP характеристики и может быть применена с использованием метода градуировочного графика, либо цифровой, или аналоговой линеаризации. Преимуществом DPC способа является возможность проведения не деструктивного и удаленного мониторинга развития культур микроводорослей.
Рис. 3. Зависимости абсорбции суспензийш vivoD 294 G (А, В) и D 203 Y (С, D); от концентрации, как количества стоковой суспензии, добавленной в лунки 96-луночного планшета при DCP (сканер) (А, С) ^Р
(В, D) измерениях.
Табл. 1 Характеристика развития культуры Dunaliella salina
Культура N/106 V specific, ^m3*ml-1 chl a chl b Totalcaro t. д 680 A 750 R'
D-294 new 2,82 2,62E+08 10,19 2,61 3,58 0,23 0,63 0,48
D-294 old 2,34 4,01E+08 5,93 2,25 2,88 0,13 0,21 0,14
ТС 20™ Automated Cell Counter
ТС2СГ Automated Cell Counter
Рис. 4. Гистограммы распределения клеток по размерам с экрана счетчика ТС-20 для культур D-294 new (A)
и D-294 old (B)
Литература
1. Oren A. Saline Systems. 2005; 1(1), 1-14
2. Hosseini Tafreshi A., Shariati M. J. of Applied Microbiology. 2009; 107(1), 14-35.
3. Hotos G.N. J. Mar. Sci. Eng. 2023; 11, 1673.
4. Tetsuichi Fujiki, Satoru Taguchi J. of Plankton Res.2002; 24(9), 859-874
РЕАЛИЗАЦИЯ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ РАСПОЗНАВАНИЯ ОБРАЗОВ ДЛЯ ЗАДАЧ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А.К. Клокова1, Ю.А. Бродская1, Е.Г. Колодий2
'Саратовский государственный технический университет им. Ю.А. Гагарина, Саратов, Россия 2ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер, Саратов, Россия
В работе рассмотрены различные подходы, в том числе, основанные на ДСМ-методе, для своевременной диагностики злокачественных новообразований молочной железы посредством распознавания изображений рентгеновской маммографии. Предложена реализация системы медицинской диагностики в маммологии с помощью сверточной нейронной сети.
DOI:
