CC BY
19
БИОФИЗИКА
УДК 577.3
ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОНОМЕРНОГО КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА mRFPl
Е.П. Вржещ, Д.В. Дмитриенко, Г.С. Руданов, В.Э. Загидуллин, В.З. Пащенко, А.П. Разживин, А.М. Салецкий, П.В. Вржещ
(факультет биоинженерии и биоинформатики, биологический факультет, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и физический факультет МГУ; e-mail: razgivin.@genebee.msu.ru)
Флуоресцентные белки из медуз, кораллов и других морских организмов оказались очень удобными генетически кодируемыми флуоресцентными метками. Они широко используются в биотехнологии и клеточной биологии как in vivo маркеры. С их помощью изучается экспрессия генов, локализация белков и органелл в клетках, а также внутри- и межклеточные взаимодействия (Chal-fie, 1995; Tsien, 1998; Matz et al., 1999; Baird, 2000; Lauf, 2001; Чудаков, Лукьянов, 2003; Chudakov et al., 2005; Lukyanov et al., 2005). В последнее время все шире применяются белки, у которых испускание флуоресценции приходится на красную область спектра: красный тетрамерный флуоресцентный белок DsRed (drFP583) (Matz et al., 1999) и мономерный красный белок mRFP1 (Campbell et al., 2002), который был получен из DsRed путем аминокислотных замен в интерфейсах, ответственных за олигомеризацию. Методами мутагенеза получают новые формы красных флуоресцентных белков с целью улучшения их свойств: квантового выхода, яркости, фото- и pH-стабильности (Shaner et al., 2004).
До сих пор не создана методика прогнозирования свойств того или иного флуоресцентного белка лишь на основании его структуры, т.е. не решена общая задача разработки алгоритма дизайна белков с заранее заданными свойствами. Установление взаимосвязи между структурой и свойствами флуоресцентных белков позволит решить эту задачу.
В данной работе изучены оптические свойства красного мономерного флуоресцентного белка mRFP1 как исходного объекта для последующего анализа взаимосвязи структуры и флуоресцентных свойств полученых нами мутантов mRFP1, содержащих однократные аминокислотные замены.
Материалы и методы
Плазмида pMT-mRFP1 была любезно предоставлена Fungal Genetics Stock Center, США (McClu-skey, 2003). Амплификация гена mRFP1 из плаз-
миды pMT-mRFP1 проводилась методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: GCCTCCTCCGAGGACG и ATGGATCCGGCGC-CGGTGGAGTG ("Синтол", Москва). При амплификации использовалась материалы: ДHK-пoлимepаза Taq ("Сибэнзим", Hoвocибиpcк), смесь дезоксири-бонуклеозидтрифосфатов ("Сибэнзим"), минеральное масло (ICN, США).
При клонировании амплифицированного фрагмента mRFPl в плазмидный вектор pQE-60 ("Qia-gen", Голландия) использовали эндонуклеазу рестрикции NcoI, фрагмент Кленова ДHK-пoлимepазы I, эндонуклеазу рестрикции BamHI и ДHK-лигазy Т4 (все "Сибэнзим"). B результате был получен экс-прессионный вектор pQE-60-mRFPl.
Белок mRFP1 нарабатывался в клетках суперпродуцентов E. coli (штамм ER1821, "New England BioLabs", США). Bыдeлeниe белка mRFPl проводили методом аффинной хроматографии на колонке с никелевой агарозой Ni-NTA ("Qiagen") по стандартной методике. Çатeм белок подвергался трехкратному диализу против избытка фосфатного буфера (67 mM Na2HPO4 ("Merck", США), 67 mM KH2PO4 ("Merck"), pH 7,5). Полученный препарат белка с концентрацией ~ 1,5 мг/мл хранили при 4°. Концентрацию белка определяли по методу Бред-форд (Bradford, 1976).
Спектры оптического поглощения регистрировали с помощью спектрофотометра Cary 100 ("Varian Inc", США) при 25° в фосфатном буфере pH 7,5 в кварцевой кювете. Спектры флуоресценции регистрировались с помощью спектрофлуориметра Cary Eclipse ("Varian Inc") при 25° в фосфатном буфере pH 7,5 в кварцевой кювете, угол между возбуждающим и регистрируемым пучками равен 90°. Квантовый выход флуоресценции определяли относительно стандарта (родамин 6G в этаноле) согласно работам Fletcher (1969) и Kubin, Fletcher (1982).
Кривые затухания флуоресценции регистрировали с помощью импульсного флуорометра, описанного в работе Пащенко (1987). Для возбуждения образцов использовали пикосекундные импульсы света с длиной волны 532 нм, для подавления лазерного
11 BMУ, биология, № 3
излучения использовался фильтр КС17. Флуоресцентный сигнал регистрировали с передней грани кюветы с помощью электронно-оптической камеры "АГАТ СФ-3М" (ВНИИОФИ, Россия), сопряженной с многоканальным детектором Hamamatsu C7041 ("Hamamatsu", Япония). Автоматизированная система управления обеспечивала накопление экспериментальных данных до достижения заданного отношения сигнал/шум.
Исследование зависимости интенсивности флуоресценции белка mRFPl от pH проводили, как описано в работе Вржеща (Vrzheshch et al., 2000).
Результаты и обсуждение
Спектр оптического поглощения белка mRFPl представлен на рис. 1. Группа полос с максимумом около 584 нм (красный компонент) принадлежит полностью созревшему белку, а группа с максимумом около 503 нм (зеленый компонент), по-видимому, обусловлена поглощением фракции белка (зеленой фракции), которая не проходит в процессе созревания дальше зеленого интермедиата (Baird et al., 2000; Gross et al., 2000; Campbell et al., 2002) или оказывается конечным "тупиковым" продуктом типа транс-конформации F65-Q66 пептидной цепи (Baird et al., 2000; Gross et al., 2000; Wall et al., 2000; Campbell et al., 2002). Видно, что каждая из этих групп состоит как минимум из двух полос. Одна из них (с большей амплитудой и более длинноволновая) определяет положение максимума в своей группе (при 584 и 503 нм соответственно), а вторая проявляется в виде коротковолнового плеча (около 544 и 472 нм соответственно). Более тонкая структура обычными методами не разрешается.
Спектры испускания и возбуждения флуоресценции белка mRFP1 приведены на рис. 2. Мак-
Рис. 2. Спектры испускания (непрерывная кривая) и возбуждения (пунктирная кривая) флуоресценции препарата белка шКРР1 (0,01 мг/мл) в фосфатном буфере рН 7,5 при 25°
симум спектра возбуждения флуоресценции приходится на 588 нм. Максимум спектра испускания флуоресценции приходится на 607 нм (соответственно стоксовский сдвиг составляет 23 нм).
Анализ кривых затухания флуоресценции показывает, что с достаточно хорошей точностью кинетика процесса моноэкспоненциальна. Время жизни флуоресценции шЯРР1 в этом приближении равно ~ 1,8 наносекунды (рис. 3).
Рис. 3. Кривая затухания флуоресценции препарата белка шКРР1 (0,05 мг/мл) в фосфатном буфере рН 7,5 при комнатной температуре. Длина волны возбуждения 532 нм
Рис. 1. Спектр оптического поглощения препарата белка шЯБР1 (0,6 мг/мл) в фосфатном буфере рН 7,5 при 25°
Коэффициент экстинкции препарата белка шЯРР1 в фосфатном буфере при рН 7,5 равен 42 000 М-1 см-1 для X = 584 нм.
Квантовый выход флуоресценции белка шЯРР1 при 25° равен 0,27.
Спектр оптического поглощения, представленный на рис. 1, разлагали на гауссовы полосы по
Разложение спектра оптического поглощения тИРР1 (см. рис. 4) в видимой области спектра на гауссовы полосы
Рис. 4. Разложение спектра оптического поглощения белка тКБР1 (см. рис. 1) на симметричные гауссовы полосы по исходному спектру и набору его неискаженных производных вплоть до 8-го порядка. Цифрами указаны номера гауссовых полос. Пунктирной кривой показан экспериментальный спектр, толстой непрерывной кривой — сумма интенсивностей всех гауссовых полос, тонкими непрерывными кривыми — гауссовы полосы. Количественные характеристики гауссовых полос приведены
в таблице
исходному спектру и его неискаженным производным вплоть до восьмого порядка согласно разработанной нами методике (Михайлюк, Разживин, 2003; МгкЬайуик е! а1., 2005). Набор полученных полос приведен на рис. 4, их количественные характеристики суммированы в таблице. Как полоса поглощения полностью созревшего белка с максимумом около 584 нм, так и полоса поглощения зеленой фракции белка с максимумом около 503 нм могут быть представлены в виде суперпозиции четырех полос (гауссовы полосы 2—5 и 6—9 на рис. 4). Сравнивая эти наборы полос (полосы 2—5 и 6—9), можно сделать вывод о практической идентичности тонкой структуры энергетических уровней хромофоров созревшего красного белка тЯБР1 и его зеленой фракции.
Исследование зависимости интенсивности флуоресценции белка тЯРР1 от рН в диапазоне рН 2—7,5 (возбуждение на длине волны 584 нм и регистрация испускания на длине волны 607 нм) показало наличие быстрого обратимого перехода к полностью нефлуоресцирующей протонированной форме
№ полосы Максимум (см-1/нм) Амплитуда Ширина полосы на полувысоте (см-1/нм)
1 16193/618 0,035 750/28,6
2 16716/598 0,27 636/22,8
3 17046/587 0,52 648,5/22,3
4 17424/574 0,47 975/32,1
5 18352/545 0,51 1403,5/41,7
6 19209/521 0,075 585/15,9
7 19744/506 0,365 665/17,2
8 20145/496 0,335 840/20,7
9 20911/478 0,17 1055/24,1
10 21532/464 0,135 2200/47,6
белка. Коэффициент Хилла для этой зависимости равен 1, значение pKa равно 4,0.
Выводы
Спектральные характеристики полученного препарата мономерного флуоресцентного белка mRFPl соответствуют литературныш данным (Campbell, 2002).
Детальный анализ тонкой структуры разложения спектра поглощения белка mRFPl с помощью производной спектроскопии высокого порядка показывает, что структуры электронныгх переходов хромофоров обеих форм (полностью созревшей формы белка (максимум поглощения при 584 нм) и зеленой фракции (максимум поглощения при 503 нм)) практически идентичны.
Авторы выражают признательность вед. науч. сотр. НИИФХБ В.Л. Друце за помощь в получении
препарата белка mRFPl.
* * *
Работа выполнена при финансовой поддержке Междисциплинарного научного проекта Московского государственного университета 2005 г. (МНП МГУ № 4) "Биосенсоры на основе новых флуоресцентных белков: направленный синтез и оптические свойства", а также Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 05—04—98606, 06-04-49072).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Михайлюк И.К., Разживин А.П. 2003. Метод разложения спектров на полосы по исходному спектру и набору его производных // Биофизика. 48. 405—410.
Пащенко В.З. 1987. Новые физические методы в биологических исследованиях / Под ред. Г.Н. Бе-рестовского. М. С. 45—65.
12 ВМУ, биология, № 3
Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. 2003. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов для исследований подвижности белков in vivo // Биохимия. 68. № 9. 952—957.
Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y. 2000. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of
DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97. 11984-11989.
Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Bioc-hem. 72. 248-254.
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., T s i e n R. Y. 2002. A monomeric red fluorescent protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99. 7877-7882.
Chalfie M. 1995. Green fluorescent protein//Pho-tochem. Photobiol. 62. 651—656.
Chudakov D.M., Lukyanov S.A., Lukya-nov K.A. 2005. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging // Trends Biotechnol. 23. 605—613.
Fletcher A.N. 1969. Quinine sulfate as a fluorescence quantum yield standard // Photochem. Photobiol. 9. 439—444.
Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., Tsien R.Y. 2000. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97. 11990—11995.
Kubin R., Fletcher A.N. 1982. Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes // J. Lumin. 27. 455—462.
Lauf U., Lopez P., Falk M.M. 2001. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins // FEBS Lett. 498. 11—15.
Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S.A., Verkhusha V.V. 2005 Innovation: Pho-
toactivatable fluorescent proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6. 885-91.
Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Marke-lov M.L., Lukyanov S.A. 1999. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species // Nat. Biotechnol. 17. 969-973.
McCluskey K. 2003. The Fungal Genetics Stock Center: from molds to molecules // Adv. Appl. Microbiol. 52. 245-262.
Mikhailyuk I.K., Lokstein H., Razji-v i n A . P . 2005. A method of spectral subband decomposition by simultaneous fitting the initial spectrum and a set of its derivatives // J. Biochem. Biophys. Methods. 63. 10-23.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N., Palmer A.E., Tsien R.Y. 2004. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 22. 1567—1572.
Tsien R.Y. 1998. The green fluorescent protein // Ann. Rev. Biochem. 67. 509—544.
Vrzheshch P.V., Akovbian N.A., Varfo-lomeyev S.D., Verkhusha V.V. 2000. Denatura-tion and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions // FEBS Lett. 487. 203—208.
Wall M.A., Socolich M., Ranganathan R. 2000. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed // Nat. Struct. Biol. 7. 1133—1138.
Поступила в редацию 5.10.2006
OPTICAL PROPERTIES OF THE MONOMERIC RED FLUORESCENT PROTEIN mRFPl
E.P. Vrzheshch, D.V. Dmitrienko, G.S. Rudanov, V.E. Zagidullin, V.Z. Paschenko, A.P. Razzhivin, A.M. Saletsky, P.V. Vrzheshch
For the expression in E. coli, the PCR-amplified fragment encoding mRFPl from vector pMT-mRFPl (Fungal Genetic Stock Center) was placed to the pQE-60 vector. Chemically competent E. coli ER1821 were transformed and grown overnight at 37°C. The protein was purified by Ni-NTA chromatography and dialyzed in 67 mM Na2HPO4, 67 mM KH2PO4, pH 7,5. There are two peaks (at 503 nm and at 584 nm) in the mRFPl absorption spectrum. The green component (503 nm) may be corresponded to a green fraction of the protein (a fraction that never matures beyond the green intermediate or a fraction which trapped as a dead-end product such as the nonproductive trans conformation for the F65 Q66 peptide bond). The mRFPl's extinction coefficient equals to 42 mM-1 cm-1 at 584 nm; the emission maximum is at 607 nm; the excitation maximum is at 584—586 nm; the Stocks' shift equals to 23 nm; the fluorescence lifetime is about 1,8 ns; the quantum yield equals to 0,27; pKa is 4,0. Analysis of the absorption spectrum of mRFP1 by means of the high-order derivative spectroscopy shows that the electron transition system of fully matured protein form (its absorption maximum is at 584 nm) and the same one of the green fraction (its absorption maximum is at 503 nm) are practically indentical.
