CC BY
89
УДК: 579.61:579.842.11:616-095
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК FIMA, HLYA,B,C, И PAP C, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АДГЕЗИНОВ, ГЕМОЛИЗИНОВ, МАННОЗА-РЕЗИСТЕНТНЫХ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ У ГЕНИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ У ЖЕНЩИН ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА
И.С. Немова
Проведено определение генетических детерминант патогенности у генитальных штаммов Escherichia coli, выделенных из урогенитального тракта при воспалительных заболеваниях у женщин репродуктивного возраста. Методом полимеразной цепной реакции с использованием уникального набора олигонуклеотидных праймеров. В результате исследования определены количественные значения содержания микроорганизмов. Установлено, что штаммы E. coli, выделенные у женщин при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта, обладали высокой частотой выявления генетических детерминант патогенности fm A, hly A,B,C , pap С в образцах биологического материала.
Ключевые слова: микрофлора, репродуктивный тракт, патогенность, генетические детерминанты, полимеразная цепная реакция
Введение
В последние десятилетия Еscherichia coli стала распространенным нозокомиальным патогеном. Еcherichia coli, как представитель условно-патогенной микрофлоры, является причиной развития воспалительных заболеваний урогенитального тракта [1, с.34-39].
Усиление вирулентности среди гетерогенных популяций потенциально патогенных
энтеробактерий в настоящее время является важным объектом исследований различных отраслей биологической и медицинской наук. Наиболее существенными для изменения патогенности условнопатогенных энтеробактерий, ввиду «скачкообразного» характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов связанных, в частности с «островами» и «островками» патогенности, ассоциированных с фрагментами ДНК, включающими дискретные гены вирулентности [2, р. 261-272; 3, с. 21-23].
В частности, среди патогенных для человека сероваров Еscherichia coli обнаружены «острова патогенности», детерминирующие ключевые этапы взаимодействия любого патогена с
макроорганизмом, включая адгезию, продукцию токсинов, способность противостоять факторам неспецифической резистентности [4, с.5-6; 5, с. 67-74].
Уропатогенные кишечные палочки, UPEC-uropathogenic E.coli, могут включать гены, контролирующие синтез фимбриальных адгезинов (Р и S), а-гемолизина (hly) и цитотоксического некротизирующего фактора-1 (onf-1), сайтами интеграции которых являются локусы генов селеноцистеиновой (sel), фенилаланин (phe)-специфичной tRNA. [4]. Известны «островки
патогенности», контролирующие синтез белков, связанных с поглощением ионов железа, необходимого для размножения возбудителя в ткани, а также гены системы секреции III-го типа, ответственной за одноэтапный транспорт эффекторных молекул из бактериальной клетки в цитоплазму эукариотной клетки с последующей модификацией цитоплазматических белков поражаемых мишений [5, с. 67-74; 6, с.80-112].
В связи с этим, в ряде случаев, обнаружение генетических детерминант, дополненное
фенотипической характеристикой экспрессируемого фактора патогенности, позволяют объективно судить об этиологическом агенте заболевания, имеющем значение в лабораторной диагностике патологий урогенитального тракта.
Целью настоящего исследования явилось определение генов, детерминирующих адгезины, гемолизины, манноза-резистентные гемагглютинины у штаммов Escherichia coli, выделенных из урогенитального тракта при воспалительных заболеваниях у женщин репродуктивного возраста.
Материалы и методы исследования
Обследовано 67 женщин в возрасте от 18 до 47 лет с воспалительными заболеваниями репродуктивной системы. Из 67 женщин с воспалительными заболеваниями 30 пациенток были больны аднекситом (44,8%), 22 - эндоцервицитом (32,8%) и 15 - кольпитом (22,4%). У 51 обследованной женщины (76,1%) были выделены штаммы Escherichia coli: 23 штамма - при аднексите, 18 - при эндоцервиците, 10 - при кольпите. Группа сравнения составили 40 практически здоровых женщин, репрезентативных по возрасту (контрольная группа - 10 штаммов Escherichia
coli).
Количественную и качественную оценку состава вагинального микроценоза производили бактериологическим методом в соответствии с Приказом МЗ СССР №535 от 22.04.85. Проводили культуральное исследование содержимого заднего и боковых сводов влагалища, и цервикального канала на энтеробактерии. Исследуемый биоматериал (отделяемое влагалища) засевали на питательные среды Эндо или Левина для идентификации Escherichia coli.
Подбор для кишечных палочек праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ «Lasergene» (США). Используемые праймеры для Escherichia coli: fim A (адгезины) - 5'--TGG-CTG-CCG-CAC-TAT-TCG-CC - 3', hly A,B,C (гемолизины)- 5'- TAT-TGG-GAC-CAC-GCG-TGS-CG - 3', pap C (манноза-резистентные гемагглютинины) - 5'-ACG-CCG-GCC-TTA-ACA-GTG-GC - 3'. Олигонуклеотиды праймеров и зонда были синтезированы амидофосфитным методом (ЗАО «Синтол», г. Москва; паспорт № 3873). Проводили выделение бактериальной ДНК по стандартной методике с использованием комплект реагентов для выделения ДНК из биопроб -«Проба ГС» (набор №1). Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной технологии.
Результаты
Тестирование штаммов Escherichia coli на наличие гена fim A (рис. 1), выделенных из отделяемого влагалища при различных воспалительных заболеваниях, показало, что частота встречаемости ампликонов, специфичных гену fim A, при аднексите, эндоцервиците, кольпите, значительно выше чем у штаммов, выделенных у женщин, не имеющих воспалительных заболеваний (контрольная группа) (табл. 1).
Таблица 1.
Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов __________________ Гап Л у культур Еscherichia соЫ____________________________
Вариант инфекции (количество изученных штаммов Е. соН) Частота встречаемости фрагмента fim A гена (абс.%)
аднексит (п=23) 16 (69,6±1,2)
эндоцервицит (п=18) 13 (72,2 ±0,9)
кольпит(п=10) 7 (70,0±2,5)
контрольная группа (п=15) 1 (6,7±3,4)
1 2 3 4’ 5 б 7 8 9 10 11
В
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных при ПЦР-анализе фрагмента ДНК штамма Escherichia coli. для гена fim A, где 1-10 - штаммы Escherichia coli, выделенные из клинического материала; 11 - маркер молекулярного веса
Тестирование штаммов Escherichia coli на наличие генов hly A,B,C и pap C, выделенных из отделяемого влагалища при различных воспалительных заболеваниях, позволило установить, что частота встречаемости ампликонов, специфичных гену hly A,B,C, при аднексите, эндоцервиците, кольпите значительно выше, по сравнению с генетическими детерминантами факторов патогенности - pap C. Так, частота встречаемости фрагмента hly A,B,C, при аднексите составила 78,3% (18 штаммов), а фрагмента pap C - 65,2% (15 штаммов). В образцах контрольной группы данные ампликоны не выявлены (рис. 2,3).
аднексит эндоцервицит кольпит
■ hly A,B,C Bpap C
Рис. 2. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов hly A,B,C,
и pap С у культур Escherichia coli
Рис.3 Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных при ПЦР-анализе фрагмента ДНК Escherichia coli для гена hly A,B,C 1-10 - штаммы Escherichia coli, выделенные из клинического материала; 11 - маркер молекулярного веса
В ходе исследования было установлено, что у 5 штаммов Escherichia coli, выделенных при аднексите, присутствовали все три фрагмента генов fim A, hly A,B,C, и pap C, у 14 - сочетание из fim A, hly A,B,C; у 12 - fim A, pap C; у 8 - сочетание hly A,B,C и pap C.
Таким образом, установлено, что нуклеотидные последовательности генов, детерминирующие синтез факторов патогенности, встречаются у изученных штаммов Escherichia coli в разнообразных соотношениях, а частота обнаружения фрагментов искомых генов (fim A, hly A,B, C, и pap C) различна в зависимости от наличия воспалительного заболевания репродуктивного тракта у обследованных женщин.
There was made the definition of genetic pathogenic determinants at genital strains Escherichia coli, which were exarticulated from urogenital tract of reproductive aged women with inflammatory diseases. The genes definition, which determinates adhesins, haemolysins, mannose-resistant hemagglutinins at strains E. coli, was realized with polymeric chain reaction's method with use of oligonucleotide primers unique set. As a research result there were determined quantitative outcomes of microorganisms' content. It was established, that the strains E. coli, which were exarticulated from urogenital tract of the women with inflammatory diseases, possessed a high density of revealing of genetic pathogenic determinants fim A, hly A,B,C , pap С in biological material's samples.
The key words: micro flora, reproductive tract, pathogenicity, genetic determinants
Список литературы
1. Бондаренко, В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // ЖМЭИ. 1999. №5. С.34-39.
2. Johson, J.R. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise / J.R. Johson // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P.261-272.
3. Бондаренко, В.М. Маркеры уропатогенности E. coli у детей с инфекцией мочеполовой системы / В.М. Бондаренко, С.В. Халиуллина, С.В. Фиалкина и др. // Детские инфекции. 2004. №3. С.21-23.
4. Мавзютов, А.Р., Фиалкина С.В., Бондаренко В.М. «Острова» патогенности условнопатогенных энтеробактерий / А.Р. Мавзютов, С.В. Фиалкина, В.М. Бондаренко // ЖМЭИ. 2002. №6. С.5-9.
5. Бондаренко, В.М. «Острова» патогенности бактерий / В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. 2001. №4. С. 67-74.
6. Красноперова, Ю.Ю. Характеристика изменений патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях / Ю.Ю. Красноперова. Москва: Флинта, 2010. С.80-112.
Об авторах
Немова И.С. - кандидат биологических наук, доцент кафедры общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»,432970 г.Ульяновск, ул. Л.Толстого, 42; е-mail: nemova [email protected]
UDC: 579.61:579.842.11:616-095
DNA- FRAGMENTS FIM A, HLY A,B,C, И PAP C DETERMINATION, USED FOR REVEALING OF ADHESINS, HAEMOLYSINS, MANNOSE-RESISTANT HEMAGGLUTININS AT GENITAL STRAINS ESCHERICHIA COLI, EXARTICULATED AT THE WOMEN WITH REPRODUCTIVE TRACT’S INFLAMMATORY DISEASES Nemova I.S
