CC BY
56
Маркеры уропатогенности Е. coli у детей с инфекцией мочевой системы
В. М. Бонааренко, С. В. Халиуллина, С. В. Фиалкина, Т. И. Лысенко, В. Г. Митков, А. Р. Мавзютов, В. А. Анохин
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. ф. Гамалеи, 121 детская поликлиника, Москва Государственный медицинский университет, Казань
С помощью ПЦР исследовали 176 штаммов Е.соИ, изолированных из мочи и фекалий 150 детей с различными проявлениями инфекции мочевой системы и дисбактериозом кишечника на наличие генов, ассоциированных с уропатогенно-стью. Установили, что выраженность клинических форм инфекции мочевой системы, а соответственно и тактика дальнейшего ведения обследованных детей, прямо зависят от частоты выявления различных маркеров уропатогенности у выделенных из их мочи штаммов бактерий.
Ключевые слова: инфекции мочевой системы, уропатогенные эшерихии, «острова патогенности».
Как известно, ведущая роль в развитии воспалительных процессов в мочевой системе принадлежит ассоциации различных видов патогенных и условно-патогенных бактерий. Согласно данным ESGNI (European Study Group on Nosocomial Infection), среди возбудителей уроинфекций ведущая роль принадлежит следующим видам условно-патогенных микроорганизмов (УПМ): E. coli (35,6%), Enterococcus spp. (15,8%), Candida spp. (9,4%), Klebsiella spp. (8,3%), Proteus spp. (7,9%) и Pseudomonas aeruginosa (6,9%) [1]. К сожалению, наметилась тенденция к торпидно-му течению и хронизации воспалительных процессов, усложняющих лечение больных детей [2—6]. Исследования последних лет выявили в составе генома уропа-тогенных штаммов «острова патогенности» (ОП), ассоциированные с фрагментами ДНК, включающими дискретные гены вирулентности [7—9]. Как известно, детерминанты ОП фланкированы прямыми нукле-отидными повторами, что определяет их способность к распространению среди одного или родственных видов бактерий путем генетического обмена [4, 9, 10]. Такая мобильность ОП связана с тем, что они могут входить в состав транспозонов, генома бактериофагов или плазмид [11]. Наследование ОП лежит в основе формирования у клинических штаммов условно-патогенных бактерий новых свойств, в первую очередь вирулентных. В частности, среди патогенных для человека сероваров E.coli обнаружены «острова патогенности», детерминирующие ключевые этапы взаимодействия любого патогена с макроорганизмом, включая адгезию, продукцию токсинов, способность противостоять факторам неспецифической резистентности [7, 9].
Как известно, патогенные E.coli подразделяются на две большие группы: первую, вызывающую развитие патологического процесса внекишечной локализации, и вторую, обусловливающую развитие острых кишечных инфекций. Кишечные палочки, вызывающие внекишечный инфекционный процесс, подразделяются, в свою очередь, на три патогруппы: менингеальные (MENEC-menin-g/'t/'s E.coli), септицемические (SEPEC-septicemia E.coli) и урологические (UPEC-uropathogenic E.coli).
ОП UPEC могут включать гены, контролирующие синтез фимбриальных адгезинов (Pи S типа), а-гемо-лизина (Н/у) и цитотоксического некротизирующего фактора-1 (cnf-l), сайтами интеграции которых являются локусы генов селеноцистеиновой (sei), лейцин (/eu)-или фенилаланин (phe)-специфичной tRNA [7, 8]. Известны ОП, контролирующие синтез белков, связанных с
поглощением ионов железа, необходимого для размножения возбудителя в ткани, а также гены системы секреции Ill-го типа, ответственной за одноэтапный транспорт эффекторных молекул из бактериальной клетки в цитоплазму эукариотной клетки с последующей модификацией цитоплазматических белков поражаемых мишеней [7].
Методические подходы к лабораторной диагностике заболеваний, ассоциированных с УПМ достаточно сложны из-за необходимости оценки этиопатогенети-ческой значимости каждого выявленного микробного агента. В этой связи определенный интерес в качестве маркеров патогенности представляют специфические адгезины и цитотоксины, способные нарушать гомеос-таз клетки-мишени. В ряде случаев, обнаружение генетических детерминант, дополненное фенотипиче-ской характеристикой экспрессируемого фактора па-тогенности, позволяют объективно судить об этиологическом агенте заболевания. Указанная выше теория ОП позволяет выявить группу уропатогенных бактерий, потенциально ответственных за развитие патологии мочевыводящих путей. Согласно данным литературы, часто источником бактериальной контаминации мочи являются УПМ, выделяемые при дисбиоти-ческих изменениях нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, потенциально обладающие возможными факторами уропатогенности. В настоящее время считается, что бактериурия у детей, в том числе, асимптоматическая (АБУ) — диагностический признак инфекции мочевыводящих путей (ИМВП). Однако в клинической практике отсутствуют достоверные критерии риска формирования ИМВП в случаях длительной и/или массивной бактериурии. Актуальной является проблема роли дисбактериоза кишечника в ге-незе инфекции мочевыводящих путей и эффективности препаратов-пробиотиков при профилактике и лечении различных ее клинических вариантов [6, 12].
Цель настоящей работы — проведение комплексного клинико-бактериологического обследования детей с различными вариантами инфекции мочевыводя-щих путей и определение частоты встречаемости детерминант вирулентности среди штаммов E.coli различного происхождения.
Материалы и методы исследования
Из мочи и фекалий 150 детей различных возрастных групп изолировано и изучено 176 штаммов Escherichia coli: 98 штаммов, выделенных при остром цистите и пиелонефрите, 28 штаммов/ изолированных из мочи при АБУ, 30 штаммов, изолированных из фе-
■ В. М. Бонларенко и ар. Маркеры уропатогенности Е. coli у летей с инфекцией мочевой системы
калий при наличие АБУ и дисбактериоза кишечника (ДБК), и 20 штаммов, выделенных из фекалий практически здоровых детей. Штаммы бактерий тестировали с помощью ПЦР на наличие генов, ассоциированных с патогенностью: hlyA, hlyB (hemolysin), cnf-1 (cytotoxic necrofising facfor-1), фимбриальных антигенов рарС, sfaC и гена irp-2 (iron regulafedprofein).
Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры. 1 мл суспензии клеток осаждали при 12 ООО об./мин. на центрифуге типа «Eppendorf» («Cyclo-femp-202», Россия). Осадок ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCI (рН 8,4), 2,5 мМ MgCI2 и 0,01% желатин до конечной концентрации 108 КОЕ/мл. Лизирование осуществляли лизоцимом («Serva», США) в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин. при комнатной температуре (22—25 *С) с последующим добавлением протеиназы К («Serva», США) до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при 60 'С. фермент инактивировали кипячением — 15 мин. Кроме того использовались стандартные наборы для выделения ДНК («ПЦР-сервис», Россия). Хранение образцов перед использованием осуществляли при 4 'С.
Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ «Lasergene» (США). Для выполнения работы использовались праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе ОП UPEC, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии S- (sfaC) и P-(papC) типов, гемолизины (hlyA и hlyB), цитотоксический некротизирующий фактор (cnf-1) и железорегулируемый белок (írp-2 ген, входящий в состав острова высокой патоген-ности — HPI, впервые обнаруженный у иерсиний). Прайме-ры были синтезированы в НПф «ДНК-технология» (Россия). Амплификацию проводили при использовании 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCI (рН 8,4), 2,5 мМ MgCI2, 0,1% тритон-Х-100, 0,2 мМ каждого из с1Атф, с1ГТф, с1Л"ф, с1ЦТф, 2,0 мкМ/л прай-мера, 1,5 U Taq ДНК-полимеразы и 5 мкл тотальной бактериальной ДНК на термоциклере «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия).
Детекцию продуктов амплификации (20 мкл) осуществляли электрофоретически в 1,5% горизонтальном агарозном геле в постоянном электрическом поле (10 V/см). ДНК окрашивали бромидом этидия и визуализировали при освещении ультрафиолетовыми лучами с фильтром (305 нм) на трансиллюминаторе «УВТ-1» (Биоком, Россия). Документирование результатов проводилось с использованием цифровой видеокамеры «Minfron» и программы «Biofesf-D» (v1.22) (Биоком, Россия). В качестве маркеров-метчиков использована 123 пн — лестница «Promega» (США).
Статистическую обработку данных в соответствии с целью исследования проводили при использовании программы Statistica for Windows (v 5.11).
Результаты и их обсуждение
Проведенные исследования позволили установить факт наличия у протестированных бактерий фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности E.coli. Из представленных в таблице 1 данных видно, что клиническая форма инфекции мочевой системы прямо зависит от частоты встречаемости различных маркеров уропатогенности у выделенных штаммов. Так, достоверно чаще (р < 0,05), из мочи детей с пиелонефритом и циститом выделяли штаммы E.coli, несущие в своем геноме следующие маркеры патогенности: hly A, hly В, cnf-l, рарС и irp-2. Штаммы кишечной палочки, выделенной из мочи и фекалий детей с АБУ и фекалий детей с ДБК при условии стерильной мочи также имели определенный набор фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности. Однако он встречался значительно реже, чем при манифестных формах ИМВП. Из фекалий практически здоровых детей уропатогенные штаммы E.coli выделяли лишь в единичных случаях.
Рассмотрение патологии человека в рамках клинической микробиологии свидетельствует о серьезных качественных и количественных изменениях в структуре инфекционной заболеваемости, что в значительной степени связывают с изменением наших представлений о патогенности бактерий. В первую очередь это связано с фактом мобильности генетической основы патогенных свойств микроорганизмов, т. е. с наличием структурных и регуляторных генов, ассоциированных с патогенностью бактерий и сгруппированных в мобильные кластеры — «острова патогенности». Группы этих генов способны к горизонтальному и вертикальному перемещению, встраивание их происходит в строго определенные сайты бактериальной ДНК — «горячие точки» [9]. Полагают, что данный механизм изменения патогенности бактерий играет важную роль в формировании патогенных вариантов различных видов бактерий, в том числе эшерихий [1—5, 13—15].
С учетом вышесказанного, полученные данные могут рассматриваться в качестве дополнительного подтверждения этой гипотезы. Выявленная неоднородность по частоте встречаемости детерминант ОП у клинических штаммов E.coli, вероятно, является отражением определенных закономерностей, о сути которых пока приходится только догадываться. Среди обследованных нами уро-и копроштаммов E.coli, изолированных от детей с асимп-томатической бактериурией, набором специфических
Таблица 1. Частота обнаружения генов вирулентности (абс. %) у изолированных штаммов Escherichia coli (n = 176)
Вариант инфекции (количество изученных штаммов Е.соИ) Гены вирулентности
hlyA hlyB cnf-1 papC sfaG irp-2
Циститы, пиелонефриты (98) 58 (59 ± 9,8) 37 (38 ± 9,7) 63 (64 ± 9,5) 74 (76 ± 8,6) 15 (16 ± 7,2) 25 (26 ± 8,7)
АБУ (28) 6 (21 ± 15,3) 4 (14 ± 13) 3 (10 ± 11,3) 7 (25 ± 16,1) 3 (10 +11,3) 2 (7 ± 9,4)
АБУ + ДБК (30) 7(23 ± 15,2) 5 (17 ± 13,4) 3 (10 ± 10,6) 7 (23 ± 15,2) 4 (13 ± 12,2) 3 (10 ± 10,6)
Контрольная группа (20) 2 (10 ± 13,1) 1 (5 ± 9,4) 0 (0) 1 (5 ± 9,4) 2 (10 ± 13,1) 0 (0)
22
Äetckhe инфекции 3 • 2004
■ В. М. Бонларенко и лр. Маркеры уропатогенности Е. сои у летей с инфекцией мочевой системы
маркеров уропатогенности обладало лишь незначительное количество исследованной урофлоры, следовательно вероятность развития у таких пациентов клинически выраженных форм инфекций мочевой системы небольшая. Скорее всего, асимптоматическая бактериурия у большинства обследованных нами пациентов носила характер транзиторной, выступая в качестве дополнительного механизма элиминации кишечной микрофлоры, обуславливающей развитие ДБК. Это, соответственно, может определять дальнейшую тактику ведения таких детей.
Заключение
В результате проведенных исследований и анализа полученных данных представляется возможной следующая концептуальная модель механизма изменения патогенности у кишечной палочки: 1) поскольку гены тРНК и /5-элементы универсальны, то теоретически они определяют возможность передачи генов патогенности не только между штаммами одного вида, но и между штаммами различных видов; 2) кластерный характер генов ОП обеспечивает передачу не только структурных генов, но и генов-регуляторов, что, наряду с фланкированностью генами тРНК, предполагает генетическую возможность экспрессии признака; 3) существование универсальных механизмов транспорта биомолекул и его регуляции у бактерий делает теоретически возможной экспрессию бактериями одного вида генов, полученных от бактерий другого вида.
Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что в основе изменения патогенности Е.соИ лежит структурная модификация бактериальной ДНК, связанная с миграцией генетических детерминант ОП между бактериями. Особенности структурной организации этих мобильных генетических элементов определяют высокую вероятность их экспрессии, а обнаружение детерминант «островов патогенности» с помощью ПЦР, может свидетельствовать об этиопатогенетической значимости клинического изолята.
Литература:
1. Gene clusters encoding the cytotoxic necrotizing factor type 1, Prs-fimbriae and a-hemolysin from the pathogenicity island II of the uropathogenic Escherichia coli strain J96 / G. Blum,
V. Falbo, A. Caprioli, J. Hacker // Microbiol. Lett. — 1995. — Vol. 126. — P. 189—195.
2. Virulence factors of Escherichia coli isolated from patients with symptomatic and asymptomatic bacteriuria and neuropathic bladders due to spinal cord and brain injuries / R. A. Hull, D. Rudy, I. E. Wieser, W. H. Donovan // J. Clin. Microbiol. —
1998. — Vol. 36. — P. 115—117.
3. Johnson J. R. Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection // Clin. Microbiol. Rev. — 1991. — Vol. 4. — P. 80—128.
4. Johnson J. R. Extended virulence genotypes of Escherichia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise / J. R. Johnson, A. L. Stell // J. Infect. Dis. — 2000. — Vol. 181. — P. 261—272.
5. Virulence characteristics of Escherichia coli in acute bacterial prostatitis / K. Mitsumori et al. // J. Jnfect. Dis. — 1999. — Vol. 180. — P. 1378—1381.
6. Pewitt E. B. Urinary tract infection in urology, including acute and chronic prostatitis / E. B. Pewitt, A. J. Schaeffer // Infect. Dis. Clin. North. Am. — 1997. — 11(3). — P. 623—646.
7. Бондаренко В. М. «Острова» патогенности бактерий // ЖМЭИ. — 2001. — № 4. — С. 67—74.
8. Мавзютов А. Р. «Острова» патогенности условно-патогенных энтеробактерий / А. Р. Мавзютов, С. В. фиалкина, В. М. Бондаренко // ЖМЭИ. — 2002. — № 6. — С. 5—9.
9. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution / J. Hacker, G. Blum-Oeh-ler, I. Muhldorfer, H. Tschape // Mol. Microbiol. — 1997. — Vol. 23. — P. 1089—1097.
10. Reid G. The potential role ofprobiotics in pediatric urology // J. Urol. — 2002. — 168(4). — P. 1512—1517.
11. Бондаренко В. М. факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // ЖМЭИ. —
1999. — № 5. — С. 34—39.
12. Reid G. Probiotic agent to protect the urogenital tract against infection // Am. J. Clin. Nutr. — 2001. — 73(suppl). — P. 437—443.
13. Pyelonephritis caused by multiple clones of Escherichia coli, susceptible and resistant to co-amoxiclav, after a 45 day course of co-amoxiclav / V. Leflon-Guibout et al. // J. Antimi-crob. Chemother. — 2002. — Vol. 49. — P. 373—377.
14. Pap, papG and prsG DNA sequences in Escherichia coli from the fecal flora and the urinary tract / I. M. Johanson, K. Plos, B. I. Marklund, C. Svanborg // Microb. Pathog. — 1993. — Vol. 15. — P. 121—129.
15. Prevalence of the «high-pathogenicity island» of Yersinia species among Escherichia coli strains are pathogenic to humans / S. Schubert et al. // Infect. Immun. — 1998. — Vol. 66. — P. 480—485.
Каинико-лабораторная диагностика кишечных токсикозов у детей раннего возраста
Р. А. Дарджания, Р. К. Глааямова, Ф. Г. Ситдикова
Челябинская государственная медицинская академия
В статье приведены данные клинического наблюдения и результаты обследования 193 детей с синдромами токсикоза при острых кишечных инфекциях (ОКИ). Клинико-лабораторная диагностика включала выделение ведущих клинических симптомов при кишечных токсикозах и эксикозах, характеристику типов дегидратации в зависимости от степени обезвоживания организма
Ключевые слова: кишечный токсикоз, эксикоз, дети, дегидратация
Острые кишечные инфекции в настоящее время нередко являются причиной возникновения у детей неотложных состояний. Среди клинических синдромов
определяющих тяжесть ОКИ, токсикоз с эксикозом возникают чаще всего у детей раннего возраста [1, 2]. Значительные достижения в изучении нозологических
