Определение зеараленона амперометрическими биосенсорами на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.866

Х. Май Тхи Тхань, Э. П. Медянцева, Р. М. Варламова,

Г. Р. Сахапова, О. В. Николаева

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЗЕАРАЛЕНОНА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМИ БИОСЕНСОРАМИ

НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ ЭЛЕКТРОДОВ

Ключевые слова: Зеараленон, микотоксины, амперометрический биосенсор, холинэстераза, цистеиндесульфгидраза, щелочная фосфатаза, тирозиназа, многослойные и однослойные углеродные нанотрубки, зерновые культуры.

Предложены амперометрические биосенсоры на основе планарных платиновых электродов, в том числе модифицированные многослойными и однослойными углеродными нанотрубками, и иммобилизованной холинэстеразы, цистеиндесульфгидразы, щелочной фосфатазы и тирозиназы для определения зеараленона в области концентраций 1 х10'5—1 х10~(11'12)моль/л. Действие биосенсоров основано на ингибирующей способности зеараленона. Показана возможность определения зеараленона в зерновых культурах на примере образцов сельскохозяйственных кормов и кукурузы, произведенных во Вьетнаме, на уровне значений ПДК и ниже.

Keywords:Zearalenone, mycotoxins, amperometric biosensor, cholinesterase, L-Cysteine desulfhydrase, alkaline phosphatase, tyrosinase, multi-layer and single-layer carbon nanotubes, cereal crops.

Proposed amperometric biosensors based on platinum screen-printed electrodes including the modified multi-layer and single-layer carbon nanotubes and the immobilized cholinesterase, L-cysteine desulfhydrase, alkaline phosphatase and tyrosinase was studied for the determination of zealenone within the concentration range of J*J0~5- JxJ0~(11'12) mol/l. Function of the biosensors was established on the inhibiting properties of zearalenone. Determination of zearalenone in cereal crops, in samples of agricultural feed and corn produced in Viet Nam were carried out at the permitted concentration range and lower.

Введение

Микотоксины относятся к одной из наиболее опасных групп токсичных соединений, представляющих угрозу здоровью населения. Поскольку эти соединения могут находиться во многих продуктах питания, кормах для сельскохозяйственных животных, вполне обоснован интерес исследователей к разработке современных способов их определения.

Среди микотоксинов зеараленон представляет особый интерес, потому что обладает эстрогенными и тератогенными свойствами, а также антибактериальным действием в отношении грамположительных бактерий. Зеараленон и его производные (к этой группе относят 15 микотоксинов) продуцируются грибом Fusarium graminearum. Продуценты зеараленона поражают, главным образом, грубые корма, богатые клетчаткой. Поэтому важен контроль за его содержанием в продуктах питания и кормах, загрязненных микотоксинами. Этим объясняется актуальность разработки различных современных способов их определения.

Наиболее часто для определения микотоксинов, и зеараленона в частности, используют различные варианты хроматографии. Наиболее распространенными из них в настоящее время являются методы с использованием тонкослойной, жидкостной [1], высокоэффективной жидкостной, газовой хроматографии, и их сочетания, в комбинации с масс-

спектрометрической детекцией [2,3] и флуоресценцией [4].

В настоящее время значительное внимание уделяется разработке ферментных сенсорных устройств, которые позволяют проводить

экспрессное определение загрязнителей в полевых условиях и не требуют высококвалифицированного персонала. Анализ литературных данных показывает, что использование биосенсорных технологий имеет определенные преимущества перед другими вариантами методов.

Следует отметить и тот момент, что примеры разработок биосенсоров, а именно ферментных сенсоров для определения микотоксинов пока очень немногочисленны. Причем используется ограниченный круг ферментов. В полной мере это относится к определению зеараленона. Примеры ферментных сенсоров для идентификации этого микотоксина носят единичный характер и основаны они на использовании других ферментов [5].

Для улучшения аналитических и операционных характеристик биосенсоров, что является одним из их проблемных свойств, в настоящее время все чаще используют модификацию рабочей поверхности первичных преобразователей углеродными нанотрубками. Углеродные нанотрубки (УНТ) рассматриваются, как новый вид подложек для электродов, благодаря небольшому размеру частиц, высокой химической устойчивости и большому отношению поверхность :объем; поэтому модификация поверхности электродов углеродными

нанотрубками превратилась в новую область исследований, на которой сфокусировано внимание, в частности, электрохимиков. Благодаря своим уникальным электронным и оптоэлектронным свойствам, УНТ являются наиболее перспективными материалами для огромного множества приложений в композитных материалах, химических источниках тока, в электронике и т.д.[6,7].

В рамках данной работы для определения зеараленона предложены новые амперометрические биосенсоры на основе планарных (печатных) платиновых электродов, модифицированные многослойными и однослойными УНТ, и иммобилизованными холинэстеразой,

цистеиндесульфгидразой, щелочной фосфатазой, тирозиназой.

Цель работы: Разработка новых

амперометрических биосенсоров на основе модифицированных углеродными нанотрубками электродов и иммобилизованных ферментов: холинэстеразой (ХЭ), цистеиндесульфгидразой (ЦДГ), шелочной фосфатазой (ЩФ) и тирозиназой (ТЗ). Оценка аналитических возможностей определения зеараленона амперометрическими биосенсорами с целью использования результатов работы для определения его содержания в зерновых культурах

Экспериментальная часть

Аппаратура и оборудование

Основой биосенсоров служила система планарных электродов, состоящая из рабочего и вспомогательного электродов, а также электрода сравнения (фирма BVT Technologies, Брно, Чехия). Материалом поверхности рабочего электрода, на который иммобилизовали фермент, являлась платиносодержащая паста. Из платины изготовлен и вспомогательный электрод, электрод сравнения - из серебра. Объем рабочей ячейки системы составлял 200 мкл. Все измерения с использованием этих электродов проводили с помощью многоцелевого электрохимического детектора "МЕВ" (Чехия) с компьютеризированным управлением.

Реактивы

В качестве субстратов использовали бутирилтиохолин хлорид (БТХХ) (ICN Biomedicals Inc., США), L-цистеин (Sigma), 1-нафтил фосфата мононатриевую соль марки “ЧДА” (“Диа” М, Россия) и фенол марки “Х.Ч.”, растворы которых готовили по точной навеске в рабочем буферном растворе и использовали в течение не более трех часов. Применяли бутирилхолинэстеразу сыворотки крови лошади, активностью 30АЕ/мг,

изготовленную НПО “Биомед” (Россия, г. Пермь) и щелочную фосфатазу, активностью 1000 АЕ/мг (Sigma, Германия). Как источник L-

цистеиндесульфгидразы использовали гомогенат из проростков зерновых культур и листьев огурца. В качестве консерванта применяли сахарозу. Тирозиназу получали из тканей грибов (шампиньонов). Применяли 1%-ный раствор глутарового альдегида фирмы "ICN" и бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы “Reanal” (Венгрия).

В работе использовали многослойные УНТ (МУНТ) и однослойные (ОУНТ) с линейными размерами от 2-6 нм до 10-15 нм и от 1,2 до 1,5 нм производства Sigma-Aldrich.

Использовали хроматографически чистый препарат зеараленона (раствор зеараленона в

бензоле) из государственных стандартных образцов (изготовитель: ГНУ ВНИИВСГЭ, г. Москва). Для получения рабочего раствора из стандартного образца зеараленона проводили вакуумную отгонку бензола при комнатной температуре. Полученный препарат зеараленона взвешивали и использовали для приготовления рабочих растворов путем их растворения в 1 мл ацетонитрила, а затем в бидистиллированной воде.

Подготовка углеродных нанотрубок

Для модификации рабочей поверхности биосенсоров использовали МУНТ или ОУНТ, которые предварительно очищали от остаточных количеств оксидов переходных металлов, а также аморфного углерода, обработкой растворами кислот (1М HNO3: 3M H2SO4), а затем ультразвуком, используя ультразвуковую ванну (WiseClean модель WUC-A03H, DAIHAN Scientific Co.Ltd, Korea), с частотой 40 КГц в течение 2-4 час. до получения гомогенного раствора. Затем отделяли УНТ от маточного раствора с помощью центрифуги, многократно (5-6 раз) обрабатывали водой до нейтральной реакции (до pH 7,0) [8]. Обработанные УНТ высушивали до постоянной массы и взвешивали. Затем солюбилизировали МУНТ в N,N-диметилформамиде (ДМФА) или растворе хитозана (ХЗ) с помощью ультразвука до получения гомогенного раствора с концентрацией 1 мг/мл. Полученные растворы УНТ использовали для модификации поверхности электродов.

Получение биосенсоров

А). Для получения биочувствительной части ХЭ-, ЦДГ-, ЩФ- и ТЗ-биосенсоров на поверхность рабочего электрода наносили раствор, содержащий ферментные препараты. Для этого готовили смесь, содержащую раствор фермента с концентрацией 20 нкат/мкл, раствор БСА (50 мг/мл), фосфатный буфер (50мМ, pH 7,0), 1%-ный раствор глутарового альдегида и дистиллированную воду. Глутаровый альдегид вносили в последнюю очередь, и после энергичного перемешивания на поверхность электродов наносили по 1 мкл этой смеси.

Б) Для получения нового варианта биосенсоров использовали электроды с модифицированной УНТ поверхностью рабочего электрода. Для этого наносили по 0,5 мкл 1 мг/мл раствора МУНТ или ОУНТ на поверхность электродов. Затем электроды высушивали в течение 1-2 час. при комнатной температуре и промывали фосфатным буфером (pH 7,0) 5 мин. После этого на поверхность рабочего электрода наносили 1 мкл смеси, содержащей фермент и остальные компоненты, т.е. смесь, приготовленную аналогично варианту А.

Полученные таким образом биосенсоры оставлялись на ночь в закрытой чашке Петри при +4°С. На следующий день биосенсоры промывали водой, высушивали на воздухе и в дальнейшем хранили в холодильнике.

При модификации поверхности рабочего электрода варьировали количество раствора УНТ

(т.е. количество УНТ на единицу поверхности электрода от 1 до 0,2 мкл), наносимого на поверхность планарного электрода.

Экспериментально было установлено, что 0,5 мкл раствора УНТ позволяет получить более воспроизводимую однородную рабочую поверхность электрода, обеспечивающую получение достаточного по величине аналитического сигнала, поэтому в дальнейшем использовали именно такое количество раствора УНТ для модификации поверхности.

Биосенсоры, хранящиеся в холодильнике, сохраняют каталитическую активность фермента в течение месяца с погрешностью не более 5-6%.

Результаты и их обсуждение

Природа формирования аналитического сигнала биосенсоров Холинэстеразный биосенсор

Известно, что ХЭ катализирует реакцию гидролиза тиохолиновых эфиров [9].

Один из специфичных субстратов БТХХ подвергается холинэстеразному гидролизу по следующему уравнению:

СзН7С(0)8СН2СН2М+(СНз)зСГ + Н2О ^ С3Н7СООН + НБСН2СН2М+(СНз)зСГ

Продукт реакции - тиохолин - электрохимически активен. На печатном платиновом электроде тиол подвергается процессу окисления: 2НБСН2СН2М+(СНз)з ^ 2Н+ + 2е +

(СНз)зМ+СН2СН288СН2СН21\1+(СНз)з

Наибольшее значение тока наблюдается при потенциале +0,55 В.

Биосенсор на основе щелочной фосфатазы Известно, что под действием щелочной фосфатазы 1-нафтил фосфат натрия подвергается биокаталитическому гидролизу с образованием продукта 1-нафтола по схеме:

щф ^

------=»• ♦ М1Н;РО;

ей

Н..О

? .п

МаО-Р—ОН

о

Продукт ферментативной реакции электрохимически активен, подвергается процессу окисления на платиносодержащих электродах, что находит отражение в виде соответствующей волны на вольтамперограмме. Используемая концентрация субстрата 1-нафтил фосфата составила 1х10"3 моль/л. Волну окисления 1-нафтола снимали при потенциале Е=+0,6В.

Цистеиндесульфгидразный биосенсор

Изучение процессов окисления цистеина на платиновом планарном электроде показало, что на фоне фосфатного буферного раствора с рН 7,6 наблюдается пик при потенциале 0,7В, высота которого зависит от концентрации цистеина в интервале 10-2-10-4М. Установлено, что удобный для измерения аналитический сигнал, наблюдается при использовании концентрации субстрата 1х10"3 М.

ЦДГ

Н00ССН(ЫН2)СН28Н + Н2О ^ ЫНз + Н28 + СНзС(0)С00Н (Пируват)

2Н00ССН(ЫН2)СН28Н ^ 2Н+ + 2е +

Н00ССН(ЫН2)СН288СН2СН(ЫН2)С00Н

(Дисульфид)

Рис. 1 - Вольтамперограммы окисления раствора 1х10"3М цистеина на фоне фосфатного буферного раствора с рН 7,6 (1) в присутствии ЦДГ (2) и в отсутствии ЦДГ (3) проростков пшеницы

Тирозиназный биосенсор Из литературных данных известно, что под действием тирозиназы фенол подвергается биокаталитическому гидролизу с образованием продукта хинона по схеме [10]:

Электрохимическая реакция:

он О

он

+ 2е + 2Н+

На тирозиназном биосенсоре в области потенциалов 0,65 - 0,70В наблюдается

дополнительный пик, который можно отнести к процессу окисления выделяющегося пероксида водорода.

Согласно литературным данным [11], электрохимическое окисление пероксида водорода протекает по схеме при потенциале 0,7В:

Н2О2 = О2 + 2Н+ + 2е Изучение влияния зеараленона на каталитическую активность иммобилизованных ферментов

Действия зеараленона на

иммобилизованные ХЭ, ЩФ и ТЗ, входящие в состав биочувствительной части

амперометрических биосенсоров показало, что в их присутствии наблюдается уменьшение величины аналитического сигнала по сравнению с сигналом, полученным в отсутствие микотоксина. В случае ЦДГ наблюдается ток, больший по величине тока окисления цистеина в присутствии иммобилизованного фермента, но меньший тока окисления цистеина в отсутствии фермента, т. е. зеараленон оказывает ингибирующее действие на иммобилизованные ферменты в составе биосенсоров.

Аналитические характеристики

предлагаемых биосенсоров приведены в таблица 1.

Таблица 1 - Аналитические возможности

амперометрических биосенсоров в определении зеараленона (n = 5, P = 0,95)

Интервал рабочих концентра ций моль/л Уравнение градуировочного графика 1= (А± 5)+ (В± ö)x(-lg C), r сн, моль/л

А± б (В± б) R

ХЭ биосенсор - МУНТ в ДМФА

1х10-5 -1х10-11 27±1 -2,1±0,1 0,9973 8х10-12

ЦДГ биосенсор - МУНТ в ДМФА

1х10-5 -1х10-10 41±1 -3,0±0,1 0,9928 5х10"Г1

ЩФ биосенсор - МУНТ в ДМФА

1х10-5 -1х10-11 53±1 -3,5±0,2 0,9953 5х10-12

ТЗ биосенсор - МУНТ в ДМФА

1х10-5 -1х10-11 73±3 -5,8±0,3 0,9898 8х10-12

ТЗ биосенсор - МУНТ в хитозане

1х10-5- 8Х10"12 51,9± 1,3 -3,9±0,2 0,9932 5Х10-12

ТЗ биосенсор - ОУНТ в хитозане

5х10-6 -1х10"11 59+4 -4,6+0,5 0,9800 8х10-12

Степень (процент) ингибирования (% ингибирования = [(10-1р)Л0]х100 -где 10, 1р -значения тока в отсутствии и присутствии ингибитора) при действии в рассматриваемой области концентраций зеараленона на ХЭ составляет от 91,0+1,0 % до72,0+0,6 %, на ЦДГ - от 96,0+1,0 % до70,0 +1,0% , на ЩФ - от 91,00+0,2% до 73,0+0,5% и на ТЗ - от 91,3+0,7% до 67,5+0,6%

Использование модифицированного МУНТ-ХЭ биосенсора позволило расширить диапазон определяемых концентраций и снизить сн по сравнению модифицированными МУНТ в ДМФА аналогами.

Правильность определения микотоксинов в области линейной зависимости аналитического сигнала от их концентрации с помощью ферментативных биосенсоров и ИФС оценена способом "введено-найдено" (табл.2).

Кинетические параметры реакции ферментативного превращения фенола в отсутствие ингибитора составляют: Кт(каж.) = (32,7±0,5)х10" моль/л, Утах = (6,4±0,2)х10-6 моль/лхс. В

присутствии зеараленона при концентрации 10"7М: Кт(каж.) = (16,5±0,3)х10-5 моль/л, Утах=(3,1±0,1)х10"6, т. е. наблюдается уменьшение этих величин, что характерно для двупараметрически

рассогласованного ингибирования.

8 1

К:=(2,4+0,1)х10" моль" , где К - константа ингибирования.

Таблица 2 - Результаты определение

зеараленона предлагаемыми биосенсорами (n =5, P = 0,95)

Введено, моль/л Найдено, моль/л Sr

ХЭ биосенсор - МУНТ в ДМФА

5х10-7 (5,2±0,2) х10-7 0,038

7х10-8 (6,8±0,3) х10-8 0,044

ЦДГ биосенсор - МУНТ в ДМФА

5х10-7 (4,8±0,2) х10-7 0,040

5х10-8 (5,3±0,3) х10-8 0,056

ЩФ биосенсор - МУНТ в ДМФА

5х10"7 (5,1±0,2) х10-7 0,039

8х10-8 (7,7±0,3) х10-8 0,039

ТЗ биосенсор - МУНТ в ДМФА

5х10-7 (5,2±0,1) х10-7 0,020

5х10-8 (5,1±0,2) х10-8 0,039

ТЗ биосенсор - МУНТ в хитозане

5х10-6 (4,8±0,2)х10-6 0,043

6х10-7 (6,3±0,3)х10-7 0,049

Определение зеараленона в зерновых культурах

Полученные результаты показывают, что предлагаемые ферментативные электроды могут быть использованы для определения содержания зеараленона в пищевых продуктах.

Из литературы известно, что зеараленон и его производные, как продуценты плесневого гриба вида Fusarium graminearum. Они особенно широко распространены в пищевых продуктах, произведённых в умеренных и теплых странах: кукуруза и его продукты, также в меньшей степени, ячмень, овес, пшеница, сорго, просо и рис [12, 13].

Поэтому была сделана попытка определить именно данный токсин в зерновых культурах Вьетнама, таких как кукуруза, корма для сельскохозяйственных животных (отруби зерновых культур).

Методика определения зеараленона в образцах

Навеску образца (2г.) переводили в порошковообразное состояние, используя блендер фирмы «Jiplai», который суспензировали в смеси этанола и воды (7:3) или ацетонитрила и воды (3:1), общий объем смеси 10 мл. Затем смесь центрифугировали в течение 20 мин. при скорости 7 тысяч оборотов в мин., надосадочную жидкость использовали для приготовления рабочих водных растворов путем последовательного разбавления для последующего определения зеараленона с помощью биосенсора на основе тирозиназы, модифицированного МУНТ.

Содержание зеараленона в образце кукурузы провинция Зиен Чау составляет 0,004 мг/кг, в образце корма для животных из отрубей зерновых культур - 0,001 мг/кг.

Полученные результаты показывают, что амперометрический тирозиназный биосенсор позволяет оценивать содержание зеараленона в

зерновых культурах на уровне и ниже ПДК (Для

Вьетнама ПДК = 1,0 мг/кг).

Литература

1. De Andrés F. Determination of zearalenone and its metabolites in urine samples by liquid chromatography with electrochemical detection using a carbon nanotube-modified electrode / F. de Andrés, M. Zougagh, G. Castaneda, A. Ríos // J. Chromatogr.A. - 2008. - Vol. 1212. - Р. 54-60.

2 Demyttenaere J.C.R. Monitoring and fast detection of mycotoxin-producing fungi based on headspace solid-phase microextraction and headspace sorptive extraction of the volatile metabolites / J.C.R. Demyttenaere, R.M. Morina, P. Sandra // J. Chromatogr. A.- 2003. - Vol. 985, № 1-2. - P. 127-135.

3. Tanaka H. Development of a liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometric method for the simultaneous determination of trichothecenes, zearalenone and aflatoxins in foodstuffs / H. Tanaka, M. Takino, Y. Sugita-Konishi, T. Tanaka // Rapid Commun Mass Spectrom. -2006. -Vol. 20, № 9. -Р. 1422-1428.

4. Rahmani A. Validation of the procedure for the simultaneous determination of aflatoxins ochratoxin A and zearalenone in cereals using HPLC-FLD / A. Rahmani, S. Jinap, F. Soleimany // Food Additives and Contaminants.-2010. -Vol.27, № 12. - P.1683-1693.

5. Valimaa A.L. A novel biosensor for the detection of zearalenone family mycotoxins in milk / A.L Valimaa, T.Kivisto, I. Piia, T.Matti // J. Microbiolog. Methods. -2010 - Vol. 80. - Р. 44-48.

6. Yuyang L. Decoration of carbon nanotubes with chitosan / L.Yuyang, T.Jing, X. Chen, J.H. Xin // Carbon. - 2007. -Vol. 45, № 6, -P. 1212-1218.

7. Дин К. Иследование электрохимического поведения

Eu3+ на стеклоуглеродном электроде,

модифицированном многостенными углеродными

нанотрубками и лаурилсульфатом натрия, методом циклической вольтамперометрии / К. Дин, В. Цай, К. Ван // Электрохим. -2010. -Т.46, № 2. - С. 188-195

8. Ajeet K. Carbon nanotubes - chitosan nanobiocomposite for immunosensor / K. Ajeet , R. S. Pratima, M.K. Pandey , K. Kaneto, S. Ahmad, D. Bansi Malhotra // Thin Solid Films. -2010. - Vol. 519. - P.1160-1166

9. Медянцева Э.П. Ферментный электрод на основе

иммобилизованной холинэстеразы для определения потенциальных загрязнителей окружающей среды / Э.П. Медянцева, Г.К. Будников, С.С. Бабкина //

Журн.аналит.химии. - 1990. -Т.45, № 7. -С.1386-1389.

10. Евтюгин, Г.А. Основы биосенсорики : учебное пособие / Г.А Евтюгин, Г.К Будников, Е.Е. Стойкова // -Казань, - 2007. - 82с.

11. Кулис, Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю. Кулис // Вильнюс.: Мокслас. - 1981. - 200c.

12. Panini N. V.. Immunosensor in a continuous-flow/stopped-flow systems / N. V. Panini , F. A. Bertolino, E. Salinas, A. M. Germán , R. Julio // J. Biochem. Engineering -2010. - Vol. 51. - P.7-13.

13. Nguyén T. C. Nghien cúu múc do o nhiem nam moc vá doc to cüa chúng tren ngo gao Viet Nam vá bien pháp phong trn / T. C. Nguyen - Luán án tién sí, -BH Tong hop Há Noi. -1998. -131 trang.

© Х. Май Тхи Тхань - асп. каф. аналитической химии К(П)ФУ, [email protected] ;Э. П. Медянцева - д-р хим. наук, проф. той же кафедры, [email protected]; Р. М. Варламова - канд. хим. наук, зав. лаб. той же кафедры, [email protected]; Г. Р. Сахапова - студ. К(П)ФУ; О. В. Николаева - студ. К(П)ФУ.