CC BY
88
УДК 543.866
Д. В. Брусницын, Э. П. Медянцева, Р. М. Варламова,
М. А. Байбатарова
НОВЫЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ МОНОАМИНООКСИДАЗНЫЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МНОГОСЛОЙНЫМИ И ОДНОСЛОЙНЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ НАНОТРУБКАМИ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИДЕПРЕССАНТОВ
Ключевые слова: биосенсор, моноаминооксидаза, углеродные нанотрубки.
Предложены новые амперометрические моноаминооксидазные биосенсоры на основе печатных графитовых электродов, модифицированных такими наноструктурированными материалами как многослойные (МУНТ) и однослойные (ОУНТ) углеродные нанотрубки, суспензированных в различных растворителях (ДМФА, Хитозан) и рассмотрены их аналитические возможности.
Keywords: biosensor, monoamine oxidase, carbon nanotubes
Proposed new amperometric monoamine oxidase biosensors on the bases of graphite screen-printed electrode modified by these nanostructural materials like multi-layer and single-layer carbon nanotubes which were suspended in different solvents (DMF, Chitosan) and their analytical capabilities were reviewed.
Введение
Антидепрессанты (АД) как лекарственные препараты строгого учета требуют чувствительных и селективных способов определения их содержания как для контроля качества фармацевтической промышленности и выявления фальсифицированной продукции, так и для определения терапевтических доз в биологических жидкостях. Один из путей решения этой проблемы - разработка новых биосенсоров, обладающих заданными свойствами. Использование таких биосенсорных устройств обеспечивает необходимую чувствительность и, в отдельных случаях, селективность определений практически без предварительной пробоподготовки. Для определения лекарственных препаратов в различных матриксах активно разрабатываются биосенсорные технологии, как более быстрые, гибкие, и, в ряде случаев, менее трудоемкие, чем традиционные (например, хроматографические) методы определения лекарственных препаратов. В то же время имеются лишь единичные публикации применения амперометрических [1, 2] и
потенциометрических [3] моноаминооксидазных биосенсоров.
В настоящее время литература по использованию УНТ как модификатора поверхности различных электродов весьма обширна [4 - 12]. Особенно часто такой прием используют при разработке биосенсоров для определения глюкозы [4
- 9]. Имеется литература и по биосенсорам для определения пероксида водорода [10], оксалатов [11] и холестерола [12].
Цель исследования заключалась в разработке новых амперометрических биосенсоров на основе печатных графитовых электродов,
модифицированных многослойными (МУНТ) и однослойными (ОУНТ) углеродными нанотрубками, суспензированных в диметилформамиде (ДМФА) и хитозане, и иммобилизованной моноаминооксидазы, для контроля содержания лекарственных веществ с антидепрессивным действием в лекарственных
формах (препаратах).
Экспериментальная часть
Аппаратура и оборудование: Основой моно-аминоксидазных биосенсоров служила система, состоящая из рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения, полученная на полимерной подложке методом печатных технологий (фирма «Элком», Россия). Материалом поверхности рабочего электрода, на которой иммобилизуются модификатор и фермент, являются графитовые чернила. Вспомогательный электрод изготовлен также из графита. Электрод сравнения - AgCl/Ag. Объем рабочей ячейки системы составлял 2,0 мл. Все измерения с использованием этих электродов проводили с помощью потенциостата/гальваностата ^Autolab type Ш (фирма «Eco Chemie B.V.», Netherlands).
Реактивы: В качестве субстратов МАО использовали 1х10'2 моль/л растворы серотонина, ти-рамина, допамина и адреналина. Растворы серотонина и тирамина готовили по точной навеске из соответствующих препаратов.
Серотонин адипинат был производен ЗАО «ЛОРР» (Россия).
Тирамин был изготовлен: ООО «Клиника Института биорегуляции и геронтологии» (г. Санкт-Петербург, Россия).
Раствор допамина готовили из фармпрепарата для инъекций («Дофамин-Ферейн» -раствор для инъекций 4%).
Раствор адреналина также готовили из фармпрепарата для инъекций (производитель фирма «Берингер Ингельхайм Фарма ГмбХ и Ко»). Международное название - эпинефрин.
Для приготовления буферных растворов применяли гидрофосфат натрия (Na2HPO4) и дегидрофосфат натрия (Na2HPO4) марок «ч» и «чда» (ЗАО «Лаверна», Россия).
Применяли 1%-ный раствор глутарового альдегида фирмы «ICN» и бычий сывороточный альбумин (БСА) фирмы «Reanal» (Венгрия).
В качестве объектов анализа использовали следующие лекарственные препараты: имипрамин ^-(З-диметиламинопропил)-иминодибензил) («Sig-ma-Aldrich») и лекарственный препарат (в таблетках) «Меллипрамин», изготовленный ОАО
«Фармацевтический завод ЭГИС» (Венгрия,
Будапешт); лекарственное соединение тианептин натрия («Sigma-Aldrich») и лекарственный препарат «Коаксил» произведенный лабораторией «Сервье Индастри» (Франция); моклобемид (4-Хлор-N-(2-морфолино-4-этил)бензамид) («Sigma-Aldrich») и лекарственный препарат (в таблетках) «Аурорикс», изготовленный ООО «Ф.Хоффман-Ля Рош» (Швейцария); лекарственное соединение - афобазол («Sigma-Aldrich») и лекарственный препарат «Афобазол», изготовленный ОАО «Фармстандарт -Лек. средства» (г. Курск, Россия).
Рабочие растворы нужной концентрации готовили путем минимального количества последовательных разбавлений их исходных водных растворов.
Фоном служил фосфатный буферный раствор (ФБ) pH (7,0±0,2), который готовили из препаратов высокой чистоты. Значения рН водных растворов определяли рН-метром рН-150 со стеклянным электродом, градуированным по стандартным буферным растворам. В работе была использована центрифуга марки Centrifuge CM-50, Россия.
Для модификации поверхности электродов применяли МУНТ с линейными размерами от 2-6 нм до 10-15 нм и ОУНТ с линейными размерами 1,2-1,5 нм производства «Sigma-Aldrich».
Подготовка углеродных нанотрубок: УНТ очищали от остаточных количеств оксидов переходных металлов, а также аморфного углерода, диспергированием в растворах концентрированных кислот в соотношении 1:3 (HNO3:H2SO4) [13] с помощью ультразвука (УЗ) в течение 1-2 ч., до получения гомогенного раствора при температуре 75 0С. УНТ сушили до постоянной массы и взвешивали. Предварительно готовили раствор хитозана в 2% растворе уксусной кислоты. Затем солюбилизировали УНТ в
0,5% растворе хитозана или ДМФА с помощью УЗ, до получения однородной дисперсии. Однородность использу-емых для модификации поверхности электродов растворов МУНТ и ОУНТ поддерживали периодической (не менее раза в месяц) обработкой УЗ.
Полученную дисперсию УНТ наносили на электрод и сушили при 20 оС не менее суток.
Электрохимическую активацию поверхности УНТ проводили в растворе 0,5 М Na2SO4 в течение 10 мин. в интервале потенциалов от 0 до 1,0 В при скорости наложения потенциалов 100 мВ/с.
Получение биосенсоров: Для получения био-чувствительной части сенсора на поверхность рабочего электрода наносили МАО, полученную из мозга человека. Для этого готовили смесь, содержащую 30 мкл раствора фермента, раствор БСА (50 мг/мл), фосфатный буферный раствор (50 мМ, pH=7.5), 100 мкл дистиллированной воды и 1%-ный раствор глу-тарового альдегида. Глутаровый альдегид вносили в последнюю очередь, и после энергичного перемеши-
вания на поверхность электродов наносили по 1 мкл этой смеси. Полученные таким образом биосенсоры оставляли на ночь в закрытой чашке Петри при t=+4°C На следующий день биосенсоры промывали водой, оставляли для высушивания на воздухе и в дальнейшем хранили в холодильнике при t=+4°C
Электрохимическую стабилизацию и очистку поверхности электрода проводили путем циклического изменения потенциала, для этого снимали 5-7 циклических вольтамперограмм в диапазоне потенциалов от 0 до 1000 мВ в растворе
0,01 М KCI при скорости развертки 100 мВ/с.
Результаты и их обсуждение
УНТ в настоящее время - один из самых общепризнанных материалов для совершенствования свойств существующих биосенсоров и при разработке новых. Сочетание наноматериалов с биомолекулами (ферментами, матричными материалами биологического происхождения) приводит к созданию биокомпозитов, обладающих специфическими свойствами: сохранению свойств и преимуществ отдельных компонентов и возможностью более глубокой модификации поверхности [4].
Нами разработаны моноаминооксидазные биосенсоры на основе графитовых screen-printed электродов и иммобилизованной моноамино-оксидазы (МАО) - фермента класса аминооксидаз [14]. Использовали печатные электроды с модифицирующими покрытиями, полученными с применением нанотехнологий: на рабочую
поверхность графитовых электродов наносили суспензию МУНТ или ОУНТ, полученную в диметилформамиде или хитозане.
Природа формирования аналитического сигнала биосенсоров: В основу функционирования биосенсоров положены ферментативная реакция окислительного дезаминирования моноаминов (уравнение 1) и реакция электроокисления пероксида водорода как продукта соответствующей реакции (уравнение 2):
В качестве аналитического сигнала использовали ток окисления пероксида водорода при потенциале 0,65-0,7 В. Установлено, что такие лекарственные соединения как трициклические имипрамин и тианептин, а также моклобемид и афобазол проявляют свойства ингибиторов МАО, что отражается в уменьшении величины аналитического сигнала (рис
1, кривая 2).
Н2О2 = О2 + 2Н+ + 2е (2)
Условия функционирования биосенсоров и получение максимального аналитического сигнала: концентрация субстратов 1х10"3 М на фоне фосфатного буферного раствора при рН 7,0±0,2. Постоянное значение тока устанавливается примерно через 10 мин.
-0,004-1--------,------,-------1------.-------,------.-------,------,-------,------,-------1
0 200 400 600 800 1000
Е, гпУ
Рис. 1 - Вольтамперограммы, полученные на МАО биосенсоре на основе МУНТ:1) ФБ (pH 7,0 и С = 0,067 М); 2) ФБ (pH 7,0 и С = 0,067 М) в присутствии тирамина (С= 1*10-3 моль/л) и имипра-мина (С= 1*10-6 моль/л); 3) ФБ (pH 7,0 и С = 0,067 М) в присутствии тирамина (С= 1*10-3 моль/л)
Аналитические возможности моноамино-оксидазных биосенсоров рассмотрены на примере определения АД разного строения: моклобемида и афобазола - обратимо ингибирующие МАО, трицик-лических АД - имипрамина и тианептина - ингибиторов обратного захвата моноаминов.
Лучшие аналитические характеристики наблюдались в случае МАО-биосенсоров, модифицированных раствором МУНТ в хитозане (табл. 1). В этом случае линейная зависимость между концентрацией АД и величиной аналитического сигнала (ток окисления пероксида водорода) наблюдается в наиболее широком концентрационном диапазоне от пх10"4("5) до пх10-9(-10) моль/л, улучшается коэффициент корреляции, снижается и нижняя граница определяемых концентраций (сн).
Таблица 1 - Аналитические возможности МАО-биосенсоров, модифицированных растворами МУНТ в различных растворителях в определе-
-3
нии имипрамина. Субстрат-адреналин с С=1х10" моль/л, п=5, P=0,95
Область рабочих концентраций, моль/л Уравнение градуировочной зависимости I* = ^±5) + ДО5№ C моль/л
(A±б) (B±б) г
Суспензия МУНТ в растворителе - ДМФА
1х10-5- 3х10-9 (137±13) (15±1) 0,9869 1х10-9
Суспензия МУНТ в растворителе - Хитозан
5х10-4- 3х10-9 (135±6) (18 ±1) 0,9949 9х10-10
Наиболее широкий диапазон концентраций, для биосенсоров модифицированных МУНТ, при определении афобазола наблюдается при использовании фермент-субстратной системы МАО-серотонин и дофамин - 1х10- -1х10- моль/л, а для тианептина - при использовании фермент-
субстратной системы МАО-адреналин и дофамин -
1х10- -1х10- моль/л. Наиболее низкие значения сн
при определении афобазола наблюдаются в системе
МАО-серотонин и МАО-дофамин (2,8-3,1)х10-10
моль/л, для тианептина - в системах МАО-10
адреналин (4,5x10 моль/л) и МАО-серотонин
(4,Зх10-10 моль/л).
I =^(3x100 (Ip= Iо-IS) (IS - ток в присутствии субстрата и АД; !о - ток в присутствии только одного субстрата).
Полученные результаты позволили выявить наиболее эффективные системы фермент-субстрат-АД (исходя из 50%-ной ингибирующей способности веществ) для биосенсоров на основе МУНТ. Для определения моклобемида и афобазола лучше использовать серотонин, для определения имипрамина -адреналин, для определения тианептина - дофамин. Полученные результаты хорошо согласуются в отдельных случаях с литературными данными [15] (табл. 2).
Предложен еще один вариант модификации поверхности электродов за счет использования биокомпозитов ОУНТ/хитозан, на которые был нанесен фермент МАО. Сочетание наноматериалов с биомолекулами (хитозан) и моноаминооксидазой, привело к созданию биокомпозитов, позволяющих улучшить некоторые операционные характеристики биосенсоров: повысить устойчивость фермента к вымыванию, сохранить более высокую каталитическую активность фермента, уменьшить погрешность параллельных определений.
Для биосенсоров модифицированных ОУНТ наиболее широкий диапазон рабочих концентраций 1х10-4-1х10-9 моль/л наблюдается для афобазола и тианептина при использовании фермент-субстратной системы МАО-адреналин. При определении афобазола сн составляет 6,7х10-10 моль/л, для тианептина в системе МАО-серотонин сн = 4,2х10-10 моль/л.
Таблица 2 - Влияние сродства антидепрессантов к ИМАО в присутствии специфических мембранных переносчиков нейромедиаторов (моноаминов)
Субстрат 50%-ингибиторная концентрация (!50), моль/л
Афобазол Тианептин
Серотонин -6 0,81х10 -6 0,99х10
Адреналин -5 0,83х10 -6 0,34х10
Дофамин -6 0,93х10 -6 0,26х10
Тирамин -5 0,83х10 -6 0,67х10
Согласно значениям кинетических параметров (К^цаж.) и Vmax), в системах МАО-субстрат-АД для афобазола, тианептина и моклобемида с участием дофамина на всех видах биосенсоров наблюдает-
ся двухпараметрически согласованное (смешанное) ингибирование, для имипрамина при использовании в качестве субстратов тирамина и адреналина -псевдоингибирование.
Методика определения аурорикса: Таблетку препарата растирали в ступке до однородного мелкодисперсного состояния. Добавляли небольшое количество этилового спирта (5 мл) и примерно 10 мл дистиллированной воды, перемешивали полученный раствор и центрифугировали 15 мин при скорости оборотов 7000 об/мин. Получившийся прозрачный раствор переносили в мерную колбу на 25 мл. Не растворившийся осадок обрабатывали 10 мл дистиллированной воды и еще раз центрифугировали при тех же условиях. Прозрачный раствор опять переносили в мерную колбу и добавляли воду до метки.
Из этого раствора брали аликвоту 5 мкл, добавляли 67 мкл раствора адреналина и буферный раствор до объема 2 мл (объем электрохимической ячейки). В электрохимическую ячейку помещали МАО-биосенсор, и через 8 мин снимали вольтампе-рограмму в области потенциалов от 0 до 0.9 В относительно хлорид серебряного электрода при скорости наложения потенциала V = 100 мВ/с. Концентрацию аурорикса находили по градуировочному графику.
Предложенные моноаминооксидазные амперометрические биосенсоры могут быть использованы как аналитические инструменты для контроля, как остаточных количеств лекарственных соединений, как в биологических жидкостях, так и основного вещества.
Разработаны методики определения активного компонента в лекарственных препаратах с ан-тидепрессивным действием: «Мелипрамин», «Ауро-рикс», «Афобазол», «Коаксил» с Sr не более 0,030,09.
Литература
1. Budantsev A.Y. Biosensor for catecholamines with immobilized monoamine oxidase in tissue sections / A.Y.Budantsev // Anal. Chim. Acta. - 2003. - Vol. 249. - P.71-76.
2. Djane D.J. Amperometric biosensor based on monoamine oxidase immobilized in zol-gel film for benzydamine determination in pharmanceutical./ J. D.Djane, C. Couto, M.Montenegro // Anal.- 2006. - Vol. 33. - № 5. - P. 983-990.
3. Brondania D. Biosensor with immobilized monoamine oxidase in tissue sections /D. Brondania, C.W. Scheerenb, J.
Dupontb, I. C. Vieira// Sens. Actuators B.- 2009.-Vol. 140. -P. 252-260.
4. Gomathi P. Multiwalled carbon nanotubes grafted chitosan nanobiocomposite: A prosperous functional nanomaterials for glucose biosensor application / P. Gomathi, M. K. Kim, J. J. Park, D. Ragupathy, A. Rajendran, S. C. Lee, J. C. Kim, S. H. Lee, H. D. Ghim // Sens. Actuators B. - 2011. - Vol. 155.
- P. 897-902.
5. Zhou Y. Direct electrochemistry and reagentless biosensing of glucose oxidase immobilized on chitosan wrapped singlewalled carbon nanotubes / Y. Zhou, H. Yang, H.-Y. Chen // Talanta. - 2008. - Vol. 76. - P. 419-423.
6. Haghighi B. Fabrication of a novel electrochemi-luminescence glucose biosensor using Au nanoparticles decorated multiwalled carbon nanotubes / B. Haghighi, S. Bo-zorgzadeh, L. Gorton // Sens. Actuators B. - 2011. - Vol. 155. - P. 577-583.
7. Periasamy A. P. Amperometric glucose sensor based on glucose oxidase immobilized on gelatin-multiwalled carbon nanotube modified glassy carbon electrode / A. P. Periasamy, Y.-J. Chang, S.-M. Chen // Bioelectrochem. - 2011. - Vol. 80. - P. 114-120.
8. Li W. Study of the biosensor based on platinum nanoparticles supported on carbon nanotubes and sugar-lectin biospecific interactions for the determination of glucose / W. Li, R.Yuan, Y. Chai, H. Zhong, Y. Wang // Electrochim. Acta. -2011. - Vol. 56. - P. 4203-4208.
9. Pham X.-H. Electrochemical characterization of a singlewalled carbon nanotube electrode for detection of glucose / X.-H. Pham, M.-P. N. Bui, C. A. Li, K. N. Han, J. He. Kim, H. Won, G. H. Seong // Anal. Chim. Acta. - 2010. - Vol. 671. - P. 36-40.
10. Chen M. Poly(brilliant cresyl blue) electrogenerated on single-walled carbon nanotubes modified electrode and its application in mediated biosensing system / M. Chen, J.-Q. Xu, S.-N. Ding, D. Shan, H.-G. Xue, S. Cosnier, M. Holzin-ger // Sens. Actuators B. - 2011. - Vol. 152. - P. 14-20.
11. Yadav S. An amperometric oxalate biosensor based on sorghum oxalate oxidase bound carboxylated multiwalled carbon nanotubes-polyaniline composite film / S. Yadav, R. Devi, S. Kumari, S. Yadav, C.S. Pundir // J. Biotechnol. -2011. - Vol. 151. - P. 212-217.
12. Manjunatha R. Direct electrochemistry of cholesterol oxidase on MWCNTs / R. Manjunatha, D. H. Nagaraju, G. S. Suresh, J. S. Melo, S. F. D’Souza, T. V. Venkatesha // J. Electroanal. Chem. - 2011. - Vol. 651. - P. 24-29.
13. Раков Э.Г. Нанотрубки и фуллерены / Э.Г. Раков // Университетская книга.- 2006. - C. 235.
14. Горкин В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине / В.З. Горкин // Медицина. - 1981. - C. 336.
15. Раевский К.С. Антидепрессанты: нейрохими-ческие аспекты механизма действия / К. С. Раевский // Психиатрия и психофармакотерапия. - 2001.- Т. 3. - № 5.- С. 162166.
© Д. В. Брусницын - студ. ПФУ; Э. П. Медянцева - д-р зим. наук, проф. каф. аналитической химии ПФУ, Elvina.Medyantseva@ksu.ru; Р. М. Варламова - канд. хим. наук, зав. лаб. той же кафедры, Regina.Varlamova@ksu.ru; М. А. Байбатарова - студ. ПФУ.
