CC BY
59
УДК 543.544.547.979.7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА Е МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С КОСВЕННЫМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
В. И. Аньшаков, И. С. Алпеева, Г. Д. Брыкина, Е. Е. Лазарева
(кафедра аналитической химии)
Изучено поведение витаминов Е и Б3 на колонках Диасорб-130-КИ2, Силасорб-600, Нуклео-сил С18 с использованием немодифицированных и модифицированых подвижных фаз. В качестве модификаторов подвижных фаз исследованы хлорофилл и тетрафенилпорфирин. Найдены условия разделения витаминов Е и Б3, а также косвенного спектрофотометрического детектирования витамина Е. Показано, что предел обнаружения витамина Е методом ВЭЖХ на колонке с Нуклеосилом С18 в ацетонитриле, модифицированном тетрафенилпорфирином, ниже, чем известный из литературы (прямое УФ-детектирование). Проанализированы фармацевтические препараты, содержащие витамин Е.
Для разделения и определения витаминов широко используется нормально- и обращенно-фазовый варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Известно также, что предел обнаружения УФ-детектором а-токоферола, обладающего наибольшей биологической активностью, выше, чем предел обнаружения других жирорастворимых витаминов [1]. Цель настоящей работы -идентификация и количественное определение витаминов Е и Б3 методом ВЭЖХ с косвенным спектрофотометри-ческим детектированием. В качестве модификаторов подвижных фаз исследованы хлорофилл (Хл) и тетрафенилпорфирин (Н2ТФП). При выборе модификаторов учитывали, что витамин Е относится к природным фенолам [2], а принципиальная возможность использования хлорофилла, обладающего е > 110 л/мольсм, X = 404 нм, для косвенного детектирования фенолов в ВЭЖХ была показана ранее [3].
Экспериментальная часть
В качестве подвижных фаз использовали растворители: ацетонитрил (АН), гексан, диоксан, этилацетат (ЭА), изоп-ропанол (ИП), метанол, хлороформ, циклогексанол, воду
или их смеси. Для косвенного детектирования витаминов эти подвижные фазы модифицировали растворами хлорофилла в этаноле (1,3310-5М, 8,8910-6М, 4,4510-6М) и тет-рафенилпорфирина в этилацетате (8,3310-6М). Равновесие в колонках устанавливали после пропускания 2000 мкл модифицированной подвижной фазы.
Хлорофилл (а+Ь) экстрагировали из листьев сухой крапивы по стандартной методике. Концентрацию полученного раствора определяли спектрофотометрически. Известную аликвоту раствора переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки подвижной фазой (ПФ).
Точную навеску тетрафенилпорфирина фирмы «Р1ика» растворяли в известном объеме этилацетата. Далее переносили аликвоту раствора в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки ПФ. Точные навески продажных препаратов витаминов Е и Б3 растворяли в изопропаноле, этаноле или ПФ. Для построения градуировочных графиков растворы витаминов исходных концентраций последовательно разбавляли.
Хроматографическое поведение витаминов исследовали на микроколоночном жидкостном хроматографе Ми-лихром 4 с колонками из нержавеющей стали 64x3 мм,
Т а б л и ц а 1
Коэффициенты емкости витаминов на разных колонках
Витамин Диасорб-130-ЫИ2 (280) нм Силасорб-600 (280 нм) Нуклеосил-С18 (280 нм) Нуклеосил-С18 (404 нм)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Е 0,77 0,87 1,20 0,79 0,71 0,67 0,72 1,32 4,85 4,04 3,29 4,29
Эз 1,20 0,85 Размыв. 1,05 0,77 2,21 1,80 9,73 0,37 4,21 5,55 -
Примечания. 1 - гексан - ИП (95:5); 2 - АН - Н20 (75:25); 3 - СН3ОН -Н20 (4:1); 1 - гексан - ИП (95:5); 5 - СН3С1 - гексанол (95:5); 6 - гексан - ЭА (5:1); 7 - гексан - диоксан - ИП (94,5:5:0,5); 8 - гексан - диоксан (97:3); 9 - АН; 10 - АН - СН30Н (70:30); 11 -АН+ТФП (8.10-6 М); 12 - АН+Хл (4,45-10-6 М).
Т а б л и ц а 2
Содержание витамина Е в определяемых объектах (n = 3, Р = 0,95)
Объект исследования Подвижная фаза Содержание по паспорту
АН + хлорофилл(с = 8,8910-6 M) АН+Н2ТФП(с = 8,33 10-6)
<Нпика>, мм <m(E)>, г 2 <?пика>, мм <m(E)>, г
Компливит 2,33 0,011 ±0,001 11 0,0101±0,0006 0,01
Масло 7,00 0,0715±0,0084 40 0,0782±0,0008 0,08534
64x2 мм и 80x2 мм, заполненных сорбентами Силасорб 600 (5 мкм), Нуклеосил С18 (5 мкм) и Диасорб-130-NH (7 мкм) соответственно; объем пробы составлял 2-15 мкл; расход подвижной фазы - 100 или 50 мкл/мин.
Прямое детектирование витаминов проводили при X = 280 нм, косвенное - при X = 404 нм. Электронные спектры поглощения (ЭСП) подвижных фаз снимали на спектрофотометре «Hewlett Packard 8452 А», l = 1 см.
Мертвый объем Vm определяли по удерживанию несор-бируемых компонентов: СС14 для колонок Силасорб 600 (112 мкл) и Диасорб-130-NHj (123 мкл), и нитрометана для колонки Нуклеосил С18 (119 мкл).
Хроматографическое поведение витаминов оценивали с помощью коэффициентов емкости k' = (VR - Vm)/Vm.
Результаты и их обсуждение
Прямое детектирование (280 нм). На колонке Диа-сорб-130-NHj коэффициенты емкости витаминов низки, различаются незначительно, кроме того витамины в ряде случаев выходят из колонки вместе с растворителем (табл. 1 ). На этой колонке поведение витаминов в модифицированных ПФ не изучали. На колонке Силасорб 600 во всех элюентах коэффициент емкости витамина D3 больше, чем k Е, что согласуется с их гидрофобностью. Лучшего разделения удалось добиться в ПФ гексан-ди-оксан (97:3) (рис. 1). Однако при прямом спектрофото-
Рис. 1. Хроматограмма смеси витаминов Е (260 мкл) и D3 (1150 мкл). Колонка Силасорб 600, ПФ гексан - диоксан (97:3), F = 100 мкл/мин
Рис. 2. Хроматограммы витаминов на колонке Нуклеосил С18 (404 нм) а - 5 мкл витамина Е в ИП, б - 7 мкл витамина Б3 в этаноле; ПФ АН+Н2ТФП (С = 8,3310-6М); в - 10 мкл витамина Е в ИП; ПФ АН+хлорофилл (С = 4,5510-6М)
метрическом детектировании определение в этих условиях витамина Е в фармацевтическом препарате «Компливит» оказалось невозможным из-за перекрывания пика витамина Е пиком ретинола, также входящим в состав исследуемого препарата. На колонке Нуклеосил С18 (табл. 1) в АН порядок выхода витаминов Е и Б3 закономерно изменяется на обратный по сравнению с показанным на рис. 1. В ПФ АН - метанол (70:30) к' витаминов различаются незначительно.
Рис. 3. ЭСП хлорофилла (7), витамина Б3 (2), хлорофилл - витамин Оз (5,1:1) (3)
Косвенное детектирование (404 нм). Для косвенного спектрофотометрического детектирования витаминов Е и Б3 две ПФ (АН и гексан - диоксан) модифицировали хлорофиллом и тетрафенилпорфирином. Хроматографичес-кие системы при этом приобретают новые свойства. В модифицированной ацетонитрильной фазе удерживание витаминов Е и Б3 сильно изменяется по сравнению с их удерживанием в АН (табл.1). Значительно увеличивается удерживание витамина Б3 и незначительно уменьшается удерживание витамина Е. При введении пробы (растворитель, модификатор, витамин) в колонку с модифицированной ПФ происходит нарушение равновесного распределения модификатора между подвижной и неподвижной фазами, на хроматограмме появляются пики модификатора, растворителей и витаминов, соответствующие этим нарушениям. Объемы удерживания растворителей (188200 мкл), отрицательных системных пиков Хл (900 мкл) и Н2ТФП (665-670 мкл), витаминов Е (500, 630 мкл) и Б3 (780 мкл) на колонке Нуклеосил С18 указаны на хроматог-раммах (рис. 2). Меньший объем удерживания Н2ТФП по сравнению с объемом удерживания хлорофилла связан с большей гидрофобностью последнего. Это приводит к тому, что витамин Е выходит до системного пика, витамин Б3 - после системного пика. Направление пиков Е и Б3 положительное. Такие изменения связаны, по-видимому, с различной степенью взаимодействия витаминов, различающихся гидрофобностью, с модификатором -хлорофиллом. Электронное строение порфиринов позволяет оценить слабые взаимодействия молекул модификаторов и сорбатов спектрофотометрическим методом. Ниже рассмотрены, например, изменения в ЭСП хлорофилла в присутствии витамина Б3 (рис. 3). При соотношении витамина Б3 и хлорофилла (5,1:1) наблюдается ба-тохромный сдвиг на 4 нм плеча в спектре хлорофилла при длине волны 228 нм. И на фоне общего гипохромно-го эффекта наблюдается гиперхромный эффект в области 265-285 нм. На состояние п-системы хлорофилла, возможно, влияют взаимодействия гидрофобных структур -фитолового остатка хлорофилла и витаминов.
При введении пробы с одинаковым содержанием витамина Е в подвижные фазы с различным содержанием хлорофилла обнаружили, что высота (площадь) пика вита-
мина Е возрастает с увеличением концентрации модификатора ПФ (рис. 4). Ниже приведены уравнения градуи-ровочных графиков для определения витамина Е в препаратах «Компливит» и «Витамин Е в масле для внутримышечных инъекций 10%-й раствор»:
H = 237792-т - 0,6245(сХЛ = 8,89-Ю-6 М),
5 = 106т + 0,6148 (сТФП = 8,33-10-6 М),
где Н - высота пика (мм), 5 - площадь пика (мм2), т -масса витамина Е (г).
Витамин Е из поливитаминного препарата «Компли-вит» экстрагировали по следующей методике: таблетку препарата растирали в ступке, брали точную навеску (0,9773 г), переносили в мерную пробирку и экстрагировали 1 0 мл ИП, полученный светло-желтый раствор отфильтровывали и использовали для определения витамина Е. Из точной навески (0,8534 г) фармацевтического препарата «Витамин Е в масле для внутримышечных инъекций 10%-й раствор» а-токоферил ацетат экстрагировали 2 мл этанола. Слои растворителей разделяли при помощи делительной воронки. Верхний слой (раствор витамина Е в этаноле) использовали для анализа.
Результаты определения содержания витамина Е в объектах приведены в табл. 2. Предел обнаружения витамина Е методом ВЭЖХ на колонке Нуклеосил С18 в ПФ АН+Н2ТФП(стфп=8,33 - 10-6М) при косвенном спектрофото-метрическом детектировании составил 0,3 мкг, т.е. на порядок ниже, чем известный из литературы (прямое УФ детектирование) [4].
Рис. 4. Зависимость аналитического сигнала от концентрации модификатора в ПФ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ВЭЖХ в биохимии / Под ред. А. Хеншена и др. М., 1988.
С. 591.
2. Хроматография. Практическое приложение метода. Т. 1 / Под
ред. Э. Хефтмана. М., 1986. С. 248.
3. Брыкина Г.Д., Лазарева Е.Е., Уварова М.И., Шпигун О.А. //
ЖАХ. 1997. 52. С. 1073.
4. Papadaoyannis I.N., Tsioni G.K., Samanidou V.F. // J. Liq.
Chromatogr. and Relat. Technol. 1996. 20. P. 2003.
Поступила в редакцию 01.07.99
