CC BY
169
Н. Б. Иваненко, А. А. Иваненко, Е. Б. Носова, Н. Д. Соловьев
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИЧЕСКИХ И ФОНОВЫХ СОДЕРЖАНИЙ РТУТИ В КРОВИ АТОМНО-АБСОРБЦИОННЫМ МЕТОДОМ С ЭЛЕКТРОТЕРМИЧЕСКОЙ АТОМИЗАЦИЕЙ И ЗЕЕМАНОВСКОЙ МОДУЛЯЦИОННОЙ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ КОРРЕКЦИЕЙ ФОНА
Введение. По степени воздействия на живые организмы ртуть относится к классу чрезвычайно опасных элементов. Ртуть не обладает полезными физиологическими функциями, поэтому её относят к так называемым ксенобиотикам. Отравление ртутью приводит к поражению почек, дыхательной и центральной нервной систем, что создаёт целый ряд поведенческих и неврологических нарушений [1]. Фоновое, характерное для здоровых людей, содержание ртути в крови составляет 0,5-10 мкг/л, токсическое содержание составляют более 10 мкг/л [2, с. 408, 409].
Создание аналитических методик определения ртути в крови - трудная задача, поскольку содержания ртути малы, а матричный состав достаточно сложный. Очевидно, что для определения ртути в крови необходимы высокочувствительные и высокоэффективные методы анализа. К таким методам в первую очередь относятся масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) [3-7] и атомноабсорбционная спектрометрия с электротермическим вариантом атомизации (ААС ЭТ). Атомно-абсорбционная спектрометрия при определении ртути обычно применяется в варианте абсорбции холодных паров ртути с использованием специальных ртутно-гидридных приставок (РГП) к атомно-абсорбционным спектрометрам или в ртутных анализаторах [8]. Метод атомной абсорбции холодных паров обладает хорошей чувствительностью (пределы обнаружения не уступают ИСП-МС) и высокой селективностью, поскольку за счёт отгонки паров элементной ртути происходит её отделение от матрицы пробы. С помощью такого подхода возможно оценивать не только общее содержание ртути, но и соотношение её органических и неорганических форм [9].
Необходимо отметить, что при использовании и методик определения ртути на основе ИСП-МС с распылительной системой, и методик с использованием метода холодного пара объёмы крови для проведения анализов составляют несколько миллилитров, что создаёт определенные трудности при массовых обследованиях населения. Большинство методик предполагает кислотную СВЧ-минерализацию, что при определении ртути может приводить к значимым систематическим погрешностям.
Перспектива определения ртути в малых объёмах крови напрямую без пробоподго-товки представляется весьма привлекательной. Возможность разработки такой методики может быть реализована способом ААС ЭТ (объёмы пробы от 5 до 10 мкл) на спектрометрах с зеемановской модуляционной коррекцией фона [10, 11].
В настоящей работе представлены результаты разработки методики прямого определения токсичных содержаний ртути в крови методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и методики определения фоновых содержаний ртути в крови с использованием техники холодных паров.
Экспериментальная часть исслндования. Приборы: атомно-абсорбционный спектрометр МГА-915 с зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией
© Н. Б. Иваненко, А. А. Иваненко, Е. Б. Носова, Н. Д. Соловьев, 2010
фона производства ООО «Люмэкс», Россия, Санкт-Петербург; графитовые кюветы Массмана с платформой Львова; одноканальная пипетка переменного объёма 5-50 мм3 (дозатор), погрешность измерения не более 5 %; ртутно-гидридная приставка РГП-915.
Реактивы: водный раствор ионов ртути 1 г/л ГСО 8004-93 (ЦИКВ), вода дистиллированная ГОСТ 6709-72, вода деионизированная, модификаторы - нитрат палладия 10 г/л (Мегк), вольфрамат натрия ГОСТ 18289-78, гексагидрат гексахлорплати-новой(ГУ) кислоты (Мегк), модификатор хлорид золота(Ш) 0,1 г/л (ЦИКВ), кислота азотная концентрированная ос.ч. ГОСТ 11125-84, кислота хлороводородная концентрированная ос.ч. ГОСТ 14261-77, гидроксид натрия ос.ч. ^1ика), тетрагидроборат натрия для атомно-абсорбционного анализа ^1ика), тетрагидрофуран ч.д.а. ГОСТ 5830-79.
Подготовка атомизатора к проведению измерений. Для построения градуировочных характеристик при прямом введении пробы в модифицированный графитовый атомизатор вводили поочерёдно 10 мкл раствора модификатора Pd(NO3)2 (1 г/л) и последовательно 10 мкл градуировочных водных растворов ионов ртути с концентрацией 1, 5, 10, 20, 30, 40 мкг/л. Для построения градуировочных характеристик с использованием РГП в реакционный сосуд РГП вводили поочерёдно 5 мл 2,5 %-ного раствора хлороводородной кислоты, 1 мл раствора восстановителя (1 %-ный раствор тетрагидробората натрия в 0,1 %-ном гидроксиде натрия). Через полученный раствор в течение 60 с продували аргон для удаления ртути, содержащейся в реактивах. Затем вводили последовательно 12,5, 25, 50, 100, 200, 250, 350 мкл градуировочного раствора ионов ртути с концентрацией 10 мкг/л. Проводили отгонку паров ртути в подготовленную графитовую кювету в течение 120 с. Скорость потока аргона —0,4 л/мин. Измеряли аналитические сигналы (п = 5), проводя нагрев графитового атомизатора в соответствии с оптимизированной температурно-временной программой.
Перед измерениями пробы крови разбавляли в 10 раз деионизированной водой. При прямом определении ртути в модифицированный графитовый атомизатор вводили 10 мкл пробы крови и 5 мкл модификатора матрицы Pd(NOз)2 (1 г/л). При использовании РГП в реакционный сосуд РГП вводили 5 мл 2,5 %-ного раствора НС1, 1 мл раствора восстановителя (1 %-ный раствор ^ВН4 в 0,1 %-ном ^ОН), 1 мл тетрагидро-фурана в качестве пеногасителя. Через полученный раствор в течение 60 с продували аргон для удаления следов ртути, содержащихся в реактивах. Затем вводили 1,0 мл разбавленной крови и проводили отгонку паров элементной ртути в графитовый атомизатор в течение 120 с при скорости потока аргона 0,4 л/мин. Проводили измерение аналитических соответствий с оптимизированной программой.
Результаты исследования и их обсуждение. Атомно-абсорбционный анализ биопроб осложнён помехами со стороны компонентов пробы, химическими влияниями, высоким уровнем неселективного поглощения. Для учёта неселективного поглощения в атомно-абсорбционных приборах с электротермической атомизацией применяют различные способы коррекции фона, наиболее эффективным из которых является зе-емановская модуляционная поляризационная коррекция фона [10]. Однако при разработке методик анализа крови недостаточно ориентироваться только на использование эффективного корректора неселективного поглощения. Для минимизации различного рода помех необходимо использовать химическую модификацию поверхности графитовой кюветы атомизатора и самой пробы крови, оптимизацию температурно-временной программы нагрева атомизатора, разбавление пробы, если содержание элемента в крови достаточно для его надёжного определения.
Выбор модификаторов поверхности графитового атомизатора. Несмотря на большое количество работ по успешному применению модификаторов, выбор
модификатора для определения элементов до сих пор осуществляется чаще всего экспериментально [12]. Используются различные варианты перманентной модификации при атомно-абсорбционном определении ртути - родий-палладий [13, 14], иридий [15]. Модификация поверхности атомизаторов позволяет увеличить температуры атомизации и пиролиза, что приводит к снижению матричных эффектов и минимизирует потери ртути при анализе.
В настоящей работе использовали следующие перманентные модификаторы: вольфрамат натрия (^2WO4), нитрат палладия(ІІ), гексахлорплатиновую кислоту и хлорид золота(Ш). Осуществляли послойную модификацию: последовательно обрабатывали сначала вольфраматом натрия, затем соответственно гексахлорплатиновой кислотой или нитратом палладия и хлоридом золота(Ш) в соответствии с температурно-временной программой нагрева атомизатора, представленной в табл. 1.
Таблица 1
Температурно-временные условия модификации поверхности графитового атомизатора
Модификатор Сушка Пиролиз 1 Пиролиз 2 Атомизадия Очистка
і, с Г, °С £, с Г, °С £, с Г, °С £, с Г, °С £, с Г, °С
^2\¥С>4, Н2Р1С16 60 100 20 500 2 1400 2 2300 2 2350
Р<і(ГГО3)2 60 100 20 500 2 1200 2 2000 2 2100
АиСІз 60 80 20 700 - - 2 1250 2 1600
В процессе отжига Na2WO4, взаимодействуя с углеродом, восстанавливается до карбида вольфрама (WC), который препятствует диффузии аналита вглубь графита. Pd(NOз)2, Н2РШ1в, АиС1з образуют на поверхности печи тонкий слой соответствующего металла или интерметаллические соединения, способствующие лучшему удерживанию ртути поверхностью атомизатора [16].
Критерием выбора модификатора поверхности графитовой кюветы являлся максимальный аналитический сигнал при минимальном относительном стандартном отклонении при измерении стандартного раствора ртути. В табл. 2 приведены значения аналитических сигналов абсорбции ртути и относительных стандартных отклонений при использовании различных модификаторов поверхности атомизатора.
Таблица 2
Результаты анализа стандартного раствора ртути с использованием различных модификаторов поверхности
Модификатор поверхности Прямое введение пробы РГП
графитового атомизатора А, отн. ед. Яг, % А, отн. ед. Яг, %
Немодифицированный атомизатор 1,8 19,2 2Д 52,2
^2\¥С>4 24,4 10,1 1,9 26,6
^2\¥04, Р(1(ГГОз)2 6,8 16,0 13,4 29,7
^2\¥04, Н2Р1С16 27,6 3,5 20,4 10,8
^2\¥04, Н2Р1С16, АиС13 17,1 14,2 21,4 5,8
А — средний аналитический сигнал; 1000 пг, п = 5
Из приведённых данных следует, что при определении ртути с прямым введением пробы оптимальным являлась двухслойная модификация сначала вольфраматом натрия, затем гексахлорплатиновой кислотой. При сорбции паров элементной ртути, после отгонки из РГП, наиболее эффективна трёхслойная модификация: вольфрамат натрия, гексахлорплатиновая кислота, хлорид золота.
Оптимизация температурно-временных параметров процесса анализа. Правильно выбранный режим высушивания пробы имеет большое значение для получения хорошо воспроизводимых результатов анализа. Поскольку для разбавления проб крови использовали деионизированную воду, оптимальная температура сушки составила 80 С при продолжительности 60 с. В случае определения ртути с использованием РГП на стадии сушки происходит вытеснение воздуха из графитового атомизатора аргоном для предотвращения коррозии печи кислородом и азотом воздуха; сушку проводили 40 с при температуре 70 С.
Стадия пиролиза во многом определяет правильность результатов анализа и степень устранения неселективного поглощения. Была изучена зависимость величины интегрального аналитического сигнала при определении ртути при прямом введении от температуры пиролиза, которая представлена на рис. 1.
График зависимости аналитического сигнала от температуры пиролиза представляет собой плато от 250 до 400 С. При определении ртути использовали температуру пиролиза 350 С - центральную область плато. Отгонку паров ртути осуществляли при комнатной температуре, поскольку анализируемый элемент отделён от матрицы образца и в пиролизе не было необходимости.
Оптимальная температура стадии атомизации для ртути - это минимальная температура, дающая максимальный аналитический сигнал. При прямом введении стандартного раствора ионов ртути(П) максимальный сигнал получили при температуре 1250 С. Для определения ртути с использованием концентрирования отгонкой оптимальной температурой атомизации оказалась 1300 С.
Оптимизированная температурно-временная программа нагрева атомизатора пред-ставленна в табл. 3.
г , °С
пиролиз’
Рис. 1. Зависимость аналитического сигнала абсорбции ртути от температуры пиролиза
Таблица 3
Оптимальные температурно-временные условия определения ртути
Метод Сушка Пиролиз Атомизация Очистка Модификаторы
£, с Г, °С £, с Г, °С £, с Г, °С £, с Г, °С
Прямой ввод пробы 60 80 20 350 2 1250 2 1600 ^2 WO4, Н2Р1С16
РГП 40 70 - - 2 1300 2 2300 Мао \УС)4, Н2Р1С16, АиСІз
Оптимизация условий проведения реакции восстановления и отгонки ртути в атомизатор. Для методики, использующей концентрирование ртути в РГП, необходимо было оптимизировать не только температурно-временную программу нагрева, но и условия проведения реакции восстановления.
Выбор кислотности раствора и количества восстановителя. При определении ртути в крови необходимо использовать кислые растворы, так как эффективное восстановление ртути до элементного состояния тетрагидроборатом натрия возможно только в кислой среде. Для регулирования кислотности использовали хлороводородную кислоту. Изучили влияние кислотности растворов на величину аналитических сигналов ртути в диапазоне от 0,1 до 3 моль/л. Было показано, что кислотность в изученном интервале практически не влияет на протекание реакции восстановления. Последующие определения проводили с использованием раствора соляной кислоты с концентрацией 0,3 моль/л. При изучении влияния количества вводимого восстановителя (1 % раствора тетрагидроборатом натрия в 0,1 % гидроксиде натрия) на аналитический сигнал в диапазоне от 1 до 6 мл оказалось, что количество используемого раствора восстановителя также незначительно влияет на сигнал. В дальнейшем использовали 1,0 мл раствора восстановителя, так как увеличение количества реагента приводит к интенсивному вспениванию раствора в реакторной зоне РГП. Отсутствие значимого влияния количества кислоты и восстановителя свидетельствует о том, что реакция восстановления ионов ртути тетрагидроборат-ионом практически не имеет кинетических ограничений, а контролируется скоростями массопереноса паров ртути из жидкой фазы в газовую и последующей отгонки в атомизатор спектрометра.
Выбор условий отгонки паров ртути из РГП в атомизатор. Для решения задачи выбора оптимальных условий отгонки были оптимизированы следующие параметры: скорость газа-носителя и время отгонки. Для выбора оптимальной скорости газа-носителя проводили измерение аналитического сигнала абсорбции стандартного раствора ртути (100 мкл раствора 10 мкг/л) в ранее выбранных условиях после отгонки в течение 3 мин при разных скоростях потока газа-носителя. Полученная зависимость представлена на рис. 2.
Зависимость сигнала от скорости газа-носителя имеет чёткий максимум в области
0,4 л/мин, что совпадает с данными [17]. Для всех измерений использовали скорость газа носителя 0,4 л/мин. Для определения оптимального времени отгонки при скорости газа-носителя 0,4 л/мин измеряли аналитический сигнал ртути (50 мкл раствора ионов ртути 10 мкг/л), варьируя время отгонки от 30 до 240 с. Зависимость представлена на рис. 3.
Из полученных данных следует, что при скорости газа-носителя 0,4 л/мин достаточно 2 мин для полной отгонки паров элементной ртути.
Таким образом, мы получили следующие оптимальные параметры проведения реакции восстановления ртути в РГП с последующей отгонкой паров ртути в атомизатор:
Скорость газа носителя, л/мин
Рис. 2. Зависимость аналитического сигнала абсорбции ртути от скорости газа-носителя
12
Рис. 3. Зависимость аналитического сигнала
0 30 60 90 120 150 180 210 240 абсорбции ртути от
Время отгонки, с времени отгонки
скорость потока газа-носителя 0,4 л/мин; время отгонки 2 мин; кислотность: 5 мкл раствора соляной кислоты 0,3 моль/л; количество восстановителя: 1 мл раствора NaBH4 в 0,1 % NaOH.
Влияние мешающих компонентов. Мешающее влияние при прямом определении ртути могут оказывать и неорганические, и органические компоненты. Основным мешающим компонентом при атомно-абсорбционном определении ртути является хлорид-ион, его концентрация в крови составляет 0,9 мас. %.
На модельных растворах было изучено влияние хлорид-иона на аналитический сигнал ртути и показано, что содержание 0,1 мас. % хлорид-иона не мешает определению ртути, поэтому при прямом вводе пробы методика предполагает 10-кратное разбавление крови. Для уменьшения уровня неселективного поглощения и увеличения эффективности пиролиза в атомизатор непосредственно после ввода пробы вводили 5 мм3 модификатора окисления матрицы - Pd(NO3)2 (1 г/л). В случае отгонки паров элементной ртути с использованием РГП влияние хлорид-иона и органической матрицы практически нивелируется.
Однако при отгонке паров элементарной ртути и сорбции их на поверхности модифицированного графитового атомизатора при проведении серии анализов проб крови наблюдалось постепенное уменьшение аналитического сигнала.
На модельном растворе было показано, что в предложенных условиях анализа не только протекают реакции восстановления ртути, но и происходит образование гидридов селена и свинца. Содержание последних в крови значительно превышает содержание ртути (100 мкг/л и от 80 до 200 мкг/л соответственно). Селен и свинец блокируют центры сорбции на поверхности атомизатора. Увеличение температуры очистки до 2300 С позволило устранить мешающее влияние свинца и селена.
Оценка составляющих погрешности методик определения. Для доказательства правильности методики прямого определения токсических содержаний ртути и оценки воспроизводимости были использованы стандартные образцы состава крови (Clin Chek-Control № 8840-8843). Сертифицированное содержание ртути в них составило: № 2 - 12 мкг/л и № 3 - 37 мкг/л. Поскольку методика предполагает не менее чем десятикратное разбавление крови перед её определением, образцы были разбавлены деионизированной водой в 12 и 10 раз соответственно. Результаты определения представлены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты анализа стандартных образцов состава крови при прямом введении пробы крови в атомизатор (те = 10, Р = 0,95)
Сертифицированное значение
Стандартный образец состава крови концентрации ртути в стандартном образце (1:10), мкг/л Полученное значение концентрации, мкг/л Sr, %
Флакон № 2 1,0 ±0,4 1,1 ±0,1 12,8
Флакон № 3 3,7 ±0,7 3,6 ±0,3 11,7
Таблица 5 Определение содержания ртути в крови разными методами
Прибор Концентрация Sr, %
(те = 10), мкг/л
МГА-915 с РГП-915 2,9 ± 0,2 9,7
РА-915+ с ПИРО-915 2,8 ±0,2 10,0
Elan 9000 2,6 ± 0,1 5,4
Доказательство правильности методики и оценку воспроизводимости методики определения ртути с использованием РГП проводили методом добавок в сочетании с удвоением пробы во всём диапазоне определяемых содержаний (от 0,4 до 5 мкг/л), а также сравнивая результаты с результатами, полученными по аттестованным методикам в разных лабораториях с использованием метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой после микроволнового разложения (прибор “Elan 9000”, “PerkinElmer Sciex”, США) и атомно-абсорбционной спектрометрии с пиролитическим выделением ртути из образца (прибор РА-915+ с пиролитической приставкой ПИРО-915+, НПФ «Люмэкс»). Сравнительные анализы крови приведены в табл. 5. Анализ этих данных показывает, что методика прямого определения токсических содержаний ртути в крови, равно как и методика определения фоновых содержаний ртути в крови с использованием ртутно-гидридной техники, обеспечивают получение правильных и хорошо воспроизводимых результатов. Пределы обнаружения ртути составили соответственно 1 и 0,05 мкг/л.
Выводы. В результате проведенных исследований разработаны методики прямого определения токсических содержаний ртути в крови и определения фоновых содержаний ртути в крови с использованием техники концентрирования ртути в графитовом атомизаторе атомно-абсорбционным методом с зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией фона. Предлагаемые методики могут быть рекомендованы для диагностических целей и экологического мониторинга.
Литература
1. Скальный А. В., Рудаков И. А. Биоэлементы в медицине. М., 2003. 272 с.
2. Клиническое руководство по лабораторным тестам / Под ред. Н. У. Тица. М., 2003.
3. De Bias Bravo I., Castro R., Ditaz N., Goyenaga D. A. Optimization of the trace element determination by ICP-MS in human blood serum // J. Trace Elem. in Medicine and Biology. 2007. Vol. 21. P. 14-17.
4. Fong B. M., Siu T. S., Lee J., Tam S. Determination of mercury in whole blood and urine by inductively coupled plasma mass spectrometry // J. Anal. Toxicology. 2007. Vol. 31. P. 281-287.
б. Bjorkman L., Lundekvam B. F., Lagreid T. Mercury in human brain, blood, muscle and toenails in relation to exposure: an autopsy study // Environmental Health. 2007. 6:30. Free access. URL: http://www.ehjournal.net/content/6/1/30.
6. Chiou C.-S., Jiang S.-J., Danadurai K. Determination of mercury compounds in fish by microwave-assisted extraction and liquid chromatography-vapor generation-inductively coupled plasma mass spectrometry // Spectrochimica Acta Part B. 2001. Vol. 56. Iss. 7. P. 1133-1142.
7. McKelvey W., Gwynn R. C., Jeffery N. et al. A biomonitoring study of lead, cadmium, and mercury in the blood of New York city adults // Environmental Health Perspectives. 2007. Vol. 115. N. 10. P. 1435-1441.
8. Машьянов Н. Р., Погарев С. Е., Рыжов В. В., Шолупов С. Е. Возможности атомноабсорбционного спектрометра РА-915+ с зеемановской коррекцией для определения ртути в различных средах // Аналитика и контроль. 2001. № 4. C. 1-5.
9. Lopez-Colona J. L., Veigab D., Montela A. Determination of Mercury in Blood by Cold Vapor Atomic Spectrometry // Atomic Spectrometry. 2001. Vol. 22. N 2. P. 284.
10. Ганеев А. А., Сляднев М. Н., Шолупов С. Е. Зеемановская модуляционная поляризационная спектроскопия как вариант атомно-абсорбционного анализа. Возможности, ограничения // Журн. аналит. химии. 1996. Т. 51. № 8. С. 855-864.
11. Альтман Э. Л., Ганеев А. А., Туркин Ю. И., Шолупов С. Е. Некоторые применения эффекта Зеемана к атомно-абсорбционному анализу // Журн. прикладной спектроскопии. 1979. Т. 30. Вып. 6. С. 987-990.
12. Пупышев А. А. Практический курс атомно-абсорбционного анализа: Курс лекций. Екатеринбург, 2003. 441 с.
13. De-qiang Z., Li-li Y., Jian-min S. In-situ concentration and determination of mercury by graphite furnace atomic absorption spectrometry with Pd-Rh as the chemical modifier // J. Anal. Chem. 1999. P. 359-363.
14. De-qiang Z., Zhe-Ming N., Han-Wen S. Stabilization of organic and inorganic mercury in the graphite furnace with (NH^PdCb-(NH^RhCb as a mixed chemical modifier // Spectrochimica Acta. Part B. 1998. Vol. 53. P. 1049-1055.
15. Bermejo-Barrera P., Moreda-Pineiro J., Moreda-Pineiro A., Bermejo-Barrera A. Iridium-Coated Graphite Tubes for the Direct Determination of As, Cd, Hg, and Pb in Seawater by Vapor Generation ETAAS // Atomic Spectrometry. 1998. Vol. 19. N 3. P. 100-106.
16. Ortner H. M., Bulska E., Rohr U. et al. Modifiers and coatings in graphite furnace atomic absorption spectrometry-mechanisms of action (A tutorial review) // Spectrochimica Acta. Part B. 2002. Vol. 57. P. 1835-1853.
17. Liang L., Lazoff S., Chan C. et al. Determination of arsenic in ambient water at sub-part-per-trillion levels by hydride generation Pd coated platform collection and GFAAS detection // Talanta. 1998. Vol. 47. P. 569-583.
Статья поступила в редакцию 4 марта 2010 г.
