CC BY
374
Соловьев Н.Д.12, Иваненко Н.Б.12, Иваненко А.А.1, Кашуро В.А.1
1Институт токсикологии ФМБА России 2Санкт-Петербургский государственный университет
E-mail: nicksolovev@gmail.com, nbivanenko@mail.ru, ivanenkoaa@list.ru, kashuro@yandex.ru
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ ААС-ЭТА С ЗЕЕМАНОВСКОЙ КОРРЕКЦИЕЙ ФОНА
Методический подход к микроэлементному анализу биологических жидкостей проиллюстрирован на примере разработки методик прямого определения Be, Cd, Hg, Ni, Pb, Tl в цельной крови на основе ААС-ЭТА и Зеемановской высокочастотной модуляционной поляризационной коррекцией неселективного поглощения. Рассмотрены основные аспекты - выбор модификаторов, температурно-временной программы, оценка составляющих погрешности.
Ключевые слова: элементный анализ, кровь, атомно-абсорбционная спектрометрия, тяжелые металлы, анализ проб сложного состава без предварительного разложения.
Информация о микроэлементном составе биосред человека необходима при постановке диагноза и контроле лечения ряда заболеваний в первую очередь профессионального (манганизм, берилливая болезнь, хронический меркурилизм) и эндемического (манганизм, стронциевый рахит, арсенизм, гипоцинкэмия) характера, а также в судебно-химических и научных исследованиях [1].
Для решения задач клинической диагностики, токсикологии и криминалистики, связанных с микроэлементным анализом биологических жидкостей, используют, в основном, масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой и атомно-абсорбционную спектрометрию с электротермическим способом атомизации (ААС-ЭТА) [2]. Существующие методики элементного анализа биологических жидкостей в большинстве случаев предполагают разложение проб [2]. Длительная и трудоемкая процедура пробоподготовки сопряжена с вероятностью возникновения значительной систематической погрешности, т. е. предпочтительно использовать аналитические методы, позволяющие максимально упростить стадию подготовки пробы к анализу. Использование ААС-ЭТА с высокоэффективной Зеемановской высокочастотной модуляционной поляризационной коррекцией неселективного поглощения (ЗМПСВМ) позволяет заменить разложение проб биологических жидкостей их разбавлением [3-6]. В рамках указанного подхода в Институте токсикологии ФМБА России совместно с СПбГУ были разработаны методики измерения токсичных и эссенциальных элементов в цельной крови, плазме и сыворотке крови, и моче человека. Некоторые из разработанных
методик прошли процедуру метрологической аттестации в органах Ростехнадзора РФ и рекомендованы к использованию в учреждениях ФМБА России. В данной работе, прямой подход к анализу цельной крови проиллюстрирован на примере разработки методик определения Be, Cd, Hg, Ni, Pb, и Tl.
Материалы и методы
Атомно-абсорбционный спектрометр МГА-915 (НПФ «Люмэкс», Россия). Графитовые кюветы Массмана с интегрированной платформой Львова и без платформы. Одноканальные дозаторы переменного объема 5-50 мкл и 100-1000 мкл (Biohit, Финляндия). Реактивы марки ос.ч. или эквивалентные импортные.
Стандартные растворы готовили из ГСО водных растворов ионов соответствующих металлов (ЦИКВ, Россия). Для оценки правильности применяли стандартные образцы (СО) состава цельной крови Seronorm™ (Trace Elements Whole Blood L-3, Lot No 1003193, Норвегия) и плазмы крови Clinchek Control® (Plasma Control for trace elements, level II, Lot No. 417, Германия).
Гепаринизированные пробы крови были предоставлены токсикологической поликлиникой ФГУН «Институт токсикологии» ФМБА России. Пробы отбирали в утреннее время в положении сидя из локтевой вены с использованием вакуумной система для забора крови Vacutest® (Vacutest KIMA, Италия).
Результаты и их обсуждение
Атомно-абсорбционный анализ биопроб осложнен физико-химическими помехами со стороны компонентов пробы, в частности, вы-
соким уровнем неселективного поглощения. Для учета неселективного поглощения применяют различные способы коррекции фона. Одним из наиболее эффективных вариантов коррекции является ЗМПСВМ [7]. Однако при анализе объектов сложного состава недостаточно ориентироваться только на использование эффективного метода инструментальной коррекции. Для получения достоверных результатов необходима тщательная оптимизация всех параметров анализа, включая температурно-временную программу нагрева атомизатора (ТВП), выбор модификаторов поверхности атомизатора и самой матрицы пробы [8], а также оптимального фактора разбавления. Критерием оптимальности, как правило, является максимальный аналитический сигнал абсорбции ана-лита при минимальном стандартном отклонении параллельных результатов анализа.
Выбор модификаторов поверхности. Несмотря на большое количество работ по успешному применению модификаторов, выбор модификатора до сих пор осуществляется чаще всего экспериментально [9]. Рисунки 1 и 2 иллюстрируют влияние различных модификаторов поверхности на аналитические сигналы таллия [3] и ртути [4] соответственно. При прямом определении И§ оптимальной является послойная модификация №2Ш04 и Н2РЮ16. В случае Т1, максимальный и наиболее стабильный аналитический сигнал получен при использовании родиевого модификатора поверхности, однако, для методики рекомендована Н2РЮ16, в
силу ее большей доступности. Аналогичная картина получена при определении кадмия - оптимальным модификатором поверхности являются соли родия, но при использовании более доступных соединений платины также возможно достигнуть чувствительности, достаточной для надежного определения этого металла в крови и удовлетворительная воспроизводимость результатов анализа.
При определении более трудноатомизиру-емых элементов, таких как Ве, N1, и РЬ применение модификаторов не всегда оправдано, так как приводит к незначительному выигрышу в чувствительности и воспроизводимости результатов [5]. При определении легколетучих элементов (Сё, Т1, И§) также необходимо использование модификаторов матрицы, таких как Рё^03)2, NH4N03 для более эффективной деструкции матрицы при относительно низких температурах пиролиза, обеспечивающих сохранность аналита [2 - 4].
Оптимизация ТВП. Ключевым этапом разработки ААС-ЭТА методики является оптимизация ТВП. ТВП включает параметры сушки, пиролиза, атомизации и очистки. Наиболее критичными в плане оптимизации являются стадии пиролиза и атомизации. Температура атомизация и максимальная температура пиролиза зависят от геометрии атомизатора (продольный или поперечный нагрев, наличие платформы Львова, конструкция платформы) и используемых модификаторов поверхности. Максимальная темпера-
30 0,03 •
25 0,025 •
20 0,02 • ^5
0,015 • =: § й ч
10 0,01 •
5 0,005
0 о-
Немод. Р(і(ІЧ03)2 Н2Р1С16 ЫиС13 НЬС13
а)
1 Сигнал абсорбции, отн. ед.
Не мод. Ма2\У04, Ка2\У04, ^ЛУ04 Ма2ЛУ04, Рб(ІЧ03)2 Н4ЧСІ6, * НЛЧС!,;
АиСЦ
б)
Рисунок 1. а) Влияние модификаторов поверхности на сигнал абсорбции Т1 (100 пг Т1, платформа Львова, п = 5); б) Влияние модификаторов поверхности на сигнал абсорбции (200 пг ^, платформа Львова п = 5)
тура пиролиза, при которой не происходит потерь аналита, зависит не только от используемых модификаторов, но и от матрицы анализируемой пробы. Определенные компоненты матрицы, в частности хлорид-ион, приводят к потерям аналита в виде легколетучих соединений на стадиях анализа предшествующих атомизации [2-5]. Для уменьшения матричных влияний применяли 5-20 кратное разбавление проб крови деионизованной водой (в зависимости от чувствительности определения и референтной концентрации определяемого элемента в биосредах).
На рисунках 2 и 3 приведены кривые зависимости аналитического сигнала от температур пиролиза и атомизации для трудноато-мизируемых элементов (Ве и N1), и сравнительно легкоатомизируемых элементов (Сё и РЬ) соответственно.
Оптимизированные ТВП представлены в таблице 1.
Оценка составляющих погрешности разработанных методик. Для оценки правильности результатов анализа во всем динамическом диапазоне использовали метод стандартных добавок. Доказательство правильности проводили с использованием СО состава цельной крови и плазмы Seronorm™ и Clinchek Control®. Результаты представлены в таблице 2. Воспроизводимость результатов для разных элементов составляет от 5 до 11% Sr.
Выводы
Разработаны методики прямого (без разложения) определения Be, Cd, Hg, Ni, Pb, Tl в цельной крови на основе ААС-ЭТА с ЗМПСВМ. Изучено влияние матрицы пробы на определение каждого конкретного элемента, предложены пути его исключения. Выбраны модификаторы поверхности графитового атомизатора и матрицы пробы, оптимизированы температурно-временные параметры анализа.
mM, пг
mBe, пг
з
m Ni, пг
а)
mBe, пг
з
б)
Рисунок 2. Выбор температуры пиролиза (а) и атомизации (б) для Be и Ni (200 пг Ni, 2 пг Be, без платформы, n = Б)
m Ni, пг
mBe, пг
m Ni, пг
m Be, пг
20
0
а)
б)
Рисунок 3. Выбор температуры пиролиза (а) и атомизации (б) для Pb и Cd (100 нг Pb, 1 нг Cd, платформа Львова, n = Б)
Таблица 1. Оптимальные параметры ТВП при определении Ве, Сё, ^, N1, РЬ, Т1 в цельной крови
Элемент Модиф. поверхности Сушка Пиролиз Атомизация Очистка
Ве платформа нет 120 оС / 60 с 700 оС / 20 с 2750 оС / 2с 2800 оС / 2с
Сй платформа H2PtCl6 90 оС / 50 с 450 °С / 20 с 2200 оС / 2с 2300 °С / 2с
Н без платформы Na2WO4 H2PtCl6 80 оС / 60 с 350 оС / 20 с 1250 оС / 2с 1600 оС / 2с
N без платформы нет 90 оС / 45 с 800 °С / 20 с 2700 оС / 2с 2780 оС / 2с
РЬ платформа нет 100 оС / 60 с 600 °С / 18 с 2100 оС / 2с 2400 оС / 2с
П платформа Rha3 100оС / 80 с 450 оС / 20 с 2580 оС / 2с 2680 оС / 2с
Таблица 2. Результаты анализа стандартных образцов состава цельной крови и плазмы крови, полученные по разработанным методикам
Элемент Измеренное значение концентрации, мкг/л (P=0,95; n=6) Паспортное значение СО состава, мкг/л
Cd 8,4±0,5 8,9±0,6
Hg 19,1±1,0 17,7±1,3
Ni 4,5±0,9 5,3±1,2
Pb 450±12 437±25
Tl 10,5±0,4 10,1±0,5
Достоверность получаемых результатов дока- тации методики определения РЬ, N1 в крови и зана с использованием СО состава биологичес- Ве в крови и моче. С использованием методик
ких жидкостей. Воспроизводимость результа- проведена оценка N1, Сё, РЬ, И§ в контрольных
тов (8г) 5ч11%. Методики определения Сё, Щ, группах здорового населения и людей, подвер-
Т1 в цельной крови аттестованы Ростехнадзо- гающихся воздействию токсических элементов
ром РФ. В настоящее время готовятся к аттес- в профессиональных условиях [5].
----------------------- 28.09.2011
Список литературы:
1. Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. - М.: Мир, 2003. - 272 с.
2. Иваненко Н.Б., Ганеев А.А, Соловьев Н.Д. Москвин Л.Н. Определение микроэлементов в биологических жидкостях (Обзор). // Журн. аналит. химии. - 2011. - Т. 66, №9. - С. 900-915.
3. Solovyev N.D., Ivanenko N.B., Ivanenko A.A. Whole blood Thallium determination by GFAAS with high frequency modulation polarization Zeeman effect background correction. // Biol. trace elem. res. - 2011. - V. 143, N. 1. - P. 591-599 (DOI 10.1007/ s12011-010-8865-09).
4. Иваненко Н.Б., Иваненко А.А., Носова Е.Б., Соловьев Н.Д. Определение токсических и фоновых содержаний ртути в крови атомно-абсорбционным методом с электротермической атомизацией и Зеемановской модуляционной поляризаци-ионной коррекцией фона. // Вестник СПбГУ, Сер. 4. - 2010. - Вып. 4. - С. 97 - 1047.
5. Иваненко А.А., Иваненко Н.Б., Соловьев Н.Д., Блаженникова И.В Контроль содержания Mn, Cr и Ni в крови электросварщиков методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и Зеемановской коррекцией фона. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - №2. - С. 41 - 46.
6. Иваненко Н.Б., Иваненко А.А., Носова Е.Б., Соловьев Н.Д. Определение бериллия и никеля в крови атомно-абсорбционным методом с электротермической атомизацией и Зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией фона. // Вестник СПбГУ. Сер. 4. - 2011. - Вып. 3. - С. 96 - 1027.
7. Ганеев А.А., Сляднев М.Н., Шолупов С.Е. Зеемановская модуляционная поляризационная спектроскопия как вариант атомно-абсорбционного анализа. Возможности, ограничения // Журн. аналит. химии. - 1996. - Т. 51, №8. - С. 855-864.
8. Slawin W., Manning D.C., Carnrick G.R. The stabilizedtemperature platform furnace. // Atom. Spectr. - 1981. - V. 2. P. 137-145.
9. Пупышев А.А. Атомно-абсорбционный спектральный анализ. - М.: Техносфера, 2009. - 784 с.
Сведения об авторах:
Соловьев Николай Дмитриевич, младший научный сотрудник Института токсикологии ФМБА России, аспирант Санкт-Петербургского государственного университета Иваненко Наталья Борисовна, заведующая лабораторией Института токсикологии ФМБА России,
старший преподаватель Санкт-Петербургского государственного университета, кандидат химических наук Иваненко Анатолий Алексеевич, старший научный сотрудник Института токсикологии ФМБА
России, кандидат химических наук Кашуро Вадим Анатольевич, заведующий лабораторией Института токсикологии ФМБА России, доктор медицинских наук, 192019, г. Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д. 1, тел (812)4125533
