CC BY
31
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СООТНОШЕНИЯ АЭРОБНОГО ГЛИКОЛИЗА И ДЫХАНИЯ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА КАК ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОГО НЕПОВРЕЖДАЮЩЕГО ПОКАЗАТЕЛЯ
ТЯЖЕСТИ ПАТОЛОГИИ И УРОВНЯ ЗДОРОВЬЯ
Хундерякова1 Н.В., Захарченко1 М.В., Ячкула1 Т.В., Литвинова1 Е.Г., Федотчева1 Н.И., Сухоруков2В.С., Баранич2 Т.И., Плясунова3 С.А., Косякова4 Н.И., Шварцбурд1 П.М., Кондрашова1 М.Н.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Российская
Федерация
ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, г.
Москва, Российская Федерация 3 ФГБУ НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, г. Москва, Российская Федерация 4ФГБУЗ Больница Пущинского Научного Центра РАН, г. Пущино, Российская Федерация
Аннотация. Впервые у человека проведено определение важного показателя функций митохондрий в организме
- соотношения аэробного гликолиза (АЭГ) и дыхания (ДЫХ). Эта актуальная задача медицины решена благодаря созданию авторского метода исследования митохондрий в лимфоцитах (ЛФ) на мазке крови в специально разработанной среде инкубации, направленной на сохранение нативной структуры выделенной ткани -цитобиохимический (ЦБХ) анализ. Метод подробно описан в патенте и многих публикациях [1-3].
В данной работе измеряли активность фермента АЭГ - лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и самого мощного фермента дыхания митохондрий - сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Кроме того, нами предложено использовать соотношение активностей ЛДГ/СДГ в качестве меры соотношения АЭГ/ДЫХ, которое активно исследуется в течение столетия под именем эффекта Варбурга (ЭФВ). Однако ЭФВ исследовали на выделенных тканях, что нежелательно для клинических исследований. Предлагаемый показатель ЛДГ/СДГ по существу аналогичен ЭФВ, так как метаболизм ЛФ отражает общий сдвиг внутриклеточных процессов.
Исследованы следующие состояния у детей - самый интенсивный клеточный рост - при лимфолейкозе, нормальный рост разной интенсивности - у детей возраста 2 - 16 лет, ослабление восстановительных процессов
- при миопатии. Впервые получено количественное определение показателя ЛДГ/СДГ в большом диапазоне значений при разной интенсивности роста - от 21-55 при лимфолейкозе до 5-1 при миопатии. Исследованы также несколько групп преимущественно пожилых хронических больных бронхиальной астмой (БА) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), которые характеризуются ослаблением восстановительных процессов и роста. У этих больных впервые выявлено повышение ЭФВ при лечении, причем за счет уменьшения гиперактивности СДГ без превышения уровня нормы активности ЛДГ. Этот результат особенно ярко проявляется на группе больных, не получавших лечение до начала обследования. Разработанные показатели согласуются с клиническими заключениями о тяжести состояния больных, требующих учета большого объема клинических данных. Предлагаемый нами четкий количественный показатель метаболического состояния митохондрий лимфоцитов удобен для использования в клинике. Отношение АЭГ/ДЫХ позволяет обнаружить те метаболические изменения, которые еще не проявляются клиническими симптомами, но лежат в их основе. Полученные данные позволяют нам присоединиться к недавно возникшей трактовке АЭГ не как недостатка обмена раковой клетки, а как показателя ее жизнеспособности и усиления биосинтезов [4, 5]. Предлагаемый ЦБХ метод контроля изменений состояния митохондрий будет полезен при персонализированном подборе лекарственных и оздоровительных средств.
Ключевые слова: цитобиохимический метод, лимфоциты, дыхание, гликолиз, эффект Варбурга, сукцинатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа.
Введение. Определение состояния митохондрий в организме - актуальная задача современной фундаментальной медицины, поскольку эти органеллы играют центральную роль в энергообеспечении и осуществлении многих функций клетки. Принятые в биохимии классические методы исследования митохондрий не удовлетворяют этому запросу ввиду очевидного повреждения как организма обследуемого, так и критического повреждения состояния самих органелл. Описываемый в работе метод разработан с целью преодоления этих трудностей в сохранении нативного состояния митохондрий. Действительно, различия, обнаруживаемые этим методом на моделях стресса у животных и при заболеваниях у человека, значительно больше отличаются от нормы - до 2-3 раз и более, чем при биохимических и цитохимических исследованиях [1 -3].
Материалы и методы. Определения активностей СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови проводили авторским цитобиохимическим (ЦБХ) методом путем определения интенсивности восстановления красителя НСТ до формазана в лимфоцитах при инкубации мазков крови. Для определения ЛДГ, СДГ к основной среде инкубации,
ISSN 2226-7417
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7417-2017-19-12
2017, том 19 [12]
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXIвеке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—-
содержащей KCl 125 мМ, Hepes 10 мМ и краситель нитросиний тетразолий (НСТ) 1 мг/мл, pH 7.2±0.05, добавляли субстраты ЯНТ 5 мМ (проба «СДГ») и ЛАК 5 мМ+ МАЛ 5 мМ+ НАД 0.5 мМ (проба «ЛДГ»), подробнее в [1 -3].
Ввиду большого количества обсчитываемых клеток результаты определений статистически достоверны, р <0,05.
Результаты.
Рис. 1. Диапазоны эффекта Варбурга у больных и здоровых детей
Было проведено ЦБХ обследование детей разного возраста: условно здоровых (п=25), больных лейкозом (п=22), больных миопатией с разной степенью тяжести (п=9). Результаты, представленные на рис.1, показывают значения соотношения активностей ЛДГ/СДГ в лимфоцитах в этих состояниях.
Было также проведено ЦБХ обследование группы преимущественно пожилых пациентов с ослаблением процесса роста и восстановления (п=20) с диагнозами БА и ХОБЛ, длительно страдающим данными заболеваниями (5-15 лет) и получающим стандартное лечение (агонисты Р-адренорецепторов + ГКС) и группы из 5-ти пациентов, у которых был впервые поставлен диагнозом БА и которые не получали до момента обследования никакого лечения (Рис. 2).
Рис. 2. Показатели дыхания митохондрий - (активность СДГ) и АЭГ (активность ЛДГ), и их соотношение (ЭФВ) в группе пациентов с диагнозом Бронхиальная астма, до и после 3-х месяцев стандартного лечения.
Для пациентов обеих групп характерна сильная гиперактивация СДГ, и связанное с ней ослабление ЭФВ, который был снижен у этих больных в 2-3 раза по сравнению с нормой. Эффект лечения у пациентов обеих групп состоял в снижении гиперактивации СДГ до уровня нормы и повышении ЭФВ также до уровня нормы или
Специальный выпуск: Материалы XIXмеждународного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке"
18-20 декабря 2017, г. Москва —--—
немного выше. Наиболее ярко это было выражено в группе пациентов до лечения, у которых и исходная
гиперактивация СДГ была гораздо выше, чем у «хронических» больных, и эффект лечения был ярче: уже после
3-х месяцев лечения показатели активности СДГ снизились до уровня нормы, а пониженные значения ЭФВ по
этой причине повысились.
Работа поддержана грантами РФФИ 16-04-00636Аи 16-04-00342А.
REFERENCES
[1] Kondrashova M.N., Zakharchenko M.V., Khunderyakova N.V., Fedotcheva N.I., Litvinova E.G., Romanova O.I., et al. Chapter 1. What does a physician get from estimation of mitochondrial functions in lymphocytes of the patient? Innovative diagnostic methods in medicine. Monography. Novosibirsk, "Sibak", 2013, 10-58, ISBN 978-5-4379-0263-9
[2] Kondrashova M.N., Zakharchenko M.V., Khunderyakova N.V. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria. IJBCB, 2009, 41, 2036-2050. D0I:10.1016/j.biocel.2009.04.020
[3] Zakharchenko M.V., Zakharchenko A.V., Khunderyakova N.V., Tutukina M.N., Simonova M.A., Vasilieva A.A., et al. Burst of succinate dehydrogenase and a-ketoglutarate dehydrogenase activity in concert with the expression of genes coding for respiratory chain proteins underlies short-term beneficial physiological stress in mitochondria. IJBCB, 2013, 45, 190-200. D0I:10.1016/j.biocel.2012.07.003
[4] Matthew G, Heiden V., Cantley L., Thompson G. Understanding the Warburg Effect: The Metabolic Requirements of Cell Proliferation. Science. 2009, 324, 1029-33. DOI: 10.1126/science.1160809.
[5] Ward P.S., Thompson C.B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even Warburg did not anticipate. Cancer Cell, 2012, 21, 297-308. DOI: 10.1016/j.ccr.2012.02.014
DETERMINATION OF THE RATIO OF AEROBIC GLYCOLYSIS AND RESPIRATION IN HUMAN BLOOD LYMPHOCYTES - AS A PERSONALIZED NON-DAMAGING BIOMARKER OF SEVERITY OF
PATHOLOGY AND LEVEL OF HEALTH.
Khunderyakova1 N.V., Zakharchenko1 M.V., Yachkula1 T.V., Litvinova1 E.G., Fedotcheva1 N.I., Suhorukov2 V.S., Baranich2 T.I., Plyasunova3 S.A., Kosyakova4 N.I., Shvartsburd1 P.М., Kondrashova1 M.N.
institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAN, Pushchino, Russian Federation 2Pirogov Russian National Research Medical University, MH, Moscow, Russian Federation 3Dmitry Rogachev Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russian
Federation
4Hospital of Pushchino Research Center RAN, Pushchino, Russian Federation
Annotation. The important biomarker of mitochondrial functions - the ratio of aerobic glycolysis (AEG) and respiration (RES) was first measured in Humans. This actual goal of medicine was realized due to elaboration of the author method of the investigation of mitochondria in lymphocytes in smear of blood in an advanced medium providing preservation of native structure of isolated tissue -cytobiochemical (CBCh) assay. Method is described in the patent and many publications [1-3]. In this work the activity of glycolytic enzyme, lactate dehydrogenase (LDH) and activity of the most powerful enzyme of respiration - succinate dehydrogenase (SDH) were measured. Besides we proposed to use ratio LDH/SDH as measure of AEG/RES ratio which is intensively studied for a century as Warburg effect (WEF). However, this was studied in isolated tissues, that is undesirable for Humans. The proposed biomarker LDH/SDH is an analog of WEF, because lymphocytes reflect general shift of metabolism.
The following states in children were investigated: the most intensive cell growth under leukemia, normal growth in children of different age - 2 -16 y.o., the fall of restorative processes and growth under myopathy. The quantitative determination of LDH/SDH ratio was first obtained under different intensity of growth in the organism. The ratio varies from up to down a strong decrease in LDH/SDH from intensive growth ( 21 - 55) and myopathy (5-1).
The several groups of elder patients were also studied suffering chronic bronchial asthma and chronic obstructive lung disease with weakening of restorative processes and growth. In these patients the increase in WEF was first found under treatment for expense of diminishing SDH hyperactivity with LDH no exceeding norm. Results are similar in all groups. They are most pronounced in patients who have not received the medicine before examination.
The elaborated biomarkers agree with clinical conclusions on the severity of the patient state. But such conclusions demand many detailed examinations of patient The proposed clear quantitative index of the metabolic state of mitochondria is simple and convenient for use by physicians. AEG/RES ratio allows to penetrate into metabolic responses which are still not manifested by clinical symptoms but underlie them. Our data allow us to share advanced view on AEG as process, proving proliferation and vitality of cancer cell [4, 5]. The proposed CBCh method of control the changes in the state of mitochondria is very useful for personalized selection of medicine and health - improving means.
Key words: cytobiochemical assay, lymphocyte, respiration, aerobic glycolysis, Warburg effect, succinate dehydrogenase, lactate dehydrogenase.
