CC BY
22
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЕМЦИТАБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ПРОЛОНГИРОВАНЫ^ ИНФУЗИЯХ
Н.А. Паршина
Экспресс-лаборатория централизованного клинико-лабораторного отдела РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН Каширское шоссе, 24, Москва, Россия, 115478
Кафедра фармацевтической и токсикологической химии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Москва, Россия, 117198
Одним из путей повышения эффективности терапии неоперабельного рака поджелудочной железы является применение гемцитабина в виде инфузии с фиксированным размером дозы при скорости введения 10 мг/(м2-мин), что позволяет достигнуть максимального внутриклеточного накопления активной трифосфатной формы гемцитабина. Для определения концентраций гемцитабина в плазме крови был использован валидированный метод изократической обращеннофазной ВЭЖХ. В исследовании было установлено, что оптимальная концентрация препарата в плазме (10— 20 мкмоль/л) достигается в среднем к 30 мин. от начала 120-минутного введения и остается на данном уровне во время инфузии и в течение 20 мин. после ее завершения.
Гемцитабин является аналогом дезоксицитидина и представляет собой 2-дез-окси-2'2'дифторцитидин. Гемцитабин — пролекарство, которое активируется в клетке путем фосфорилирования до монофосфата, затем ди- и трифосфата. Гемцитабин трифосфат включается в реплицирующуюся ДНК в S-фазе клеточного цикла. Также наблюдается прямое ингибирование рибонуклеотидредуктазы под воздействием гемцитабина дифосфата. Вследствие этого снижается образование физиологического метаболита — дезоксицитидина дифосфата, а, следовательно, и дезоксицитидина трифосфата. В результате, при сниженной концентрации нормального предшественника гемцитабина трифосфат получает конкурентное преимущество для включения в ДНК. Кроме того, гемцитабина трифосфат может, ингибируя активность дезоксицитидинфосфатдезаминазы, блокировать дезактивирование собственного предшественника (гемцитабина монофосфата) [2].
Доклинические исследования показали, что цитостатическая активность гем-цитабина определяется внутриклеточной концентрацией его трифосфата. Ферментом, лимитирующим скорость образования последнего, является дезоксицитидин-киназа, которая фосфорилирует гемцитабин до монофосфата [3]. Оптимальное накопление трифосфата внутри клеток зависит от достижения в плазме такой концентрации гемцитабина, при которой будет полностью использована каталитическая способность дезоксицитидинкиназы, но не будет превышена концентрация насыщения.
Однако при стандартной 30-минутной инфузии 1200 мг/м2 большую часть времени концентрация гемцитабина в плазме превышает концентрацию насыщения дезоксицитидинкиназы, что приводит к неполной (субоптимальной) активации гемцитабина.
Одним из путей повышения эффективности терапии и снижения токсичности является применение гемцитабина в виде двухчасовой инфузии со значительно меньшей фиксированной дозой — при скорости введения 10 мг/м в мин. Это позволит достигнуть максимального внутриклеточного накопления активной три-фосфатной формы гемцитабина при меньшей токсической нагрузке на организм.
Методы исследования
В исследование были включены пациенты с цитологически подтвержденным диагнозом рака головки и тела поджелудочной железы, не подвергавшиеся ранее химиотерапии. Возраст больных — от 52 до 64 лет. Статус физического состояния пациентов характеризовался от 0 до 2 по шкале ECOG. Их состояние характеризовалось удовлетворительными показателями функционирования костного мозга (количество лейкоцитов > 3 • 109/л, количество тромбоцитов > 100 • 109/л, уровень гемоглобина > 90 г/л).
Схема введения препарата. Гемцитабина гидрохлорид («Гемзар», производитель «Eli Lilly», США) вводили внутривенно капельно в виде 120-минутной ин-фузии (10 мг/м2 в мин) в 1, 8, 15 дни цикла.
Определение гемцитабина в плазме крови
Гемцитабин в плазме крови определяли методом изократической обращен-но-фазной ВЭЖХ [4]. Калибровочную кривую для определения содержания гем-цитабина в плазме крови получали путем анализа образцов донорской плазмы с известными количествами внесенного стандарта гемцитабина гидрохлорида.
На стадии пробоподготовки к 0,5 мл плазмы добавляли 20 мкл ледяной уксусной кислоты и 1 мл смеси ацетонитрил-метанол (9 : 1), интенсивно встряхивали в течение 30 с и центрифугировали (3500 об/мин., 10 мин. при 4 °С). Надоса-дочную жидкость переносили в пробирку, а преципитат повторно подвергали экстракции и центрифугировали. Супернатанты объединяли, и образец выпаривали с помощью роторно-вакуумного испарителя при 42 °С. Сухой остаток растворяли в 500 мкл подвижной фазы и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Затем 50 мкл надосадочной жидкости вводили в жидкостной хроматограф Metrohm модель 844UV/VIS — с диодно-матричным УФ-детектором. В работе использовали аналитическую колонку Prontosil С18 (150 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм); подвижная фаза — смесь ацетатного буфера (рН 5,0) с ацетонит-рилом в объемном соотношении 97,5 : 2,5; температура колонки — 25 °С; скорость подачи элюента — 0,7 мл/мин.
Образцы крови пациентов (N = 9) получали до начала инфузии, а затем через 30, 90, 150 и 180 мин. от начала введения препарата.
Результаты. Установленная линейная зависимость (r = 0,9975) площади под пиком на хроматограмме от содержания гемцитабина в модельных смесях сохранялась в интервале (1^15) мкг/мл (рис. 1).
Б, тАи*с 600 500 400 300 200 100 0
О 2 4 6 8 10
С, мкг/мл
Рис. 1. Калибровочный график для определения гемцитабина в плазме крови
Уравнение регрессии имело вид: у = 8,51 + 51,59-х. Нижний предел количественного определения составил 0,5 мкг/мл (отношение сигнал/шум > 3, RSD = = 8,9%).
Доклинические исследования показали, что оптимальная концентрация гемцитабина в плазме, достаточная для образования гемцитабина трифосфата в моно-нуклеарных и лейкозных клетках, должна составлять в среднем 10—20 мкмоль/л [5]. Было установлено, что такая концентрация достигается в среднем через 30 мин. от начала 120-минутного введения и остается на данном уровне во время инфу-зии и в течение 20 мин. после ее завершения. Через 60 мин. после окончания введения гемцитабин не детектируется в плазме крови (рис. 2).
Концентрация гемцитабина, мкг/мл
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Время, мин.
-■— Содержание гемцитабина в плазме у 10 пациентов при 120-минутной инфузии
Рис. 2. Содержание гемцитабина в плазме крови при 120-минутной инфузии со скоростью
2
введения 10 мг/ м
Таким образом, было показано, что длительная, 120-минутная инфузия при скорости введения 10 мг/м в мин. позволяет избежать избыточного накопления токсичного лекарственного вещества и обеспечивает его оптимальное терапевтическое содержание в плазме крови в течение более длительного временного интервала.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Abbruzzese James L. New applications of Gemcitabine and future directions in the management of pancreatic cancer // CANCER Supplement 95. — 2002. — V. 4. — P. 942—949.
[2] Fogli S., Danesi1 R., De Braud et al. Gemcitabine, epirubicin and paclitaxel: pharmacokinetic and pharmacodynamic interactions in advanced breast cancer // Annals of Oncology. — 2002. — V. 13. — P. 919—927.
[3] Tempero M., Plunkett W., Ruiz Van Haperen V. et al. Randomized phase II comparison of dose-intense gemcitabine: thirty-minute infusion and fixed dose rate infusion in patients with pancreatic adenocarcinoma // J Clin Oncol. — 2003. — V. 21. — № 18. — P. 3402—3408.
[4] Паршина Н. А, Байкова В. Н., Плетенева Т. В. и др. Количественное определение гемцитабина методом ВЭЖХ в плазме крови // Химико-фармацевтический журнал. — 2008. — Т. 45. — № 5. — Р. 38—41.
[5] GrunewakdR., Kantarian H., Plunkett W. et al. Gemcitabine in leucemia: a phase I clinical, plasma and cellular pharmacology study // J Clin Oncol. — 1993. — V. 10. — № 3. — P. 406—413.
DETERMINATION OF PLASMA CONCENTRATIONS OF GEMCITABINE ADMINISTERED AS PROLONGED INFUSION IN PATIENTS WITH PANCREATIC CANCER
N.A. Parshina
Express-laboratory RONC n.a. N.N. Blokhin
Kashirskoe shosse str., 24, Moscow, Russia, 115478
Department of pharmaceutical and toxicological chemestry Medical faculty RPFU
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
The purpose of the work was to determine the accumulation of gemcitabine (2',2'-difluorodeoxy-cytidine) during and after prolonged infusion. Ten patients with advanced pancreatic cancer were administered gemcitabine at a fixed dose rate of 10 mg/m2 per min (1200 mg/m2, two hours infusion), and plasma gemcitabine concentrations were measured by reversed-phase high-performance liquid chromatography (HPLC). The obtained data showed that optimal concentration of the drug was achieved by 30 min from the beginning of the infusion and remains in this interval during the infusion and then for 20 min after the end of it.
Keywords: gemcitabine, HPLC, prolonged infusion.
