CC BY
48
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ
ЭТИНИЛЭСТРАДИОЛА И ЦИПРОТЕРОНА АЦЕТАТА В КОМБИНИРОВАННОМ ПРЕПАРАТЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ
ХТ.А. Денисова, ХЕ.Б. Нечаева, 2Н.П. Садчикова
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 2Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва
Резюме: Описаны этапы разработки и унификации метода количественного определения этинилэстрадиола и ципротерона ацетата в комбинированных контрацептивных препаратах для приема внутрь. Проведена валидация методики количественного определения содержания указанных гормонов при их совместном присутствии в лекарственной форме с использованием метода ВЭЖХ. Подтверждена возможность использования разработанной методики для анализа промышленных образцов лекарственных препаратов данной группы.
Ключевые слова: этинилэстрадиол, ципротерона ацетат, методы анализа, ВЭЖХ.
DETERMINATION OFETHINYLESTRADIOL AND CYPROTERONE ACETATE IN A COMBINED PREPARATION BY HPLC JT.A. Denisova, *E.B. Nechaeva, 2N.P. Sadchikova
1 Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow 2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow Abstract: The present article outlines various stages of development and standardization of an assay method for ethinylestradiol and cyproterone acetate in combined oral contraceptives. It also describes the HPLC assay method for the mentioned hormones when combined in a pharmaceutical dosage form. The possibility of using the developed method for the analysis of industrial drug samples, belonging to the mentioned class, has been substantiated.
Key words: ethinylestradiol, cyproterone acetate, analytical methods, HPLC.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы меняется отношение населения Российской Федерации к применению средств контрацепции, в особенности к пероральным гормональным контрацептивам. В настоящее время производством гормональных противозачаточных средств заняты многие крупнейшие фармацевтические фирмы. Каждая таблетка комбинированного перораль-ного контрацептива (КПК) содержит эстроген и про-гестаген.
В научной литературе описаны различные методы количественного определения действующих веществ гормональных комбинированных средств (ГКС). Большинство из них: колориметрия, УФ-спектрофотометрия и флюорометрия — не отвечают требованиям специфичности и не позволяют с требуемой точностью контролировать содержание эстрогена и гестагена в подобных лекарственных средствах [1].
ВЭЖХ позволяет оценить количественное содержание действующих веществ в пероральных контрацептивах в широком диапазоне дозировок с приемлемой правильностью и воспроизводимостью [2].
Этинилэстрадиол и ципротерона ацетат описаны в зарубежных фармакопеях по отдельности. Поэто-
му целью настоящего исследования — унификация метода количественного определения при совместном присутствии этинилэстрадиол (ЭЭ) и ципротерона ацетат (ЦА) (химические формулы приведены на рис. 1) в КПК, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данная разработанная методика может быть предложена лабораториям, занимающимся выявлением фальсифицированной продукции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования — комбинированный моно-фазный пероральный контрацептив: Диане-35, производимый фирмой Шеринг ГмбХ и Ко. Продук-
ционс КГ, Германия. Препарат «Диане-35®, драже», представляет собой круглые, двояковыпуклые драже светло-желтого цвета с содержанием этинилэстрадио-ла — 0,035 мг и ципротерона ацетата — 2,0 мг.
При выполнении работы использовали стандартные образцы этинилэстрадиола, ципротерона ацетата Британской фармакопеи [3, 4]. Согласно спецификациям, в стандартном образце содержание этинилэстрадиола составляло не менее 97,0%, ципротерона ацетата - не менее 97,0%.
Для оптимизации хроматографического анализа эстрогенных и прогестагенных компонентов в препаратах пероральных контрацептивов сначала выявляли закономерности хроматографического поведения их при совместном присутствии в анализируемой пробе раствора стандартных образцов на колонках с различными сорбентами. Затем исследовали влияние состава подвижной фазы на хроматографирование действующих веществ. На основании полученных данных устанавливали оптимальные условия разделения ЭЭ и ЦА с целью разработки методики их определения в таблетках пероральных контрацептивов.
Согласно Европейской фармакопее, для определения ЭЭ, ЦА рекомендована колонка с сорбентом октадецилсиликагель (С18), ПФ — смесь ацетонитрил и вода в различных соотношениях.
Экспериментально нами подобрана подвижная фаза, включающая ацетонитрил, метанол и воду в соотношении 30:20:50. Подвижную фазу фильтровали через фильтр Millipore с размером пор 0,45 мкм и дегазировали.
Для детектирования веществ выбрали длину волны 215 нм. Оптимальная температура колонки 21°С. Вводимый объем 20 мкл. Скорость потока 1,0 мл/ мин.
Все реактивы и растворители использовали аналитического качества, ацетонитрил и метанол были взяты класса чистоты «для ВЭЖХ».
Разделение исследуемых веществ проводили на приборе фирмы Agilent 1100, снабженным автосемплером, УФ детектором с переменной длиной волны. Колонка производства фирмы Nova-Pak® C18 (150 х 4,6 мм, 4 мкм). Оценку пригодности хроматографической системы проводили по величине относительного стандартного отклонения времен удерживания и площади пиков ЭЭ и ЦА при повторном (6 раз) хроматографировании стандартных растворов, содержащего этинилэстрадио-ла 7 мкг/мл и ципротерона ацетата 400 мкг/мл в подвижной фазе.
Важным критерием оценки аналитической методики служит доказательство ее валидности. С этой целью выполнено экспериментальное
исследование по установлению валидационных характеристик разработанной методики. Подтверждение возможности применения метода ВЭЖХ в выбранных условиях с целью количественного определения этинилэстрадиола и ципротерона ацетата, проведен анализ модельных смесей, содержащих лекарственные и вспомогательные вещества в соответствии с составом пероральных контрацептивов.
Изучение стабильности стандартных растворов ЭЭ и ЦА во времени. Критерием стабильности растворов являлось постоянство площади хроматографических пиков, зарегистрированных в условиях, описанных в методиках. Оценку линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации анализируемых соединений проводили на семи уровнях концентрации, используя в качестве аналитического сигнала площади хроматографических пиков ЭЭ и ЦА. Нижнюю границу диапазона определяемых содержаний оценивали, характеризуя воспроизводимость результатов анализа посредством расчета величины относительного стандартного отклонения. Анализировали растворы, содержащие десятые и сотые доли мкг/мл ЭЭ и ЦА. Для определения воспроизводимости результатов определения выполняли 8—10 параллельных определений ЭЭ и ЦА в модельной смеси. Расчет проводили по площади хроматографических пиков. Правильность оценивали методом «введено-найдено», анализируя модельные смеси.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Хроматограмма стандартного раствора представлена на рис. 2.
Относительное стандартное отклонение площадей пиков этинилэстрадиола, ципротерона ацетата находилось в пределах 0,60% - 0,75%.
Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитаны параметры в соответствии с рекомендациями фармакопеи США 36 [5] (таблица 1).
Из таблицы 1 следует, что подобранные нами хроматографические условия удовлетворяют требо-
б
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Ведомости НЦЭСМП
Таблица 1
ПАРАМЕТРЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Параметры Этинилэстрадиол Ципротерона ацетат
Ширина пика (W) в мин 0,3 3,1
Коэффициент асимметрии пика 0,99 1,05
Селективность (а) 1,03 1,08
Эффективность хроматографической колонки (^ 8762 9014
Разрешение ^) между ЭЭ и ЦА 1,0 22
ваниям пригодности и позволяют надежно идентифицировать этинилэстрадиол, ципротерона ацетат в выбранных условиях.
Для решения вопроса о возможности идентификации действующих веществ в анализируемом перо-ральном контрацептиве (доказательство специфичности) методом ВЭЖХ в выбранных условиях получены хроматограммы плацебо и растворов таблеток препарата в подвижной фазе (рис. 3а; 3б).
\ZWD1 А, Дл. Волны -215 нм
птАІ)
350
300
1 — этинилэстрадиол;
2 — ципротерона ацетат
Рис. 3а. Хроматограмма раствора плацебо таблеток Диане-35
Для подтверждения линейности метода были получены калибровочные кривые и рассчитаны коэффициенты корреляции по результатам хроматографирования стандартных растворов со следующими концентрациями: от 0,37 до 6,20 мкг/мл (этинилэстрадиол), от 24,32 до 402,10 мкг/мл (ципротерона ацетата). Кривые калибровки показали соблюдение линейности в выбранном диапазоне, с коэффициентом корреляции 0,9998 для этинилэстрадиола, 0,9997 для ципротерона ацетата. Правильность аналитического метода оценивалось по коэффициенту вариации [6].
Содержание ЭЭ и ЦА (Х,%) в драже рассчитывали по формуле:
Х = Аисп * Сст * Р (1)
х С ’
где: Аисп — площадь пика ЭЭ или ЦА на хроматограмме испытуемого раствора;
Аст — площадь пика ЭЭ или ЦА на хроматограмме стандартного раствора;
Сст — концентрация ЭЭ или ЦА в стандартном растворе, мг/мл;
Сисп — концентрация ЭЭ или ЦА в испытуемом растворе, мг/мл;
Р — чистота рабочего стандарта ЭЭ или ЦА, %.
Представленные результаты позволяют исключить вероятность систематической погрешности и подтверждает приемлемую правильность методики.
Данная методика была применена к определению ЭЭ и ЦА в промышленных сериях препарата Диане-35. Результаты анализа представлены в таблице 3.
Таблица 2
ПРАВИЛЬНОСТЬ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЭ И ЦА В МОДЕЛЬНЫХ СМЕСЯХ МЕТОДОМ ВЭЖХ
Количество определяемых Состав модельной смеси, мкг Найдено*, мкг Регенерация*, %
веществ в % от заложенного в композиции ЭЭ ЦА ЭЭ ЦА ЭЭ ЦА
70 24,5 1400 24,4 1390 99,6 99,6
80 28,0 1600 28,1 1605 100,4 100,3
90 31,5 1800 31,4 1794 99,7 99,7
100 35 2000 34,7 1995 99,1 99,8
110 38,5 2200 38,3 2192 99,5 99,6
120 42 2400 42,2 2403 100,5 100,1
130
45,5
2600
45,2
2591
99,3
99,7
* - среднее из трех определений
Таблица 3
РЕЗУЛЬТАТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭЭ И ЦА В ТАБЛЕТКАХ ДИАНЕ-35
№ Название Должно быть, мкг Найдено, мкг (среднее из 7 определений) Стандартное отклонение Коэффициент вариации (%)
1 ЭЭ 35,00 34,8 0,14 0,39
2 ЦA 2000,00 1987,0 0,82 0,21
ВЫВОД
Таким образом, разработана методика определения содержания этинилэстрадиола и ципроте-рона ацетата в препарате Диане-35 с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Basic Tests for Pharmaceutical Substances; World Health Organization: Geneva, 1986; 75-76.
2. Santoro M.I., Kassab N.M. eta al. Drug Development and Industrial Pharmacy, 2002, 28(6), 742-744.
3. British Pharmacopoeia 2009. Monograph: Ethinylestradiol.
4. British Pharmacopoeia 2009. Monograph: Cyproterone acetate.
Доказана ее приемлемость для контроля качества путем расчета валидационных характеристик. Данная методика может быть использована лабораториями, занимающихся выявлением фальсификатов.
5. The United States Pharmacopoeia 36-National Formulary 31. Monograph: Ethinyl Estradiol.
6. Эпштейн, Н. А. Оценка пригодности (Валидация) ВЭЖХ методик
в фармацевтическом анализе (Обзор) / Н. А. Эпштейн // Хим.-фарм. журнал.-2004.-Т. 38, №4. С. 40-56.
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
