CC BY
21
БИОХИМИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ
УДК 543.4:544.2
Л. М. Юсупова, С. Ю. Гармонов, Р. Ш. Мархабуллина
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИИ
5,7-БИС-(МЕТА-НИТРОФЕНИЛАМИНО)-4,6-ДИНИТРОБЕНЗОФУРОКСАНА
Ключевые слова: 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксан, стандартизация, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Разработана методика количественного определения посторонних примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Key words: 5,7-bis-(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan, standardization, high-performance liquid chromatography.
The technique of quantitative definition of strange impurities in the 5,7-bis-metanitrophenylamino-4,6-dinitrobenzofuroxan using by high-performance liquid chromatography method is developed.
Введение
Бензофуроксаны представляют собой соединения с широким спектром биологической активности. Доказана антигельминтная активность и низкая токсичность субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана [ 1, 2, 3]. В качестве примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофурок-сана выступают исходные вещества: м-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофурок-сан. Наличие посторонних примесей в лекарственных средствах снижает их биологическую активность и уменьшает срок годности. Следовательно, целью исследования является разработка точного и надежного метода количественного определения посторонних примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуется высокой чувствительностью, точностью, универсальностью, экспрессно-стью.
Экспериментальная часть
динитробензофуроксана и его примесей. При проведении исследований влияния состава подвижной фазы на времена удерживания анализируемых компонентов подобрано оптимальное соотношение подвижной фазы: ацетонитрил и 0,1 % трифторуксус-ная кислота (70 % - 30 %) [4].
Для приготовления раствора 0,1 % три-фторуксусной кислоты использовали сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters.
Предварительно синтезируемая субстанция была очищена от примесей (мета-нитроанилин и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксан) методом перекристаллизации в бинарной системе растворителей: этанол 96 % - ацетонитрил. Анализ очищенной субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом потенциомет-рического титрования показал содержание активного вещества 99,99 %.
Для проверки пригодности хроматографи-ческой системы, была приготовлена смесь, состоящая из 1 мл мета-нитроанилина, 1 мл 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана и 1 мл 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана с концентрациями 0,0001 мг/мл.
Количественное определение примесей в субстанции 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы "Schimadzu" (Япония) со спектрофо-тометрическим детектором. Для хроматографиче-ского разделения 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, 5,7-дихлор-4,6-
динитробензофуроксана и м-нитроанилина экспериментально подобраны следующие условия: стальная колонка длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная сорбентом С18 с размером частиц 5 мкм (Symmetry C18), скорость подвижной фазы - 1 мл/мин, объем инжектируемой пробы - 20 мкл. Для обеспечения высокой чувствительности методики, анализ проводили при длине волны 245 нм, которая соответствует наиболее выраженному неспецифическому максимуму в УФ-спектре 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-
mV
[Детектор А:245нм 1 _
;
| со 1 1
О) о со со -
о со
1 СМ
11,.
......
0.0 2.5 5.0 7.5 мин
Рис. 1 - Хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографической системы
На рисунке 1 представлена хроматограмма раствора для проверки пригодности хроматографи-ческой системы. Время удерживания пика м-нитроанилина составило 3.11 мин, 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана -
4.67 мин, а 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана -5.33 мин. Эффективность колонки, рассчитанная по пику 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-
динитробензофуроксана, составило 9400 теоретических тарелок, по пику 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана - 6900 теоретических тарелок, а по пику м-нитроанилина - 7800 теоретических тарелок. "ШР рекомендует для методики высокоэффективной жидкостной хроматографии значение количества теоретических тарелок по пику определяемого вещества не менее 2000 [5]. Коэффициент асимметрии пика мета-нитроанилина составил 1,17; 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-
динитробензофуроксана - 1,24; а 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана - 1,0. Согласно требованиям Европейской фармакопеи, коэффициент асимметрии пика должен находиться в интервале от 0,8 до 1,5 [6]. Разрешение между пиками мета-нитроанилина и 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, составило 9, а между пиками 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-
динитробензофуроксана и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана - 2,9. Разрешение между пиками определяемых веществ является важным показателем, характеризующим разделяющую способность хроматографической системы и правильность выбора условий хроматографирования. Британская и Европейская фармакопеи рекомендуют значение разрешения пиков Я8>1,5 [7].
Детектор А:245нм
-лА
0.0 2.5
Рис. 2 - Хроматограмма очищенной субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробен-зофуроксана с концентрацией 0,001 г/мл
казал отсутствие сигналов мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана.
Цетектор А:245нм
Т1
Рис. 3 - Хроматограмма раствора стандартного образца мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана с концентрацией 0,25 мкг/мл
Содержание мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-
динитробензофуроксана в процентах (Х) вычисляют по формуле:
5
Х =■
а0 ■ Р■100
5
а0 ■Р
50 ■ а1 ■100■100■100
5 0 ■ а1
10000
где 50 - среднее значение площади пика соответствующей примеси, вычисленное по трем хромато-граммам раствора стандартного образца; 51 - среднее значение площади пика соответствующей примеси, вычисленное по трем хроматограммам испытуемого раствора; аI - навеска субстанции, в граммах; а0 - навеска мета-нитроанилина (5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана), взятая для приготовления стандартного раствора, в граммах; Р - содержание основного вещества в стандартном образце примеси, в пересчете на безводное вещество, в процентах.
Суммарное содержание примесей (мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-
динитробензофуроксана) в субстанции должно быть не более 0,5%.
5-
0.0
2.5
5.0
10.0
2.5
мин
5.0
7.5
мин
По 20 мкл раствора 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана вводили в хроматографическую колонку не менее пяти раз. Время выхода пика 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана составило 4.72 мин.
Для идентификации и определения времени выхода посторонних примесей: мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана параллельно на их основе готовили раствор в ацетонитри-ле с концентрацией 0,25 мкг/мл. По 20 мкл раствора примесей мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана вводили в хроматографи-ческую колонку не менее пяти раз в вышеописанных условиях.
Анализ хроматограммы очищенной субстанции (рисунок 2) 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по-
Результаты и их обсуждение
Для доказательства правильности и точности разработанной методики были приготовлены три модельных образца субстанции с заложенным содержанием примесей. Результаты анализа трех модельных образцов приведены в таблице 1 и 2.
Из таблицы 1 видно, что значение относительной погрешности среднего результата количественного определения примеси мета-нитроанилина в модельных образцах составило 1,84 % и не превышает 4 %.
Из таблицы 2 видно, что значение относительной погрешности среднего результата количественного определения примеси 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана в модельных образцах составило 1,86 % и не превышает 4 %.
Таблица 1 - Количественное определение мета-нитроанилина в модельном образце (n=9, P=0,95)
Зало- Найдено Метрологи-ческие
жено, г характеристики
г %
0,0020 0,0020 100,00 n=9, f=8, P=95 %
0,0020 0,0019 95,00 t (95 %, 8)=2,31
0,0020 0,0019 95,00 □ x=98,07 %
0,0025 0,0025 100,00 s2=5,46
0,0025 0,0024 96,00 s=2,34 %
0,0025 0,0025 100,00 RSD=2,39 %
0,0030 0,0030 100,00 A □ x=1,80 %
0,0030 0,0029 96,67 □ s =1,84 %
0,0030 0,0030 100,00
Таблица 2 - Количественное определение 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана в модельном образце (n=9, P=0,95)
Зало- Найдено Метрологи-ческие
жено, г характеристики
г %
0,0020 0,0019 95,00 n=9, f=8, P=95 %
0,0020 0,0019 95,00 t (95 %, 8)=2,31
0,0020 0,0020 100,00 x=97,63 %
0,0025 0,0025 100,00 s2=5,32
0,0025 0,0024 96,00 s=2,31 %
0,0025 0,0024 96,00 RSD=2,37%
0,0030 0,0029 96,67 A □ x=1,82 %
0,0030 0,0030 100,00 s =1,86 %
0,0030 0,0030 100,00
Следовательно, разработанная методика количественного определения примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензо-фуроксана методом высокоэффективной жидкост-
ной хроматографией характеризуется правильностью и точностью.
Выводы
Разработана методика количественного определения посторонних примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить достоверные и надежные результаты, а также может быть использован для количественного определения примесей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана.
Литература
1. Пат. 2009112924/15(017596) от 5. 05.2010 г. Антигель-минтная композиция на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана. И.В. Галкина, С.Н. Егорова, Л.М. Юсупова, Р.Ф. Мавлиха-нов, Н.А. Лутфуллина, Н.В. Воробъева, Е.В. Тудрий, Л.В. Спатлова, Ю.Г.Штырлин, В.И. Галкин, М.Х. Лут-фуллин.
2. Л.М. Юсупова, С.Ю. Гармонов, И.М. Захаров, А.Р. Быков, Т.В. Гарипов, И.Ф. Фаляхов. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензофуроксана. Вестн. Казан. технол. ун-та. №1, с. 103-111, 2004.
3. Л.В. Спатлова, Л.М. Юсупова. Кинетика взаимодействия 5,7-дихлоро-4,6-динитробензофуроксана с 3,5 ди-хлороанилином. Вестн. Казан. технол. ун-та. №19, с. 2934, 2011.
4. Салахов И.А. Унифицированные подходы к анализу метаболиков, химиотерапевтических, анальгезирующих и противовоспалительных лекарственных средств методом ВЭЖХ: Автореф. дис. канд. хим. наук. - Казань, 2010. -25 с.
5. United States Pharmacopoeia (2007).
6. European Pharmacopoeia (2007).
7. British Pharmacopoeia (2007).
© Л. М. Юсупова - д-р хим. наук, проф. каф. ХТОСА КНИТУ; С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ; Р. Ш. Мархабуллина - асп. каф. ХТОСА КНИТУ, [email protected].
