CC BY
306
ПРИМЕНЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ
THE USE OF CERTIFIED REFERENCE MATERIALS
Статья поступила в редакцию 13.10.2014, доработана 20.10.2014
УДК 543.4:544.2
ВАЛИДАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТАНЦИИ 5,7-БИС(МЕТА-НИТРОФЕНИЛАМИНО)-4,6-ДИНИТРОБЕНЗОФУРОКСАНА МЕТОДОМ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОГО ТИТРОВАНИЯ
Мархабуллина Р.Ш., Юсупова Л.М.
Разработана и валидирована методика количественного определения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом потенциометрического титрования. Методика характеризуется высокой точностью, надежностью и чувствительностью.
Ключевые слова: 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксан, валидация, потенциометрическое титрование.
Авторы: j МАРХАБУЛЛИНА Р. Ш.
| Аспирант кафедры химии и технологии органических | соединений азота (ХТОСА) Казанского национального исследовательского технологического университета (КНИТУ)
Российская Федерация, 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68 E-mail: remarkh@bk.ru
Бензофуроксаны представляют собой биологически активные вещества с ярко выраженной фунгицидной, бактерицидной, акарицидной и инсектицидной активностью [1-6]. Антигельминтные свойства в ряду бензо-фуроксанов обнаружены впервые [7, 8]. Проведенные исследования на поросятах и крысах доказали высокую эффективность и малую токсичность лекарственной
ЮСУПОВА Л. М.
Д-р хим. наук, проф. кафедры ХТОСА КНИТУ Российская Федерация, 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68
формы на основе 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана [9].
Синтез субстанции 5,7-бис(мета-нитроанилино)-4,6-динитробензофуроксана основан на реакции нуклеофильного замещения 5,7-дихлоро-4,6-дини-тробензофуроксана мета-нитроанилином. В качестве растворителя использовали изопропиловый спирт
с добавкой воды при соотношении 10:1, при температуре 30 °С со временем выдержки реакционной смеси 4 часа. При данных параметрах синтеза выход целевого продукта составил 93 %. Чистоту целевого продукта контролировали методом тонкослойной хроматографии, который установил, что реакция идет с целевым получением продукта без побочных реакций. В качестве вероятных примесей в сырце субстанции 5,7-бис(мета-нитроанилино)-4,6-ди-нитробензофуроксана могут выступать исходные вещества: 5,7-дихлоро-4,6-динитробензофуроксан и мета-нитроанилин.
Для внедрения нового лекарственного препарата в ветеринарную практику и для дальнейшего контроля его качества необходимо разработать стандартный образец. Разработка стандартного образца лекарственной субстанции обуславливает исследование ее свойств, разработку методик определения посторонних примесей, остаточных органических растворителей, используемых при синтезе и очистке субстанции, исследование микробиологической чистоты, разработку методик количественного определения точными и надежными методами. Для количественного определения активного вещества в современном фармацевтическом анализе используют методы спектроскопии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии. Однако эти методы нуждаются в наличии стандартных образцов. При отсутствии стандартного образца для лекарственной субстанции необходимо разработать прямой метод анализа. Анализ литературы показал, что в Европейской Фармакопее для количественного определения активного вещества в лекарственных субстанциях широко применяются титриметрические методы анализа [10]. Наиболее приоритетным, точным и надежным является метод потенциометрического титрования.
Потенциометрическое титрование субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана проводилось на иономере ЭВ-74 со стеклянным индикаторным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения. В мерном стакане вместимостью 100 см3 растворили 0,01 г (точная навеска) субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана в 25 см3 ацетонитрила и добавили 25 см3 воды сверхчистой, полученной на установке Millipor Waters. В полученный раствор погрузили электроды и тщательно перемешали с помощью магнитной мешалки [11]. Вследствие наличия у субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана слабо
выраженных кислотных свойств в качестве титранта выбран 0,1 М раствора натрия гидроксида [12]. После добавления каждой порции титранта (0,025 см3) раствор тщательно перемешивали и фиксировали значение электродного потенциала. Также был проведен холостой опыт, согласно которому холостой объем 0,1 М натра едкого составил 0,025 см3.
Начальное значение электродного потенциала субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензо-фуроксана в смеси воды и ацетонитрила (50 : 50 %, об) составило 180 мВ.
Количество 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана в титруемом растворе рассчитывали по значению эквивалентного объема титранта. Эквивалентный объем титранта, иначе говоря, точку эквивалентности, определяли простым методом по построенной кривой титрования. По оси абсцисс отложили объем прилитого титранта, а по оси ординат соответствующие значения э.д.с. Е, выраженные в мВ. По полученным данным построили график зависимости величины электродного потенциала от объема титранта и получили кривую потенциометрического титрования. По полученной кривой методом касательных определили точку эквивалентности и эквивалентный объем титранта [13].
Е, мВ
0,6 V, мл
■ Рис. 1. Кривая потенциометрического титрования субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробен-зофуроксана
Для наиболее точного определения точки эквивалентности построили дифференциальную кривую в координатах ДЕ/^ - V. На построенной дифференциальной кривой на точку эквивалентности указывает максимум. Через этот максимум опустили перпендикуляр на ось, соответствующую объему титранта, и определили объем титранта, израсходованного на титрование в точке эквивалентности [14].
Кп - коэффициент поправки 0,1 М раствора натра едкого;
m - масса навески 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, г;
W - потеря в массе при высушивании 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, %.
Валидация новых аналитических методик анализа лекарственных средств является обязательным требованием GMP. Валидация аналитических методик проводится в соответствии с такими международными документами, как ICH (The International Conference on the Harmonisation of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceiticals for Human Use), Q2B (Validation of analytical procedures: methodology), WHO Expert Commitee on specification for pharmaceutical preparations, Validation of analytical procedures used in the examination of pharmaceuticals, USA FDA (Food and Drug Administration), Guidelines for submitting samples and analytical date for methods validation. Согласно требованиям Европейской Фармакопеи диапазон применения при валидации методик количественного определения субстанций и лекарственных форм составляет 80-120 % от номинального содержания. Внутри данного диапазона должны быть доказаны линейность, правильность и прецизионность [10].
Проведена валидация методики количественного определения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом потенциометри-ческого титрования по показателям: специфичность, правильность, линейность, сходимость, промежуточная
Таблица 1
Значение электродного потенциала при титровании растворителя, испытуемого раствора 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, раствора мета-нитроанилина и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана
Объем титранта, см3 Е, мВ (растворитель) Е, мВ (исп. р-р 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана, 0,2 мг/см3) Е, мВ (р-р мета-нитроанилина, 0,2 мг/см3) Е, мВ ( р-р 5,7-дихлор-4,6-динитро-бензофуроксана, 0,2 мг/см3)
0,05 -101 174 -235 -85
0,1 -124 155 -270 -90
0,15 -146 122 -288 -95
0,20 -170 70 -295 -110
0,25 -191 -175 -303 -125
0,30 -213 -224 -310 -125
0,35 -235 -255 -316 -125
0,40 -258 -270 -320 -125
АЕ/АУ, мВ/мл
■ Рис.2. Дифференцированная кривая потенциометрического титрования субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана
Содержание активного вещества в субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана (%) рассчитывали в пересчете на абсолютно сухое вещество по формуле:
х _ ГС.« -^Х0.0498-Кп-100-100 т-(1ОО-И0 ,
где 1/экв - эквивалентный объем 0,1 М раствора натра едкого, используемого для титрования испытуемого раствора, см3;
/Х - объем 0,1 М раствора натра едкого, используемого для титрования в холостом опыте, см3;
Таблица 2
Оценка правильности методики количественного определения 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом добавок
№ Введено, г Найдено, г Коэффициент открываемости, % Метрологические характеристики (п = 9, Р = 95 %)
1 0,008 0,0079 98,75 Среднее значение X =99,99 %
2 0,008 0,0080 100,00 Дисперсия S2 = 1,03
3 0,008 0,0080 100,00 Среднее квадратичное отклонение S = 1,015 %
4 0,010 0,0099 99,00 Коэффициент Стьюдента t (95 %, Р) = 2,31
5 0,010 0,0102 102,00 Коэффициент вариации = 1,015 %
6 0,010 0,0101 101,00 Доверительный интервал АХ = ±0,78 %
7 0,012 0,0120 100,00 Относительная погрешность ё = 0,78 %
8 0,012 0,0119 99,17
9 0,012 0,0120 100,00
прецизионность, предел количественного определения и предел обнаружения.
Специфичность методики изучалась путем потенциометрического титрования растворителя, раствора мета-нитроанилина и раствора 5,7-дихлор-4,6-динитро-бензофуроксана в соответствующем растворителе: вода -ацетонитрил (50 : 50 %, об). При изучении специфичности методики было показано, что растворитель, используемый при подготовке, и вероятные примеси не влияют на результат количественного определения 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана.
Правильность методики проверена методом добавок при трехкратном анализе трех уровней концентрации 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана соответствующих 80, 100, 120 % от рабочей концентрации 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-дини-тробензофуроксана. Критерием оценки при определении правильности служило рассчитанное значение коэффициента вариации, которое согласно международным требованиям должно быть не более 2 % [15].
Среднее значение коэффициента открываемости составило 99,99 %, а значение коэффициента вариации при оценке правильности методики составило 1,015 %, что не превышает 2 % [15]. Коэффициент открываемости лежит в приемлемом диапазоне: от 98,0 до 102,0 %.
Линейность методики изучалась на 9 уровнях концентрации анализируемого вещества в диапазоне применения 80-120 % от нормируемого значения. Оценка линейности проводилась путем установле-
ния линейной зависимости между концентрацией 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензо-фуроксана и эквивалентным объемом титранта, по описанию установленной зависимости и расчета коэффициента корреляции.
Линейная регрессия вычислялась методом наименьших квадратов с получением уравнения регрессии, определением коэффициента корреляции (г), точки пересечения с осью ординат и тангенса угла наклона градуировочного графика.
0,26
х
0,24
ж и 2 м
| = 0,22 „ Я
I Ё
£ 0,20 еа
0,18
0,15 0,17 0,19 0,21 0,23 0,25 Концентрация, т/т1
■ Рис. 3. Зависимость эквивалентного объема титранта от концентрации 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-дини-тробензофуроксана
Согласно требованиям О значение коэффициента корреляции при изучении линейности аналитической методики определения количественного содержания активного вещества должно быть >0,999 [16].
Таблица 3
Результаты оценки линейной зависимости эквивалентного объема титранта от концентрации бис-(НФА)ДНБФО
При тестировании методики количественного определения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-ди-нитробензофуроксана методом потенциометрического титрования по показателю «линейность» установлено, что коэффициент корреляции (г) равен 0,999, следовательно, между эквивалентным объемом титранта и концентрацией 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана существует прямая линейная зависимость [16].
Сходимость методики оценивалась по результатам анализа шести отдельно приготовленных растворов, соответствующих 100 % рабочей концентрации 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана из одного образца субстанции при одинаковых условиях проведения анализа.
Промежуточная прецизионность методики оценивалась так же, как и сходимость, только при проведении анализов в разные дни и с использованием другой посуды.
Критерием оценки сходимости и промежуточной прецизионности методики служило вычисленное значение коэффициента вариации. Согласно требованиям [16] значение коэффициента вариации при оценке сходимости и промежуточной прецизионности должно быть не более 2,0 %.
Согласно табл. 4 и 5 методика характеризуется удовлетворительной сходимостью и промежуточной прецизионностью. Значение коэффициента вариации составило 0,05 %, что менее 2 % [16].
Таблица 4
Оценка сходимости методики количественного определения 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана
Исследуемый образец Эквивалентный объем титранта, см3
1 0,2240
2 0,2239
3 0,2241
4 0,2240
5 0,2242
6 0,2241
Среднее значение, см3 0,2241
Стандартное отклонение, см3 0,0001
Коэффициент вариации, % 0,05
Доверительный интервал (Р = 95 %), см3 От 0,2240 до 0,2242
Таблица 5
Оценка промежуточной прецизионности методики количественного определения 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана
Эквивалентный объем
Исследуемый образец титранта, см3
1-й день 2-й день
1 0,2239 0,2242
2 0,2240 0,2239
3 02240 0,2239
4 0,2241 0,2241
5 0,2241 0,2240
6 0,2240 0,2241
Среднее значение, см3 0,2241 0,2240
Стандартное отклонение, см3 0,0001 0,0001
Коэффициент вариации, % 0,05 0,05
Доверительный интервал От 0,2240 От 0,2239
(Р = 95 %), см3 до 0,2242 до 0,2241
Для исследования того, насколько диапазон применения методики превосходит ее предельные возможности, были вычислены предел обнаружения и предел количественного определения. Расчеты проводили при использовании величин стандартного отклонения свободного члена линейной зависимости Sa и наклона градуировочного графика. Рассчитано, что значение предела обнаружения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-дини-
№ Концентрация Эквивалентный объем титранта,
обр. мг/см3 % см3
1 0,16 80 0,184
2 0,17 85 0,193
3 0,18 90 0,204
4 0,19 95 0,214
5 0,20 100 0,224
6 0,21 105 0,234
7 0,22 110 0,244
8 0,23 115 0,254
9 0,24 120 0,263
Уравнение регрессии: у = 0,998х + 0,024
Тангенс угла наклона градуировочного графика: Ь = 0,998
Свободный член: а = 0,024
Коэффициент корреляции: г = 0,9995
тробензофуроксана составило 0,008 мг/см3, а предел количественного определения - 0,025 мг/см3.
В процессе исследований установлено, что метод потенциометрического титрования позволяет получить достоверные и надежные результаты, а также может быть использован для количественного определения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-дини-
тробензофуроксана. Проведенная валидация методики количественного определения субстанции 5,7-бис(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по показателям специфичности, правильности, линейности, сходимости, промежуточной прецизионности позволила получить значения, соответствующие заявленным критериям.
■..............ЛИТЕРАТУРА
1. Хмельницкий Л.И. Химия фуроксанов: Реакции и применение. М.: Наука, 1996. 430 с.
2. 5,7-Дизамещенный-4,6-динитробензофуроксан общей формулы C6N4O6(R1)2, обладающий акарицидной и бактерицидной активностью: пат. 2255935 Рос. Федерация. № 2003119046/04; зявл. 24.06.03; опубл. 10.07.05.
3. Новые бензофуроксаны, обладающие фунгицидной и бактерицидной активностью: пат. 2428419 Рос. Федерация. № 2009139700/04; заявл. 27.10.09; опубл. 10.05.11.
4. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных бензофуроксанов / Л.М. Юсупова [и др.] // Вестник Казан. технологич. ун-та. 2004. № 1. С. 103-111.
5. Фунгицидные и токсикологические свойства функционально замещенных нитробензофуроксанов / Л.М. Юсупова [и др.] // Хим.-фарм. журн. 2008. Т. 42. № 4. С. 27-29.
6. Биологическая активность 5,7-дизамещенных-4,6-динитробензофуроксанов / Л.М. Юсупова [и др.] // VIII Междунар. симп. по фундаментальным и прикладным проблемам науки: сб. ст. Миасс, 2013. С. 148-151.
7. Новый подход к созданию антигельминтных средств: изучение антигельминтной активности фармацевтической композиции соли фосфония и нитрозамещенного бензофуроксана / И.В. Галкина [и др.] // Уч. зап. Казан. ун-та. Сер. «Естеств. науки». 2010. Т. 152. № 2. С. 227-236.
8. Синтез и апробация нового поколения антигельминтиков / И.В. Галкина [и др.] // Российский паразитологический журнал. 2010. № 2. С. 99-105.
9. Антигельминтное лекарственное средство «Дегельм» для лечения нематодозов / И.В. Галкина [и др.] // Совр. проблемы ветеринарной фармакол. и токсикол. Материалы II съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. Казань, 2009. С. 66-71.
10. European Pharmacopoeia. (Ph. Eur). 2010. 7th ed. Strasbourg. France: European Directorate for the Quality of Medicines. Council of Europe.
11. Юсупова Л.М., Гармонов С.Ю., Мархабуллина Р.Ш. Количественное определение субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом потенциометрического титрования // Вестник Казан. технол. ун-та. 2014. Т. 17. № 5. С. 141-143.
12. Юсупова Л.М., Мархабуллина Р.Ш., Гармонов С.Ю. Исследование кислотно-основных свойств субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана // Вестн. Казан. технол. ун-та. 2013. Т. 16. № 5. С. 145-147.
13. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1, 11-е изд. М.: Медицина, 1987. 336 с.
14. Васильев В.П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Дрофа, 2012. 384 с.
15. Аладышева Ж.И., Беляев В.В., Береговых В.В. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик // Фармация. 2008. № 7. С. 9-14.
16. Эрмер Й., Миллер Дж. Валидация методик в фармацевтическом анализе. М., 2013. 495 с.
VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURE OF QUANTITATIVE
DETERMINATION OF 5,7-BIS(META-NITROPHENYLAMINO)-4,6-DINITROBENZOFUROXAN BY POTENTIOMETRIC TITRATION
*R.Sh. Markhabullina, L.M. Yusupova
Kazan National Research Technological University ulitsa Karla Marxa, 68, Kazan, 420015, Russian Federation *e-mail: remarkh@bk.ru
A new method of quantitative determination of the substance of 5,7-bis(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan using potentiometric titration method is developed. The method has high precision, reliability and sensitivity.
Key words: 5,7-bis(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan, validation, potentiometric titration.
