CC BY
126
Биомедицина • № 2, 2011, C. 73-78
е ПРАКТИКУМ
Определение перхлозона в плазме крови с использованием ВЭЖХ масс-спектрометрическим детектированием
А.М. Власов1,2, Ю.Н. Башкатова2, А.Ю. Савченко3, М.Р. Хаитов2, Г.В. Раменская1
1 — Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова, Москва
2 — Институт иммунологии ФМБА России, Москва
3 — Научный центр экспертизы средств медицинского применения, Москва Контактная информация: Галина Владиславовна Раменская ramenskaia@mail.ru
Разработан новый противотуберкулезный препарат — перхлозон. Хроматографирование осуществляли с использованием предколонки ZORBAX SB С18, 5 мкм, 35 мм х 2,1 мм и аналитической колонки ZORBAX SB С18, 5 мкм, 150 мм х 2,1 мм. Степень извлечения перхлозона из плазмы крови 88%. Относительное стандартное отклонение при оценке внутри- и междневной воспроизводимости менее чем 9,5% и 14,2% соответственно. Диапазон аналитических концентраций составлял 10-10000 нг/мл для масс-спектрометрического детектирования и 250-10000 нг/мл для спектрофотометрического детектирования. Предел количественного определения — 10 нг/мл для масс-спектрометрического детектирования и 250 нг/мл для спектрофотометрического детектирования.
Ключевые слова: перхлозон, ВЭЖХ, масс-спектрометрия, фармакокинетика.
В настоящее время во всем мире и в России сохраняется напряженная эпидемическая обстановка по туберкулезу [1, 3].
Распространение в 1980 — 1990 гг. штаммов микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (которые теперь определяются как устойчивые - по крайней мере, к Н и Я) поставило под угрозу успех мероприятий по борьбе с туберкулезом [4], привело к снижению эффективности химиотерапии [5, 6]. По данным специальных контролируемых исследований в ряде областей РФ частота выделения лекарственно-устойчивых МБТ среди впервые заболевших достигает 19-26%, при обследовании клиниче-
ских контингентов — до 38%, среди контингентов хронических больных ситуация еще серьезней — частота выделения лекарственно-устойчивых штаммов достигает 80-90% и при остропрогрессирующих формах — до 100% [7]. На фоне вынужденной полихимиотерапии с привлечением противотуберкулезных препаратов резервного ряда снижается функциональная активность систем защиты макроорганизма, регистрируются побочные реакции со стороны различных органов и систем, что обусловливает затяжное течение и хронизацию воспалительных процессов [8]. Все это определяет необходимость создания новых противотуберкулезных средств.
Перхлозон (перхлорат-4-тиоуреидо-иминометилпиридиния) рис. 1, противотуберкулезное средство, обладающий выраженным, строго избирательным ингибирующим действием на жизнеспособность микобактерий туберкулеза, чувствительных и устойчивых к существующим противотуберкулезным препаратам. Механизм его действия в настоящее время не известен. Перхлозон находится на стадии клинических испытаний и поэтому еще не имеет широкого клинического применения, что объясняет отсутствие в литературе методов его определения в биожидкостях и данных по его фармакокинетике.
В представленном исследовании нами была разработана простая и быстрая методика определения перхлозона в плазме крови с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с масс-спектрометрическим и спектрофотометрическим детектированием.
Материалы и методы
1. Реактивы
Перхлозон (перхлора-4-тиоуреидо-иминометилпиридиния, чистота 99,7%) был предоставлен разработчиком ОАО «Фармасинтез» (Россия), трифторук-сусная кислота и ацетонитрил (MERK KGaA Darmstadt, Германия), вода деионизированная и очищенная с использованием Milli-Q system MP-650, IWAKI Millipore, (Япония).
2. Приготовление стандартного и рабочих стандартных растворов перхлозона
Стандартный раствор 10 мг/мл готовили путем растворения точной навески перхлорат 4-тиоуреидоиминометилпири-диния в метаноле. Стандартный раствор хранили при температуре -40°С. Срок годности стандартного раствора — 3 месяца. Рабочие стандартные растворы перхлозона (500 мкг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл) готовили из стандартного раствора разведением водой. Использовали свежеприготовленные рабочие стандартные растворы.
3. Приготовление образцов плазмы крови для калибровки
Для калибровки при-0 бора и валидации методики использовали «чистую» плазму. Образцы для калибровки готовили добавлением к 1 мл плазмы 10-50 мкл рабочих стандартных растворов до получения финальных концентраций 10, 50, 100, 1000, 10000 нг/мл плазмы. Калибровочные кривые получали ежедневно.
4. Пробоподготовка
К 0,5 мл плазмы крови в пробирке типа «эппендорф» добавляли 1,5 мл ацетонитрила, смешивали на шейкере в течение 5 минут со скоростью 2500 об./ мин., и центрифугировали при 13200 об/ мин 10 минут. Надосадочную жидкость перемещали в виалу и упаривали в токе азота при нагревании до 40°С, к остатку после упаривания добавляли 200 мкл подвижной фазы и перешивали 15 сек. на вортексе, затем центрифугировали при 13200 об./мин. 5 минут и переносили 100 мкл супернатанта в микровиалу.
5. Оборудование
Хроматографическая система Agilent 1200, состоящая из дегазатора, бинар-
©/^
HN
VJ"
CH=N_NH C NH, ■ ClO,
S
Рис. 1. Химическая структура перхлозона (перхлорат 4-тиоуреидои-минометилпиридиния).
ного насоса, автосамплера, колоночного термостата, мультиволнового спектрофотометрического детектора и масс-спектрометрического квадрупольного детектора Agilent 6120. В качестве неподвижной фазы использовалась хроматографическая колонка Agilent «ZORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» с предколон-кой «ZORBAX SB C18 5мкм, 35*2,1мм».
6. Хроматографические условия
Разделение проводили на колонке Agilent «ZORBAX SB C18 5мкм, 150*2,1мм» при температуре колонки 400°С. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 0,1% раствора трифторуксусной кислоты (рН=2,6) в соотношении 85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Объем образца вводимый в систему составлял 20 мкл. Для детектирования использовали спектрофотометрический (длина волны — 317 нм) и масс-спектрометрический детекторы. Ионизацию проводили с помощью электроспрея при атмосферном давлении (API-ES), напряжение на капилляре 4000V, скорость азота 12 мл/мин, температура осушающего газа — 300°С. Детектирование проводили в режиме индивидуальных масс (SIM) по молекулярному иону 183,4 m/z. Время анализа составляло 5 минут. Время удерживания перхлозона в указанных условиях — 3,05 мин.
7. Дизайн фармакокинетического исследования
Фармакокинетическое изучение проводилось в рамках исследования переносимости, безопасности и фармакокинетики препарата на здоровых добровольцах, с целью выработки рекомендаций по режиму дозирования для последующих фаз клинических исследований. В исследование было включено 36 здоровых добровольцев (мужчин) от 19 до 38 лет, вес от — 58 до 92 кг, рост — от 170 до 190 см. Доброволь-
цы были сгруппированы на 4 группы по 9 человек. Каждая группа получала перхлозон однократно, в виде таблеток по 400 мг
— так, чтобы разовая доза составляла 400 мг (1 группа), 800 мг (2 группа), 1200 мг (3 группа), 1600 мг (4 группа), то есть соответственно 1, 2, 3 и 4 таблетки. Прием следующей дозы осуществлялся после оценки переносимости и безопасности предыдущей дозы. Образцы крови отбирались по 5 мл из локтевой вены до получения препарата и через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 6; 10; 12; 24 часа после его приема. Образцы центрифугировались, плазма отбиралась в отдельные пробирки и хранилась до проведения анализа при температуре 200°С не более одного месяца.
Результаты и их обсуждение
1. Оптимизация условий анализа
В данном исследовании нами разработана методика быстрого и простого определения перхлозона в плазме крови с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Кроме того, нами показана возможность применения спектрофотометрического детектирования, в виду высоких концентраций препарата в крови. Применение спектрофотометрических детекторов значительно упрощает анализ и позволяет определять содержание перхлозона до 250 нг/мл.
2. Линейность
Калибровочные кривые носили линейный характер во всем в диапазоне определяемых концентраций 10 нг/мл — 10000 нг/мл (для масс-спектрометрического детектирования) (г = 0,9986) и 500 нг/мл — 10000 нг/мл (для спектрофотометрического детектирования) (г = 0,9992).
3. Специфичность и чувствительность
Хроматограмма образца плазмы крови обладает хорошей селективностью,
что подтверждается отсутствием пиков интерферирующих эндогенных соединений в месте элюирования перхлозона.
Предел количественного определения рассчитывался как наименьшая концентрация анализируемого вещества, при которой отношение «сигнал:шум» составляло 10:1. Чувствительность методики для масс-спектрометрического детектирования составила 10 нг/мл, для спектрофотометрического 250 нг/мл, что являлось достаточным для определения содержания перхлозона в плазме крови добровольцев в течение 24 часов после однократного применения.
4. Степень извлечения из плазмы крови
Степень извлечения перхлозона из
плазмы крови определяли сравнением площадей пиков чистого стандарта, приготовленного из рабочего раствора и введенного в хроматографическую колонку, и площади пика экстракта, полученного из плазмы крови с добавлением аналогичного количества перхлозона (п=5 для каждой концентрации). Степень извлечения составила 88,4%, 88,6%, 87% для концентраций перхлозона 100 нг/мл, 500 нг/мл и 1 мкг/мл соответственно.
5. Воспроизводимость
Для оценки воспроизводимости проводили количественное определение с применением масс-спектрометрического детектора модельных смесей перхлозона и плазмы крови при различных концентрациях перхлозона. Для образцов, измеренных в течение дня, относительное стандартное отклонение составило 10,4%, 9,2%,
9,5% для модельных смесей, содержащих 100 нг/мл, 500 нг/мл и 1000 нг/мл перхлозона соответственно. Для измерений в течение недели относительное стандартное отклонение составило 13,5%, 11,4% и 14,2% для модельных смесей, содержащих 100 нг/мл, 500 нг/мл и 1000 нг/мл перхлозона соответственно.
6. Изучение фармакокинетики
Фармакокинетические параметры перхлозона рассчитывали модельнонезависимым методом. Максимальная концентрация в плазме крови (Стах) и время её достижения (Tmax) были получены непосредственно из результатов измерений. Значение площади под фармакокинетической кривой рассчитывали методом трапеций (AUC0-24). На рис. 2 представлены усредненные фармакокинетические кривые перхлозона в плазме крови после однократного перорального приема в дозе 400 мг, 800 мг, 1200 мг и 1600 мг. Рассчитанные фармакокинетические параметры представлены в таблице 1.
Как видно из представленных данных перхлозон быстро всасывается в системный кровоток (Tmax — в среднем — до 3 часов) и постепенно выводится из организма (Т — в среднем — до 20 часов).
О 5 10 1S 20 25 30
Врсмч, час
Рис. 2. Усредненные фармакокинетические профили перхлозона после однократного перорального приема в различных дозах, мкг/мл
Таблица 1
Средние значения фармакокинетических параметров перхлозона у здоровых добровольцев после однократного перорального приема в различных дозах
Параметр Однократная доза, мг
400 800 1200 1600
^ax, мкг/мл 2,61±0,34 5,07±0,69 5,42±0,65 8,17±1,91
Т max, час 2,2±0,8 1,6±0,4 1,8±0,4 3,1±0,7
AUC 0-24, мкг*час/мл 31,01±5,27 55,96±7,81 78,70±14,53 112,67±24,26
Т 1/2, час 17,3±3,9 19,7±4,6 * *
* Период полувыведения рассчитан для доз 400 и 800 мг, так как при введении в дозах 1200 и 1600 мг концентрации в конечной точке достаточно велики, а AUC0 (<80% AUC0
Максимальная концентрация перхлозона составляет 2,61+0,34 мкг/мл, 5,07+0,69 мкг/мл, 5,42+0,65 мкг/мл и 8,17+1,91 мкг/ мл для доз 400, 800, 1200 и 1600 мг соответственно. Кинетика перхлозона в диапазоне изучаемых доз является линейной.
Выводы
Описана ВЭЖХ методика для определения нового противотуберкулезного препарата перхлозон в плазме крови. Методика пригодна для фармакокинетических исследований, поскольку обладает необходимой линейностью, точностью и воспроизводимостью. Предел количественного определения при масс-спектрометрическом и спектрофотометрическом детектировании позволяет определять терапевтические уровни концентрации перхлозона в плазме крови.
Список литературы
1. Мишин В. Ю. Современная стратегия лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких // Лечащий врач. — 2000. — № 3. — с. 4-10.
2. Перельман М. И. Фтизиатрия. Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2007.
3. Репин Ю. М. Лекарственноустойчивый туберкулёз лёгких // Хирургическое лечение. — СПб., «Гиппократ».
— 2007. — с.168.
4. Попович В.К. Медикоэкономический анализ и прогноз проблем туберкулеза в России // В.К. Попович. Автореферат дис. док-ра мед.наук .
— М. — 2005. — с. 53.
5. Шилова М. В. Туберкулёз в России в 2007 году // Монография. — М. — 2008.
6. Burwen DR, Bloch AB, Griffin
LD, et al. National trends in the concurrence of tuberculosis and acquired immunodeficiency syndrome. // Arch Intern Med. — 1995. — 155:1281-6.
7. Multidrug-resistant tuberculosis // Edited by Ivan Bastian and Francoise Portaels. Kluwer Academic Publishes. — 2000.
8. Harkin T., Harris H. Treatment of multidrug resistant tuberculosis. // In Rom W., Stuart G. Tuberculosis, Little Brown and Co., New York. — 1996. — р. 843-850.
Биомедицина • № 2, 2011, С. 78-83
High performance liquid chromatographic determination of perchlozone in serum using mass spectrometric detection and its application in human pharmacokinetic studies
А.М. Vlasov, Y.N. Bashkatova, A.Y. Savchenko, M.R. Khaitov, G.V. Ramenskaya
A new sensitive high-performance liquid chromatographic (HPLC) method with ultraviolet and mass spectrometry detection was developed for determination of perchlozone, a new Russians antitubercular medicine, in human plasma. Perchlozone were extracted from plasma using acetonitrile and the extract was injected into a column (ZORBAX SB C18 precolumn, 5 ^m, 35 mm x 2,1 mm I.D.) for clean-up and column (ZORBAX SB C18 analytical column, 5 ^m, 150 mm x 2,1 mm I.D.) for separation. Mean absolute recoveries were 88.0 for perchlozone. Intra- and inter-day relative standard deviations were less than 9,5 and 14,2% for perchlozone, at the different concentration ranges. The validated concentration ranges of this method were 10-10000 ng/ml for mass spectrometryc determination and 250-10000 ng/ml for ultraviolet detector determination. The limits of quantification were 10 ng/ml for mass spectrometryc determination and 250ng/ml for ultraviolet detector determination.
Key words: perchlozone; HPLC; pharmacokinetic, mass spectrometry.
Способ моделирования синдрома хронической усталости в эксперименте
М.А. Самотруева1, Д.Л. Теплый2, Т.К. Сережникова1, Н.Р. Кулешевская1
1 — Астраханская государственная медицинская академия, Астрахань
2 — Астраханский государственный университет, Астрахань
Контактная информация: Сережникова Татьяна Константиновна 414057 г.Астрахань, ул.Звездная, д.9, кор.1, к.28.
Предложен способ моделирования «синдрома хронической усталости» в эксперименте, включающий сочетание информационного (формирование пищедобывательного поведения в многоальтернативном лабиринте), физического (плавание с грузом 10 % от массы тела) и социального (агонистические конфронтации между особями) воздействий. Доказано, что комплекс хронических истощающих воздействий сопровождается дисбалансом нейроиммунорегуляторных механизмов, лежащих в основе формирования данного патологического состояния.
Ключевые слова: «синдром хронической усталости», информационно-физический стресс, агонистические конфронтации, нейроиммунный дисбаланс.
«Синдром хронической усталости» (СХУ) — одно из достаточно распространенных патологических состояний настоящего времени, развитие которого
связано, прежде всего, с особенностями современной жизни населения крупных городов, типом жизни в развитых странах, а также чрезмерной эмоционально-
