CC BY
34
УДК 543.426:543.862
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕФЛОКСАЦИНА В МОЧЕ МЕТОДОМ СИНХРОННОЙ ФЛУОРИМЕТРИИ
И.Я. Камочкина, Е.М. Рехарская, А.П. Чухаркина, А.Г. Борзенко
(кафедра аналитической химии; e-mail: borzenko@environment.chem.msu.ru)
На примере пефлоксацина показана принципиальная возможность определения антибиотиков класса фторхинолонов в биологических жидкостях на основе регистрации синхронных спектров флуоресценции. Показано, что чувствительность определения увеличивается при хелатообразовании пефлоксацина с ионами металлов в мицеллярной среде.
Одной из важных задач является контроль за содержанием фторхинолонов, поступающих в организм во время лечения инфекций мягких тканей. По существующим юридическим нормам процесс отбора биопробы не должен причинять пациенту неудобств, в частности, отбор крови из вены допустим только в тех ситуациях, когда жизни человека угрожает опасность. Моча представляет собой один из наиболее информативных объектов для анализа, поскольку с ней выводится из организма большинство лекарственных соединений.
Необходимо отметить, что анализ мочи осложняется рядом факторов. Одним из них является изменение рН среды с течением времени из-за действия бактериальной флоры, выделяющей аммиак. Другим фактором является наличие в составе мочи низкомолекулярных продуктов метаболизма аминокислот и сахаров (аминов, карбоновых кислот и др.), небольших количеств пептидов и сахаров, стероидов и пигмента уробилина, окрашивающего мочу в желтый цвет. В составе мочи помимо органических соединений содержится значительное количество неорганических солей: хлоридов, фосфатов, оксалатов, уратов и т.д.
Как правило, наиболее важной задачей подготовки образца к анализу является выделение анализируемого вещества из биологической матрицы. Наиболее распространенным методом извлечения лекарственных соединений из мочи является жидкостная экстракция, реже используется твердофазная экстракция [1].
Основными аналитическими методами при определении препаратов в биологических пробах являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография [2-5]. Эти методы, несмотря на их очевидные достоинства, требуют использования сложной и дорогой аппаратуры, высококвалифицированного персонала и в связи с этим не всегда доступны для рядовых аналитических лабораторий и монито-
рингового контроля. Благодаря своей жесткой структуре большинство фторхинолонов обладают собственной флуоресценцией. Поэтому для определения их в моче перспективно использовать люминесцентные методы, поскольку они достаточно экспрессны и высокочувствительны, а в ряде случаев позволяют проводить определение препаратов без предварительного отделения матрицы.
Настоящая работа посвящена оценке возможности определения люминесцентными методами антибиотиков класса фторхинолонов (на примере пефлоксацина) в моче без предварительного концентрирования.
Экспериментальная часть
Реактивы. В работе использовали 1,0x10 М раствор гидрохлорида пефлоксацина ("Sigma", США). Более разбавленные растворы готовили последующим разбавлением исходного непосредственно перед проведением эксперимента. Полученные растворы хранили в темном месте не более 1 недели во избежание фотохимического разрушения соединений. Растворы хлорида кальция, нитрата магния, хлорида алюминия и нитрата железа(Ш) ("Химмед ", Россия) с концентрациями
1,0x10 М готовили растворением соответствующих навесок в дистиллированной воде.
При определении констант устойчивости хелатов концентрацию солей варьировали в диапазоне 2,0x10-6 - 2,0x10-5 М. Необходимое значение pH устанавливали с помощью 0,1 М растворов гидрокси-да калия и соляной кислоты. Исходный раствор до-децилсульфата натрия (ДСН) ("Acros", Германия) с концентрацией 0,1 М готовили растворением соответствующей навески в дистиллированной воде в ультразвуковой бане. Для определения пефлоксацина в биологической жидкости (моче) использовали образец, полученный от здорового человека.
Аппаратура. Спектры флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре "Панорама" ("Люмэкс", Россия). Для измерения использовали кварцевые кюветы (/ = 1 см).
Результаты и обсуждение
Анализ спектра флуоресценции пефлоксацина.
Жесткая структура фторхинолонов позволяет при комнатной температуре получать хорошо разрешенные электронно-колебательные спектры фосфоресценции. В основе спектральной селекции люминесцентного метода лежит использование различий в основных спектральных параметрах исследуемых веществ и фона: длинах волн возбуждения и испускания, а также интенсивностях люминесценции. Решение подобных задач возможно на основе трехмерного представления флуоресцентных характеристик, получившего в англоязычной литературе название emission-excitation spectra (EES) или emission-excitation matrix (EEM). Буквальной аналогией этих названий можно будет считать термин "спектры возбуждения-эмиссии" (ВЭ) Такой способ представления данных содержит в себе максимальное количество информации о люминофоре, включая абсорбционные и эмиссионные характеристики, а также направление максимального изменения сигнала, знание которого необходимо для реализации синхронного сканирования. Выбор оптимальных длин волн возбуждения и регистрации индивидуальных веществ в этом случае значительно упрощается.
Спектр ВЭ флуоресценции водного раствора пефлоксацина представлен на рис. 1. На спектре пефлоксацина наблюдаются два максимума возбуждения (283 и 330 нм). Максимум эмиссии расположен при 446 нм. Полученный нами спектр хорошо согласуется с литературными данными [6].
Синхронные спектры флуоресценции пефлоксацина и образца мочи. Поскольку сигнал флуоресценции пигмента уробилина, входящего в состав мочи, достаточно интенсивен, использование традиционной флуориметрии для спектрального определения фторхинолонов представляется малоэффективным. Кроме того, области спектров флуоресценции пефлоксацина и уробилина значительно перекрываются (350-500 нм).
В этом случае удобно использовать синхронную флуориметрию. Сущность метода заключается в измерении спектра флуоресценции при одновременном изменении длин волн возбуждающего и регистрируемого излучений. В процессе такого сканирования поддерживается постоянная разность между энергиями возбуждающего и регистрируемого излучений. Применение синхронного сканирования приводит к значительному упрощению вида регистрируемого спектра. Безусловно, такой подход оказывается весьма перспективным для анализа биологических образцов.
Нами были измерены синхронные спектры флуоресценции образца мочи, разбавленного в 100 раз, и раствора пефлоксацина при различных сдвигах АХ: от 5 до 200 нм (через 10 нм). На рис. 2 представлены
синхронные спектры мочи и пефлоксацина при различных АХ.
Установлено, что максимальная разница между интенсивностью флуоресценции пефлоксацина и интенсивностью флуоресценции уробилина наблюдали при АХ = 150 нм. При этом пик в синхронном спектре, соответствующий пефлоксацину, имел минимальную ширину. Сигнал пефлоксацина превышал сигнал фона, обусловленный собственной флуоресценцией биологической матрицы, в десятки раз. Эту разницу длин волн выбрали для всех дальнейших измерений.
Хелатообразование пефлоксацина с А1(111). Известно, что фторхинолоны образуют хелаты с различными ионами металлов [7, 8]. Флуоресценция данных комплексов в некоторых случаях в несколько раз превышает собственную флуоресценцию исследуе-
мых веществ. Значительное увеличение интенсивности флуоресценции хелатов по сравнению с фторхино-лонами можно объяснить формированием "жесткой" структуры шестичленного цикла, образованной карбонильной и карбоксильной группами веществ и катионом металла. На образование хелатов фторхинолонов
влияют размер и заряд иона металла. Двухзарядные
^ +2
и трехзарядные ионы металлов, такие, как Са , М^, АР и Бе , способны изменять интенсивность сигнала. В данной работе изучали образование хела-тов пефлоксацина с ионами кальция, магния, алюминия и железа(Ш). Показано, что наиболее устойчивый комплекс пефлоксацина (^ К = 5,7) образуется с ионом алюминия в слабокислой среде.
Определение пефлоксацина в моче. С целью максимального увеличения сигнала флуоресценции
Рис. 2. Синхронные спектры флуоресценции пефлоксацина и образца мочи при разных значениях АХ (нм): а - 60, б - 110,
в - 150, г - 200
Рис. 3. Синхронные спектры флуоресценции пефлоксацина и образца мочи при ДХ = 150 нм в присутствии додецилсульфата натрия (с = 2,5х10-2М) и хлорида алюминия (с = 1,5х10-4 М)
определение пефлоксацина в моче мы проводили в присутствии оптимальных концентраций хлорида алюминия и додецилсульфата натрия [9]. Известно, что в основе мицеллярно-стабилизированной флуоресценции лежит способность мицелл поверхностно-активных веществ концентрировать частицы, уменьшать их колебательную энергию и снижать влияние тушителей, тем самым увеличивая сигнал флуоресценции. Установлено, что оптимальные концентрации хлорида алюминия и додецилсульфата натрия составляют 1,5x10 -2
и 2,5x10 М соответственно. Использование этих реагентов для определения пефлоксацина в моче методом синхронной флуоресценции позволяет увеличивать интенсивность пефлоксацина более чем в
6,5 раз (рис. 3). Отметим, что в этих условиях фоновый сигнал флуоресцирующих компонентов мочи остается практически неизменным. Это позволило определять данный препарат в моче без предварительного отделения матрицы.
Проверку правильности определения пефлоксацина в моче проводили методом "введено-найдено". Готовили серию растворов с концентрацией пефлоксацина в моче 1,7-33,3 мкг/мл. Оптимальные условия измерений обеспечивали добавлением всех необходимых реагентов в соответствующих количествах. Предел обнаружения пефлоксацина по такой методике составил 0,1 мкг/мл. Результаты определения пефлоксацина в образцах мочи приведены в таблице.
Таким образом, показана принципиальная возможность использования метода синхронной флуоримет-рии для определения пефлоксацина в моче на следовом уровне без предварительного выделения его из биологической матрицы.
Результаты определения пефлоксацина в моче (п = 3, Р = 0,95)
Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл
1,7 1,6±0,2
3,3 3,4±0,2
16,7 16,5±0,2
33,3 33,5±0,2
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Clarke E. G. C. Clarkes isolation and identification of drugs. L.,
1985.
2. Samanidou V.F., Demetriou C.E., Papadoyannis I.N. // Anal.
Bioanal. Chem. 2003. 375. P. 623.
3. RizkM, BelalF, Aly F.A., El-Enany N.M. // Talanta. 1998. 46.
P. 83.
4. Kamberi M., Kamberi P., Nakano S. // J. Chromatography B.
2000.741. P. 295.
5. Immanuel C., Hemanth Kumar A.K. // J. Chromatography B.
2001.760. P. 91.
6. AlbiniA., MontiS. // Chem. Soc. Rev. 2003. 32. P. 238.
7. El-Kommos M.E., Saleh G.A., El-Gizawi S.M., Abou-Elwafa
M.A. // Talanta. 2003. 60. P. 1033.
8. DjurdjevicP.T., Jelikic-StankovM., StankovD. // Anal. Chim.
Acta. 1995. 300. P. 253.
9. Perez-Ruiz T., Martinez-Lozano C., Tomas V., Carpena J. //
Analyst. 1999. 122. P. 705.
Поступила в редакцию 08.06.06.
DETERMINATION OF PEFLOXACIN IN URINE BY SYNCHRONOUS FLUORIMETRY
I. Ya. Kamochkina, Ye.M. Rekharsky, A.P. Chukharkina, A.G. Borzenko
(Division of Analytical Chemistry)
The possibility of determination of fluoroquinolone antibiotics in biological liquids by using synchronous fluorimetry is shown in present article. It is demonstrated that sensibility of determination increases using formation complexes of pefloxacin with metal ions in micellar medium.
