CC BY
40
УДК 544.522.121.2:546.661:615.33
ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕФЛОКСАЦИНА В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ ^
Т. Д. Смирнова, Е. А. Желобицкая, Т. Г. Данилина
Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского E-mail: smirnovatd@mail.ru
Показано, что пефлоксацин образует с тербием комплексы в нейтральной и слабокислой среде, которые характеризуются переносом энергии. Установлено, что в мицеллярной среде ПАВ эффективность переноса энергии возрастает. Максимальное увеличение интенсивности сенсибилизированной флуоресценции наблюдается в присутствии мицелл додецилсульфата натрия. Разработана флуориметрическая методика определения пефлоксацина в лекарственном препарате. Ключевые слова: пефлоксацин, люминесценция, тербий, перенос энергии возбуждения.
Fluorimetric Determination of Pefloxacin in Pharmaceutical Preparation
T. D. Smirnova, E. A. Zhelobitskaya, T. G. Danilina
It is shown that pefloxacin forms a terbium complexes in neutral and mildly acidic conditions which are characterized by energy transfer. It is found that the micellar surfactant medium energy transfer efficiency increases. The maximum increase sensitized fluorescence intensity is observed in the presence of SDS micelles. A fluorimetric method for determination of pefloxacin in the drug was developed. Key words: pefloxacin, luminescence, terbium, excitation energy transfer.
DOI: 10.18500/1816-9775-2016-16-4-372-376 Введение
Пефлоксацин (ПФ) - препарат группы фторхинолонов второго поколения, обладающий бактерицидным действием, применяется в клинической практике лечения инфекций дыхательных путей, вызванных грамотрицательными и грамположительными аэробными бактериями. Многочисленные случаи фальсификации лекарственных препаратов антимикробного действия вызывают необходимость в осуществлении контроля качества выпускаемой продукции фармацевтической промышленности с помощью простых, доступных и экспрессных методов.
Для определения содержания антибиотиков группы фторхинолонов чаще используют хромато-графические, хромато-масс-спектрометрические и флуориметрические методы. Значительным преимуществом люминесцентных методов является простота, экспрессность и высокая чувствительность. В качестве аналитического сигнала исполь-
ÎjpS I
rv//I/
зуют интенсивность собственной флуоресценции пефлоксацина (Хвозб = 278 нм, Хфлуор = 432 нм) в мицеллярных средах анионного поверхностного активного вещества ДДС [1]. Диапазон определяемых содержаний в плазме крови и лекарственных препаратах составляет 0,06-1,20 мкг/мл, предел обнаружения - 0,06 мкг/мл.
Известна методика определения норф-локсацина (НОР), ципрофлоксацина (ЦФ) и пефлоксацина в сыворотке крови, основанная на измерении сенсибилизированной флуоресценции иона ТЪ3+в присутствии второго лиганда триоктилфосфиноксидапри рН 5.5 в мицеллярных растворах цетилпиридиния (ЦПХ) [2]. При поглощении электромагнитного излучения ПФ переходит в возбужденное синглетное, затем триплетное состояние, обладающее большей продолжительностью жизни. Превышение энергии триплета резонансного уровня иона ТЪ3+ обеспечивает внутримолекулярный перенос энергии на ион металла с последующей люминесценцией (Хфл = 490; 545; 580; 620 нм), соответствующей переходам 5Э4 ^ 7Р6, 5Э4 ^ 7Р5, 5Э4 ^ 7Р4, 5Э4 ^ ^ 7Б3. Максимальная флуоресценция наблюдается при сверхчувствительном переходе с Хфл = 545 нм. В случае использования вторых лигандов, содержащих хромофорные группы, возможно увеличение интенсивности флуоресценции, связанное не только с замещением остаточных молекул воды в координационной сфере иона комплексообразователя, но и с дополнительным лиганд-метальным внутримолекулярным переносом энергии возбуждения (усилением эффекта антенны). В этой связи представляет интерес апробация в качестве второго лиганда хромофорсодержащих реагентов, эффективных сенсибилизаторов РЗЭ, таких как производные 2,2-бипиридина или в-дикетоны.
Известен флуориметрический способ определения ПФ в присутствии серебряных нано-частиц [1], которые способствуют увеличению интенсивности сенсибилизированной флуоресценции комплекса с ТЪ3+ и позволяют понизить
© Смирнова Т. Д., Желобицкая Е. А., Данилина Т. Г2016
Т. Д. Смирнова и др. Флуориметрическое определение пефлоксацина
предел обнаружения до 0,8^10"10 г/мл. Однако механизм взаимодействия не изучен.
Целью работы явилось изучение флуоресцентных свойств ПФ и его комплекса с ионом ТЬ3+в присутствии хромофорсодержащих органических лигандов, мицелл различной природы ПАВ в растворах и на поверхности целлюлозной матрицы.
Экспериментальная часть
Реагенты. Пефлоксацин мезилата дигидрат, «Sigma-aldrich» с содержанием основного вещества не менее 99%. Раствор 1.0 • 10-2 М готовят растворением точной навески в воде. Поверхностно-активные вещества: неионогенные Тритон X-100,«Sigma», содержание основного вещества не менее 99%; Бридж-35, «Acros», основного вещества не менее 99%; Твин-80, «Sigma» с основным веществом не менее 99%; анионные: натрия додецилсульфат (ДДС), «AppliChem», содержание основного вещества не менее 99%; катионные - цетилпиридиний хлорид, «Sigma», содержание основного вещества не менее 96%. Растворы с концентрацией 1 • 10-1 М готовят растворением точной навески веществ в воде. 1,10-Фенантролин солянокислый, квалификации х.ч. фирмы «Chemapol» готовили концентрацией 1.0-10-2 растворением точной навески в бидистиллированной воде. В качестве второго лиганда выступает 2,9-диметил-4,7-дифенил-1,10-фенантролин (ДДФен), «Fluka», с содержанием основного вещества не менее 98%. Раствор с концентрацией 1.0 -10-2М готовят растворением точной навески в н-пентаноле. Триоктилфосфи-ноксид (ТОФО), «Sigma», основного вещества не менее 99%, используют раствор в этаноле концентрацией 1.0 •Ю-2 М. Теноилтрифтораце-тон (ТТА), «Fluka», с содержанием основного вещества не менее 98%. Раствор с концентрацией 1.0-10-2 М готовят растворением точной навески вещества в этиловом спирте. Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) классификации ч.д.а., «Реахим», готовят растворением точной навески в бидистиллированной воде.
Аппаратура. Спектрофлуориметр LS-55 фирмы «Perkin - Elmer», источник возбуждения - импульсная ксеноновая лампа. Ширина щели возбуждения 10 нм, флуоресценции 5 нм. Скорость регистрации спектров 300 нм/мин. Измерения проводят в кварцевой кювете с толщиной слоя 1 см. Сигнал регистрируют под углом 90° к возбуждающему свету в режиме времени разрешенной флуоресценции со временем за-
держки 0,03 мс. Значение рН контролируют на рН-метре рН-673 М со стеклянным индикаторным электродом и хлоридсеребряным электродом сравнения.
Автоматические дозаторы ЬаЬМЛТБ объемом: 0,5-10; 20-200; 100-1000 мкл.
Результаты и их обсуждение
Спектральные характеристики ПФ.
Спектр возбуждения ПФ характеризуется полосой невысокой интенсивности ^возд= 279 нм и соответственно обладает незначительной собственной флуоресценцией, поэтому для его определения используют методики, основанные на измерении сенсибилизированной флуоресценции его комплексов с ионами ТЬ3+. Нами показано, что в системе ТЬ3+- ПФ осуществляется перенос энергии возбуждения от триплета ПФ на резонансный уровень иона ТЬ3+. При введении в раствор ПФ различных добавок соли иона ТЬ3+ наблюдается тушение собственной флуоресценции лиганда. В то же время в спектре появляются новые полосы эмиссии, характерные для флуоресценции иона ТЬ3+, интенсивность которых возрастает с увеличением его концентрации (рис. 1). Линейная зависимость тушения флуоресценции лиганда-донора от концентрации акцептора - ионов ТЬ3+ позволяет предположить статический механизм переноса энергии возбуждения, связанный с процессами комплексообра-зования в исследуемой системе.
Влияние мицелл ПАВ. Эффективность переноса энергии в бинарном комплексе возрастает при переходе от гомогенных водных растворов к микрогетерогенным организованным средам мицелл ПАВ. Роль мицелл состоит в концентрировании, сближении компонентов комплекса, увеличении его устойчивости и экранировании флуоресцирующего центра от посторонних тушителей [3]. Изучено влияние мицелл различных типов ПАВ на интенсивность сенсибилизированной флуоресценции хелата ТЬ3+- ПФ. Проведение реакции комплексообра-зования в среде неионогенных (Тритон Х-100, Бридж-35, Твин-80) и катионного (ЦПХ) ПАВ сопровождается тушением сенсибилизированной флуоресценции. Использование мицеллярного раствора анионного ДДС позволяет увеличить интенсивность эмиссии системы в 3 раза, что связано с эффективной солюбилизацией положительно заряженного комплекса в мицеллы с отрицательно заряженной поверхностью (рис. 2). Оптимальная концентрация ДДС составляет 1,0 10-3 М.
'фл 1 п
■Di 7F5
Рис. 1. Спектры флуоресценции растворов комплексовТЬ3+- ПФ: 1 - СТЬ(111) = 110-5 М; 2 - СТЬ3+= 510-5 М; 3 - СТЬ3+= 110-4 М; 4 - СТЬ3+ = 510-5 М; 5 - СТь3+= 1-10-3 М; Спф= 110Т М; ^ = 279 нм
'фл 1,2
470 490 510 530 550 570 590
нм
Рис. 2. Спектры флуоресценции растворов комплексов: 1 - Tb3+- ПФ -ДДС; 2 - Tb3+-ПФ; 3 - Tb3+-ПФ-ЦПХ; 4 - Tb3+-ПФ-Бридж-35; 5 - Tb3+- ПФ-Тритон X-100; 6 - Tb3+-ПФ - Твин-80; СПФ = 110-5 М, CTb(III) = 110-3 М;
рН = б.0, ^возб = 279 нм
1
Влияние второго лиганда. В качестве второго лиганда выступают органические реагенты, которые чаще всего используются на практике во флуориметрическом анализе: ДДФен, ЭДТА, Фен, ТОФО и ТТА. Установлено, что в присутствии ДДФен в системе образуется труднорастворимое соединение. Введение добавок Фен и ТТА к растворам ТЬ3+-ПФ сопровождается тушением флуоресценции, что, по-видимому, связано с конкурирующим комплексообразованием
(рис. 3). В присутствии ЭДТА и ТОФО интенсивность сенсибилизированной флуоресценции практически не изменяется (см. рис. 3). Таким образом, применение второго лиганда в исследуемой системе не имеет практического значения.
Оптимальные условия флуоресценции. Показано, что интенсивность сенсибилизированной флуоресценции в системе ТЬ3+ - ПФ -ДДС зависит от кислотности среды и максимальна при рН 5.5-6.5 (рис. 4).
Т. Д. Смирнова и др. Флуориметрическое определение пефлоксацина
450
470
490
510
530
550
570
590
Л, нлп
Рис. 3. Спектры флуоресценции растворов комплексов: 1 - ТЪ3+-ПФ-без 2-го лиганда-ДДС; 2 - ТЬ3+-ПФ -ТОФО -ДДС; 3 - ТЬ3+- ПФ -ЭДТА-ДДС; 4 - ТЪ3+-ПФ-Фен-ДДС; 5 - ТЪ3+-ПФ -ТТА-ДДС; СПФ= 110-5 М; СТЪ3+= 110-3 М; рН = 6.0; ^возб=279 нм
'фл V
1
-
0,6 -(И 0,2 -
4 5 & 7 В 9 10
РН
Рис. 4. Влияние кислотности среды на интенсивности сигнала сенсибилизированной флуоресценции хелата ТЪ3+-ПФ в мицеллярных растворах ДДС. СТъ3+ = 6 10-5 М, Спф = 1'10-5 M, ^возб = 279 нм
Порядок сливания компонентов также влияет на интенсивность аналитического сигнала. Оптимальный результат измерения флуоресценции достигается при следующей последовательности добавления компонентов реакции: ДДС-ПФ-ТЪ3+.
Применяя способ регистрации люминесценции в сочетании с разрешением во времени, можно увеличить интенсивность аналитического сигнала. Нами установлено, что возрастание времени задержки измерения сигнала способ-
ствует росту его интенсивности. Максимальное значение люминесценции наблюдается в случае задержки-0.03 мс.
Влияние сорбции. В качестве матрицы для иммобилизации комплекса ТЪ3+ -ПФ использовалась фильтровальная бумага, обработанная 1.0 М раствором сахарозы, позволяющая уменьшить неоднородность материала, устранить влагу, подавить диффузию флуоресцирующих частиц. Интенсивность аналитического сигнала увеличивается в присутствии анионного
ПАВ-ДДС, катионные и неионогенные способствуют тушению флуоресценции. Оптимальная концентрация ДДС составляет 1.0 10-3 М. Интенсивность флуоресценции системы зависит от кислотности среды и максимальна при рН 5,0-6,5.
Нами показано, что интенсивность флуоресценции системы ТЬ3+ -ДДС зависит от концентрации ПФ, но в случае проведения определения в растворе линейная зависимость соблюдается в более узком диапазоне концентраций с меньшей чувствительностью (табл. 1).
Таблица 1
Линейная зависимость интенсивности флуоресценции системы ТЪ3+- ДДС от концентрации ПФ в растворе и на поверхности матрицы
Система Диапазон концентраций ПФ, М Уравнение линейности г2
Раствор 5.010-8 - 1.010-5 Y= -0.70 х + 6.1 0.982
Матрица 2.0-10-8 - 1.010-5 Y= -0.64 х + 5.8 0.991
Определение ПФ в препарате «Абактал». На основании проведенных исследований разработана флуориметрическая методика определения содержания ПФ в лекарственном препарате «Абактал» («Ьек», Словения) с использованием метода градуировочного графика.
10-15 таблеток препарата растирают в ступке до порошкообразного состояния, навеску (соответствующую весу одной таблетки) переносят в колбу, объемом 25 мл, растворяют в бидистиллированной воде, в ультразвуковой ванне (20 мин.). Аликвотную часть (0.200.30 мл) предварительно разбавленного в 100 раз раствора переносят в пробирку, добавляют 1 мл буферного раствора (рН 6.0), 0,2 мл 110-2 М раствора соли ТЬ3+; 0,4 мл 110-1 М ДДС, буферный раствор до общего объёма 4 мл. Измеряют интенсивность флуоресценции с временной задержкой 0,03 мс (^возб = 278 нм, Хфл = 545 нм) и по градуировочному графику определяют содержание ПФ в лекарственном препарате.
В табл. 2 представлены результаты определения ПФ в лекарственном препарате. Правильность контролировали методом «введено - найдено» (табл. 3). Кроме ПФ в состав таблетки входят вспомогательные вещества: крахмал,
поливинилпирролидон, лактоза, стеарат кальция, целлюлоза. Предварительный эксперимент позволил установить, что вспомогательные вещества при данных содержаниях не оказывают мешающего действия.
Таблица 2
Результаты определения пефлоксацина в лекарственном препарате «Абактал» (п = 3, р = 0,95). Заявленное содержание 400 мг
Образец Найдено, мг
х ± Ах Sr
1 490 ± 290 0.12
2 410±150 0.15
Таблица 3
Контроль правильности определения пефлоксацина в препарате «Абактал» методом «введено - найдено» (п = 3, р = 0,95, *Табл= 4,30)
Введено, мг/л Найдено, мг/л Sr ^кспер
0,47 0,51 ± 0,01 0,03 2,17
0,23 0,23 ± 0,02 0,04 1,73
0,93 0,96 ± 0,04 0,02 2,02
Выводы
В результате проделанных исследований сделаны следующие выводы:
1. Установлено, что ПФ в нейтральной и слабокислой средах образует комплекс с ионом Tb3+, характеризующийся переносом энергии возбуждения;
2. Показано, что в присутствии мицелл ДДС интенсивность флуоресценции системы Tb3+-ПФ увеличивается в 3 раза;
3. Разработана флуориметрическая методика определения ПФ в лекарственном препарате.
Список литературы
1. Du L. M., Wang J. P., Wang C. X. The fluorescence characteristics of micelle inclusion of pefloxacin and its application // Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 2004. Vol. 24, № 7. P. 855-857.
2. Veiopoulou C., Ioannou P., Lianidou E. Application of terbium sensitized fluorescence for the determination of fluoroquinolone antibiotics pefloxacin, ciprofloxacin and norfloxacin in serum // J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2003. Vol. 15, № 12. P. 1839-1844.
3. Shtykov S. N. Surfactants in analysis : Progress and development trends // J. of Analyt. Chem. 2000. Vol. 55, № 7. P. 608-614.
Образец для цитирования:
Смирнова Т. Д., Желобицкая Е. А., Данилина Т. Г. Флуориметрическое определение пефлоксацина в лекарственном препарате // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 4. С. 372-376. БО!: 10.18500/1816-9775-2016-16-4-372-376.
