CC BY
31
УДК 616.981.452:576.858.9
А.А.Филиппов1*, Дж.М.Эллиотт , А.Г.Бобров **, О.А.Кириллина **, В.Л.Мотин ,
П.С.Чейн2, Э.Гарсия2
f'
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА ЧУМНОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА Л-41 ЗС
1Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Россия;
2Калифорнийский университет, Ливермор, США; ^настоящее место работы ^Государственный научный центр прикладной микробиологии, Оболенск, Россия; ** настоящее место работы - Уни-• \ верситет штата Кентукки, Лексингтон, США
»
Нами полностью секвенирован геном и определена организация генов бактериофага JI-413C, наиболее специфичного по отношению к клеткам Yersinia pestis. Геном фага представлен линейной молекулой ДНК, которая имеет размер 30725 пар нуклеотидов (п.н.), содержит 52,1 [% ГЦ-пар и кодирует 39 открытых рамок считывания (ОРС). Установлено, что JI-413C является гомологом фага Р2 Escherichia coli, с которым он имеет 32 о!бщих гена из 39 выявленных и концевые прямые повторы ДНК; длиной 19 п.н. На основании сходства ДНК и предполагаемых полипептидных продуктов с известными колифагами определены функции 31 гена JI-413C. Высокая специфичность этого фага к возбудителю чумы, по всей видимости, связана с белком Н хвостового отростка, который имеет рекомбинантный характер: он демонстрирует сходство с аналогичными полипептидами колифагов Р2 и Тб.
Чумной диагностический бактериофаг JI-413C является вирулентным мутантом умеренного фага Л-413 [3], относится ко II серовару [5], пятой морфологической группе по классификации A.C. Тихо-ненко [4] и обнаруживает наиболее высокую специфичность по отношению к возбудителю чумы [3, 5], что было показано в широкомасштабных межла-бораторных испытаниях с использованием около 7000 штаммов У pestis и 1200 - Yersinia pseudotuberculosis пяти серовариантов [2]. В отличие "от фага Покровской (I серовар), который в зависимости от разведения лизировал 92,5-98,5 % культур возбудителя чумы и от 6,1 до 19 % штаммов псевдотуберкулезного микроба, Л-413С проявлял активность только по отношению к изолятам У. pestis (в 100 % случаев при правильной постановке пробы). Имеющиеся 1 в литературе данные о наличии штаммов возбудителя чумы, устойчивых к Л-413С, и о том, что он лизирует некоторые штаммы кишечной палочки и шигелл [10], не снижают диагностической ценности этого фага. Установлено, что отсутствие лизиса!культур Y. pestis фагом Л-413С в ряде случаев связано с нарушениями стандартной методики, а имеющиеся 10 комиссионно проверенных фагорезистентных штаммов чумного. микроба обладают рядом | атипичных признаков, характерных для У. pseudotuberculosis [2].
В ¡связи с большой практической значимостью Л-413С в качестве чумного диагностического фага значительный интерес представляет изучение его генома! и выявление гена(ов), определяющего выраженную специфичность при выборе хозяина. Ра-йее нами было проведено рестрикционное картирование ДНК Л-413С в сравнении с фагом Покровской [lj. Показано, что геном Л-413С имеет меньший размер и лишен видимого сходства с ДНК фага Покровской. Данные рестрикционного анализа использованы при проведении настоящего исследования, ¡целью которого явилось определение полной нуклеотидной последовательности генома Л-413С.
ДНК выделяли из препарата бактериофага производства Казахского научного центра карантинных и зоонозных болезней им. М.Айкимбаева, как описано ранее [1], гидродинамически фрагментировали на участки длиной 1-2 т.п.н. (тысячи пар нуклеотидов) и клонировали в векторах pUC18 и М13тр18. Рекомбинантной ДНК трансформировали штаммы E. coli DH5a и DH5ccF'IQ (Gibco-BRL Life Technologies, США) соответственно. Таким образом были получены десятикратная геномная библиотека Л-413С в векторе pUC18 и пятикратная - в М13тр18. ДНК для секвенирования выделяли с помощью наборов' фирмы QiaGen (США). Проведено по 288 цветных секвенирующих реакций с обеими библиотеками с помощью автоматического прибора Big Dye (РЕ Applied Biosystems, США). Для сборки последовательностей использовали компьютерную программу «Consed» [15]. ДНК бактериофага и предполагаемые полипептидные продукты анализировали методом BLAST (от англ. «basic local alignment search tool» - инструмент поиска по локальному выравниванию оснований) [13], через сеть Интернет, с использованием сервиса Национального центра биотехнологической информации (Национальные институты здоровья, США). В экспериментах по конкурентному связыванию Л-413С использовали фиксированное количество фаговых частиц (~ 3-107 или - 3-108), выделенных с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. Препарат фага инкубировали с избытком (- 108) клеток У. pseudotuberculosis или У. pestis в течение 15 мин при температуре 30 °С. Затем собирали надосадочную жидкость и титровали на клетках У. pestis с целью определения количества свободных оставшихся после связывания фаговых частиц.
В результате выполненной работы определена полная нуклеотидная последовательность генома бактериофага Л-413С. Оказалось, что геном пред-ставляет,, собой линейную молекулу ДНК длиной 30725 п.н., которая содержит 52,1 % пар гуанин-ци-
тозин и кодирует 39 открытых рамок считывания, классификации А.С.Тихоненко. Для данной группы
Выявлена высокая коллинеарная гомология по от- характерно наличие изометрической головки и спо-
ношению к ДНК фага Р2 E. coli (33593 п.н., не опуб- собного к сокращению хвоста. Это по современной
ликовано, номер в базе данных NCBI: NC_001895): международной классификации [12] соответствует
32 гена Л-413С из 39 обнаруженных (82 %) имеют семейству Myoviridae, морфотипу А1, к которому
ортологи в составе ДНК Р2, у которых идентич- относятся многие колифаги, в том числе PI, Р2 и Р4.
ность полипептидных продуктов составляет 87- Сюда же, наряду с JI-413C, следует отнести и все
100 % (табл. 1, рисунок). О близком эволюционном другие известные умеренные фаги возбудителя чу-
родстве фагов JI-413C и Р2 говорит также наличие в мы [6-9, 11]. Внутри морфотипа А1 выделено не-
их геномах одинаковых концевых прямых повторов сколько групп фагов [12]. Результаты наших иссле-
длиной 19 п.н., которые богаты ГЦ-парами (74%): дований позволяют включить Л-413С в группу Р2.
GGCGAGGC-GGGGAAAGCAC. Из табл. 1 видно, что гомология Л-41 ЗС к хоро-
Наши данные о высоком сходстве ДНК и деду- шо изученным кишечным фагам позволяет говорить
цированных аминокислотных последовательностей о функциях продуктов 31 из 39 секвенированных
белков фагов Л-413С и Р2 согласуются с результа- нами генов. 19 из них являются структурными бел-
тами работы, в которой изучалась ультраструктура ками или осуществляют сборку компонентов ви-
вирионов Л-41 ЗС [4] и было показано, что этот фаг риона, четыре - отвечают за лизис бактериальной
относится к пятой морфологической группе по клетки, пять - участвуют в репликации ДНК, ее ин-
Таблица 1
Список потенциальных генов бактериофага Л-413С
Ген Локализация 1 Продукт гена Мол. масса белка (кД) Г омология к Р2, % Функция
е 189-1223* gpQ 39,1 99 Предполагаемый портальный белок
р 1223-2995* gpP 66,6 99 ' Терминаза; ДНК-зависимая АТФ-аза
О 3169-4023 gpo 31,5 100 Предполагаемый опорный белок капсида
N 4082-5155 gpN 40,3 99 Предшественник мажорного белка капсида
М 5159-5902 gpM 27,5 97 Терминаза
L 6002-6511 gpL 19,0 98 Завершающий белок капсида
X 6511-6711 gpx 71,1 98 Важный фактор сборки хвоста
¥ 6718T6996 gpY 97,9 . 98 Холин; важен для лизиса бактериальной клетки
К 6999-7496 gpK 18,5 100 Эндолизин; важен для лизиса бактериальной клетки
lysA 7511-7936 LysA 15,6 92 Неглавный; влияет на время лизиса
lysB 7924-8349 LysB 15,8 95 Неглавный; влияет на время лизиса
R 8457-8924 gpR 17,4 98 Важный фактор завершения сборки хвоста
S 8917-9369 gps 17,2 98 Важный фактор завершения сборки хвоста
V 9436-0071 gpv 22,3 98 Белок сборки базальной пластины
W 10068-10415 gpW 12,6 100 Белок сборки базальной пластины
J 10420-11328 gpJ 32,8 99 Белок сборки базальной пластины
I 11321-11851 gpl 19,7 93 Белок сборки базальной пластины
H 11862-14603 gpH 98,9 35 Предполагаемый белок хвостового отростка 3
G 14607-15134 ' gpG 20,3 94 Предполагаемый белок сборки хвостового отростка
7 15286-16065* ГБ2 30,1 0 7
FI 16466-17656 gpFI 43,0 94 Важный белок хвостового чехла
FII 17669-18187 gpFII 19,1 95 Важный белок хвостовой трубки
E + E’ 18245-18499, 18499-186694 gpE+E’ 15,5 97 Важный хвостовой белок
T 18665-21112 gpT 86,6 98 Важный хвостовой белок; предположительно определяет длину хвоста
U 21127-21606 gpu 17,5 99 Важный хвостовой белок
D 21606-22769 gpD 42,8 97 Важный хвостовой белок
ogr 22769-23068 Ogr 11,5 98 Активатор поздних генов
int 23342-24322* Int 37,0 49 Интеграза
С 24392-24685 gpc 10,6 . 42 Репрессор иммуннности
COX 24807-25094 Cox 11,1 36 Репрессор промотора Рс; требуется для вырезания профага; тормозит интеграцию
orf78 25097-25264 ГБ2 6,5 100 7
В 25264-25764 gpB 19,9 98 Важный фактор репликации ДНК (синтез отстающей цепи)
orßO 25828-26049 ГБ2 8,3 98 7
orßl 26052-26351 ГБ2 11,1 87 7
orß2 26354-26575 Orf82 8,4 94 ?
orß3 26575-26850 ГБ2 10,2 97 ?
А 26840-29125 gpA 86,6 97 Важный фактор репликации ДНК (осуществляет сайтспецифичный однонитевой разрыв в стартовой точке)
orßl 29122-29574 ГБ2 17,3 52 ?
? 29530-30522* ГБ2 37,4 0 7
Примечания: 1 Звездочкой отмечены открытые рамки считывания по комплементарной цепи ДНК.2ГБ - гипотетический белок.3 Выделенная жирным шрифтом строка включает информацию о высокомолекулярном белке Н, предположительно обеспечивающем специфичность фага Л-41 ЗС по отношению к возбудителю чумы.4 Содержит искусственный сдвиг рамки, как у фага Р2.
Сравнение структуры геномов бактериофагов Л-413С (генетическая карта изображена вверху) и Р2 (внизу). Участки между картами, соответствующие зонам с высокой гомологией (по полипептидным продуктам составляющей 87-100 %), заштрихованы
теграции с геномом бактерии или эксцизии и три -представляют собой регуляторные факторы.
Наряду с высоким сходством геномов JI-413C и Р2, выявлены также важные различия между ними (рисунок, табл. 1). Область, ответственная за интеграцию и эксцизию профага, которая включает гены int, С и сох, обнаружила значительно более высокую гомологию по отношению к фагу Wcp, (семейство Myoviridae, морфотип А1) а не к Р2. Два неглавных гена фага Р2, tin и old, локализованные рядом с геном cosR, в составе генома JT-413C замещены фрагментом, который короче на 1,6 т.п.н. и кодирует единственную ОРС с неизвестной функцией. Третий неглавный ген Р2, fun(Z), в геноме JI-413C замещен другим предполагаемым геном, а четвертый, orßO, - делегирован.
Особый интерес представляют наши данные о строении белка Н хвостового отростка фага Л-41ЗС (табл. 1,; рисунок). Хотя его суммарная гомология по отношению к белку H Р2 составляет лишь 35 %, N-j и С-!концевые участки проявляют значительно более выраженное сходство (86 и 82 % на протяжении 205, и 72 аминокислотных остатков соответственно). В то же время центральная часть белка Н имеет значительно более высокую гомологию к полипептиду хвостового отростка фага Тб, достигая 56 % на! участке с координатами 230-698. Колифаг Тб относится к тому же семейству, Myoviridae, но к другому морфотипу, А2, характеризующемуся более вытянутой головкой [12]. Белок Н фага Р2 состоит лишь из 669 аминокислотных остатков, в то время как аналогичный продукт Л-413С включает 913 монрмеров. Мы можем говорить о том, что в процессе! филогенеза Л-413С его эволюционный предшественник, Р2-подобный фаг, приобрел центральную, часть гена Н в результате горизонтальной передачи от Тб-подобного фага. Такая уникальная рекомбинантная структура белка Н и то, что он
должен определять строение дистальнои части хвостового о|тростка [16], то есть поиск фагового рецептора на поверхности бактериальной клетки и прикрепление к нему, свидетельствует о важной роли этого продукта Л-413С в обеспечении высокой специфичности бактериофага к возбудителю чумы.
Кроме того, мы показали, что специфичность Л-413С определяется его специфическим связыванием с клетками Y. pestis, а не отсутствием способности к размножению на культурах Y. pseudotuber-сulosis. Для этого были проведены эксперименты по конкурентному связыванию Л-413С (табл. 2). Когда очищенный препарат бактериофага предварительно инкубировали с взвесью клеток возбудителя чумы, лишь 1-2:'% фаговых частиц оставались в надоса-дочной жидкости, что свидетельствует об эффективной адсорбции фага на специфическом рецепторе. В то же время после предынкубации фага с клеточной суспензией Y. pseudotuberculosis в супернатанте сохранялись от 70 до 100 % свободных ви-рионов, что, по-видимому, является следствием отсутствия !у данного возбудителя специфического рецептора для фага Л-413С.
Таблица 2
Эксперименты по конкурентному связыванию бактериофага JI-413C
Предварительная инкубация фага с Остающиеся свободные .фаговые частицы (СФЧ)
Эксперимент I Эксперимент 11 Эксперимент III
Ю’СФЧ 1108 СФЧ Ю’СФЧ 108СФЧ Ю’СФЧ Ю8СФЧ
Y. pseudotuberculosis 1,6-107 2,5-108 1,6-107 1,7-108 6,0-1 о7 1,8-108
(94) (100) (89) (81) (100) (69)
Y. pestis 1,8-Ю5 3,2-106 2,3-105 2,2-10б 7,8-105 5,2-106
(1) (1,3) (1,3) (1) (1,8) (2)
Без клеток 1,7 -107 2,4-108 1,8-Ю7 2,1-Ю8 4,3-107 2,6-10*
' ! (100) (100) (100) (100) (100) (100)
Примечание. В скобках - процент.
Таким образом, мы определили полную нуклеотидную последовательность и установили орга-
низацию генов чумного диагностического бактериофага JI-413C. Показано, что он относится к таксономической группе Р2, в отличие от всех остальных известных чумных фагов (Покровской, д'Эрел-ля, фА1122 и др.), которые входят в семейство Ро-doviridae, морфотип С1, группу Т7 [1, 12, 14]. Нами установлен рекомбинантный характер ряда генов, связанных с интеграцией, эксцизией генома и строением хвостового отростка Л-413С. Горизонтальная передача центральной области гена Я, определяющего структуру дистальной части хвостового отростка, от Тб-подобного фага является наиболее вероятной причиной уникальной специфичности Л-41 ЗС по отношению к возбудителю чумы.
Полная последовательность ДНК фага Л-413С депонирована в международных базах данных National Center of Biological Information (NCBI, США) и GenBank под номерами NC_004745 и gi:30065704 соответственно.
Работа выполнена при поддержке Департамента энергетики США (контракт W7405-Eng-48).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бобров А.Г., Кириллина O.A., Филиппов A.A. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1999. - Вып. 79. - С. 138-144. -2. Имамалиев О.Г., Серебрякова В.Г., Анисимова Т.И. и др. // Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. - М., 1986. - С. 102-106. - 3. Ларина B.C., Анисимов П.И., Адамов А.К. // Пробл. особо опасных инф. -1970. - Вып. 11. - С. 132-136. - 4. Ларина B.C., Коннов Н.П. // Генет. и биохим. особо опасных инф. - Саратов, 1980. - С. 21-24. - 5. Ларина B.C., Розанова Г.Н., Тимофеева Л.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1973. - Вып. 30. - С. 97-99.-6. Лешкович Н.Л., Арутюнов Ю.И., Токарев Ю.И., Кирдеев
В.К. // Журн. микробиол. - 1975. - № 10. - С. 31-34. - 7. Ново-
сельцев H.H., Арутюнов Ю.И., Токарев С.А. и др. // Там же. -197). - № 3. - С. 16-19. - 8. Новосельцев H.H., Марченков
B.И. // Там же. - 1990. - №' 11. - С. 9-12. - 9. Новосельцев H.H., Марченков В.И., Арутюнов Ю.И. // Там же. - 1994. - № б. -
C. 9-10. - 10. Пак Г.Ю., Сатыбалдиев H.A., Баканурская Т.Л. и др. // Там же. - 1985. - № 8. - С. 33-36. - 11. Плотников О.П., Коннов Н.П., Гольдфарб Л.М. // Вопр. генет., мол. биол. и микробиол. чумы и холеры. - Саратов, 1985. - С. 53-58. -12. Ackermann H.W. // Arch. Virol. - 2001. - Vol. 146. - P. 843-857. - 13. Altschul S.F., Gish W., Miller W. et al. // J. Mol. Biol. -1990. - Vol. 215. - P. 403-410. - 14. Garcia E., Elüott J.M., Ra-manculov E. et al. II J. Bacteriol. - 2003. - Vol. 185. - P. 5248-5262. - IS. Gordon D., Abajian C., Green P. // Genome Res. -1998. - Vol. 8. - P. 195-202. - 16. Haggärd-Ljungquist E., Halling
C., Calendar R.//J. Bacteriol.-1992.-Vol. 174.-P. 1462-1477.
A.A.Filippov, J.M.Elliott, A.G.Bobrov, O.A.Kirillina, V.L.Motin, P.S.Chain, E.Garsia, V.V.Kutyrev
Description of the Genomic Nucleotide Sequence of the Plague Diagnostic Bacteriophage, L-413C
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov, Russia; University of California, Livermore, USA
We have succeeded in sequencing the complete genome and in determining the genetic organization of L-413C bacteriophage genome, which is most specific for Yersinia pestis cells. The phage genome presented itself as a linear DNA molecule, 30725 n.p. in size, containing 52.1% G+C pairs and encoding 39 open reading frames (ORS). L-413C was shown to be a homolog of Escherichia coli P2 phage sharing 32 genes (of 39 ones determined) as well as terminal direct DNA repeats, 19- n.p. long. The functions of thirty-one L-413C genes were studied on the basis of the similarity of DNA and the presumed polypeptide products with known coliphages. The high specificity of this phage to the plague agent was likely to be associated with the caudal extention of H protein recombinant in its character: it manifests relatedness to analogous polypeptides of P2 and T6 coliphages.
riocTyniuia 15.07.05.
ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОДИАГНОСТИКА
УДК 616-07
Е.А.Березняк, Г.Л.Карбышев, А.Н.Терентьев, В.Н.Некляев, А.Н.Наркевич
КОНСТРУИРОВАНИЕ АНТИГЕННОГО ПОЛИМЕРНОГО ХЕЛИКОБАКТЕРНОГО ДИАГНОСТИКУМА
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
В работе обобщены результаты по подбору условий получения диагностикума хеликобактерного антигенного полимерного для реакции агломерации. Проведена оценка его специфичности и чувствительности. Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что сконструированный диагностикум является эффективным средством верифицирования хеликобактерной инфекции, которое можно использовать для проведения популяционно-эпидемиологических исследований.
Спиралевидной формы бактерия, получившая название Helicobacter pylori, впервые выделена из биоптата слизистой оболочки желудка больного с антральным гастритом в 1983 г. Б.Маршаллом и Д.Уорреном.
Доказана роль Я. pylori в патогенезе гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и двенадцати-
перстной кишки, лимфомы и рака желудка [1,4].
Примерно 60 % населения земного шара инфицировано Н. pylori [3]. В развивающихся странах инфекция встречается в более раннем возрасте и более часто, чем в развитых, уже к 20-летнему возрасту инфицированность населения Я. pylori может достигать 90 %. В развитых странах этот показатель
