CC BY
103
УДК 543.393:547.495.1:340:67
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРБОФУРАНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
© Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П., Коваленко Е.А., Михалькова П.В.
Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета, г. Курск
E-mail: [email protected]
Установлены оптимальные условия изолирования карбофурана из высушенных надземных и подземных частей лекарственных растений системой растворителей этилацетат - ацетон в отношении 1:1 по объёму. Показана достаточная эффективность очистки анализируемого соединения от эндогенных веществ биоматериала методом адсорбционной колоночной хроматографии с использованием силикагеля КСС № 3 80/120 мкм. Для идентификации и количественного определения карбофурана в извлечениях из тканей надземных и подземных частей шести лекарственных растений предложены методы ТСХ, электронной спектрофотометрии и нормальнофазовой ВЭЖХ. Предложенная методика является достаточно эффективной для контроля качества лекарственных растений путём нахождения остаточных количеств карбофурана.
Ключевые слова: карбофуран, изолирование, растительное лекарственное сырьё, ТСХ, спектрофотометрия, ВЭЖХ.
CARBOFURAN DETERMINATION IN BIOLOGICAL MATERIAL OF PHYTO ORIGIN Shormanov V.K., Galushkin S.G., Terskykh A.P., Kovalenko E.A., Mikhalkova P.V.
Pharmaceutical, Toxicological and Analytical Chemistry Department of Kursk State Medical University, Kursk The optimal conditions for the isolation of carbofuran from dried tubers and herbs by solvent system ethyl acetate - acetone in the ratio of 1:1 by volume have been established. The purification efficiency of the analyzed substance from endogenous substances of biological material by adsorption column chromatography with the use of silica gel KSS № 3 80/120 microns have been established. In order to identify and determine the quantity of carbofuran in tissue extracts of over- and underground parts of six medicinal plants the methods of TLC, electronic spectrophotometry and normal phase HPLC have been offered. The proposed method is quite effective for the quality control of medicinal plants by finding residues of carbofuran. Keywords: carbofuran, isolation, herbal raw materials, TLC, spectrophotometry, HPLC.
Карбофуран (О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбен-зофуранил-7)метилкарбамат) - биологически активное соединение антихолинэстеразного действия, применяющееся в сельскохозяйственной практике в качестве пестицида.
По физическим свойствам карбофуран - белое кристаллическое вещество с температурой плавления 153-154°С. Хорошо растворим в ацетоне, ацетонитриле, растворим в этаноле, в воде плохо растворим [1, 4, 6].
Карбофуран обладает значительной токсичностью для теплокровных организмов. LD50 при пероральном введении для крыс составляет 8-14 мг/кг, для собак- 19 мг/кг, для мышей- 44 мг/кг. Описаны случаи отравления карбофураном людей, в том числе с летальным исходом [1, 4].
Попадая в дикорастущие растения в зонах сельскохозяйственных работ, карбофуран может представлять угрозу для здоровья человека в случае использования этих растений в качестве лекарственного растительного сырья.
Широкое применение рассматриваемого вещества, его токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость
изучения этого соединения в химикотоксикологическом отношении [2, 3, 6].
Цель исследования - разработка методики определения карбофурана в растительном биологическом материале (надземной и подземной частях лекарственных растений) на основе изолирования рассматриваемого соединения системой растворителей этилацетат-ацетон в соотношении 1:1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования явился карбофуран (О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7) ме-тилкарбамат) фирмы «FMS Corporation» (США) с содержанием основного вещества не менее 99% (определено методом ГЖХ).
Изучены особенности изолирования карбофу-рана из высушенного растительного биологического материала (подземной и надземной частей лекарственных растений) системой растворителей этилацетат-ацетон в соотношении 1:1, предложенной ранее для изолирования данного соеди-
нения из биожидкостей [6]. В качестве модельных растительных объектов для поиска оптимальных условий изолирования карбофурана из сухого лекарственного растительного сырья рассмотрены корни одуванчика и трава пастушьей сумки.
Предварительно готовили модельные смеси карбофурана с высушенным мелкоизмельчённым (размер частиц 0,2-0,5 мм) растительным лекарственным сырьём (корнями или травой) из расчёта 25 мг вещества в 25 г биологической ткани. Отдельно готовили контрольные образцы растительного биологического материала, заведомо не содержащие рассматриваемое вещество. Искусственные смеси, а также контрольные образцы высушенных растительных тканей выдерживали в течение 90 минут при температуре 18-22оС. По истечении указанного времени осуществляли двукратное изолирование карбофурана из модельных смесей (навеска 5 г) при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания - 30 минут. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, точное количество объединённого извлечения наносили на пластины ВЭТСХ типа «Сорбфил» с люминесцентным индикатором и хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон в соотношении 6:4 в присутствии вещества-свидетеля. На хроматограммах в УФ-свете кар-бофуран обнаруживался в виде тёмно-лиловых пятен (Rf 0,76±0,03). Элюировали исследуемое вещество из сорбента этанолом (10 мл) при экспозиции в течение 15 минут. Оптическую плотность полученного элюата измеряли на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 278 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм на фоне элюата, полученного при исследовании контрольного образца биоматериала. Количество карбофурана, перешедшее в извлечение, рассчитывали, используя уравнение градуировочного графика, которое имело вид: А = 0,01496 • C -
0,00519 (А - оптическая плотность, С - содержание вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл).
Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого соединения из подземной (корни одуванчика) и надземной (трава пастушьей сумки) частей растений системой растворителей этилацетат-ацетон в соотношении 1:1 от кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и растительной биологической ткани. При этом брали на анализ по 5 г каждой искусственной смеси или контрольного образца растительного биологического материала. Каждую искусственную смесь параллельно с контрольным образцом настаивали с той или иной массой изолирующего агента (5-
20 г) четырёхкратно. Продолжительность отдельного настаивания составляла 30 минут. Определенное количество каждого извлечения хроматографировали на пластинах типа «Сорбфил» и проводили определение карбофурана после его обнаружения на хроматограммах методом УФ-спектрофотометрии в соответствии с вышеописанной методикой.
Изучена зависимость степени извлечения от продолжительности контакта изолирующей жидкости и лекарственного растительного сырья (корней или травы). При этом порции искусственных смесей или контрольных образцов ткани растений (по 5 г каждая) двукратно настаивали с порциями системы растворителей этилацетат-ацетон (1:1) по 10 г каждая в течение определенного времени (15, 30, 45, 60 или 75 минут). Отдельные извлечения, полученные при одинаковой продолжительности настаивания, объединяли. В каждом случае часть объединённого извлечения наносили на линию старта пластины типа «Сорбфил», хроматографировали, обнаруживали карбофуран и определяли его по приведённой выше схеме.
Для очистки карбофурана, извлечённого из растительного биологического материала, изучена возможность применения метода нормальнофазовой колоночной хроматографии (колонка размерами 490^11 мм, заполненная 10 г сорбента L 100/160 мкм).
Для подтверждающей идентификации рассмотрена возможность применения метода электронной спектрофотометриии. Исследовались особенности поглощения карбофураном УФ-излучения в различных растворяющих средах (прибор СФ-56, толщина рабочего слоя кюветы 10 мм).
В качестве дополнительного метода подтверждающей идентификации и количественного определения анализируемого соединения в извлечениях из растительных объектов рассмотрена высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с использованием гидроксилированного сорбента «Силасорб 600» (прибор «Милихром», колонка размерами 64*2 мм).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты изучения зависимости полноты извлечения рассматриваемого вещества из высушенной подземной части растения (корней одуванчика) от ряда факторов показали, что оптимальными условиями изолирования можно считать двукратное (каждый раз по 30 минут) настаивание биообъекта с изолирующим агентом при массовом соотношении «биологический объект-
модельная смесь» 2:1). Изменение содержания анализируемого вещества в модельных смесях с корнями в интервале 0,01-0,2% не приводит к значительному изменению степени извлечения (86,92-88,06%) [5].
Исследования зависимости полноты извлечения рассматриваемого вещества от массового соотношения изолирующего агента из высушенной надземной части растения (травы пастушьей сумки), а также от кратности изолирования (n=5; Р=0,95) показывают, что для достаточно полного извлечения рассматриваемого вещества из высушенной травы необходимо по крайней мере двукратное настаивание растительного биологического материала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза по массе.
Как свидетельствуют полученные данные, оптимальное время контакта растительного биообъекта (травы пастушьей сумки) с системой растворителей этилацетат-ацетон (1:1) составляет 30 минут.
Результаты изучения зависимости степени извлечения карбофурана из высушенной надземной части растения от содержания рассматриваемого вещества в растительном биологическом материале представлены в табл. 1.
Как свидетельствуют полученные данные, увеличение содержания карбофурана в модельных смесях в интервале концентраций от 0,50 до 10,00 мг при постоянной массе навески высушенных тканей корня одуванчика (5,00 г) сопровождается лишь незначительным изменением значений степени извлечения, не превышающим 1,2%. Это позволяет предположить, что взаимодействие молекул карбофурана со структурными элементами высушенных мелкоизмельчённых растительных тканей не приводит к образованию достаточно прочных связей.
При исследовании возможности очистки карбофурана, выделенного из биологического материала, на колонке с силикагелем КСС № 3 80/120 мкм, установлено, что при использовании по-
движной фазы гексан-ацетон (8:2) анализируемое вещество обнаруживается во фракциях 7-13 (1326 мл).
В контрольных опытах с растительными биологическими объектами, не содержащими кар-бофуран, установлено, что фоновое поглощение части элюата, соответствующего фракциям, в которых может содержаться анализируемое вещество, незначительно (< 0,04 при 278 нм - аналитической длине волны для определения методами спектрофотометрии и BЭЖX). Это характеризует предлагаемый вариант очистки как достаточно эффективный.
Как свидетельствуют данные табл. 2, на электронных спектрах карбофурана в различных растворяющих средах присутствуют две выраженные полосы поглощения: первая (коротковолновая) - с максимумами в области длин волн 208217 нм и вторая (длинноволновая)- с максимумами в области длин волн 278-279 нм. Значения удельного коэффициента поглощения, рассчитанные для максимумов первой полосы, составляют 167-309, второй -74-181, значения молярного коэффициента поглощения - 7286-8697 для максимумов первой полосы и 2480-3088 для максимумов второй полосы.
Этанол являлся растворяющей средой при идентификации и количественном определении рассматриваемого вещества методом УФ-спектрофотометрии. Оценку количественного содержания проводили по величине оптической плотности в области 278 нм, используя уравнение градуировочного графика.
Установлено, что оптимальные условия определения карбофурана методом BЭЖX достигаются при использовании элюента гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1), подаваемого со скоростью 100 мкл/мин при температуре колонки 20оС. Аналитическая длина волны 278 нм, скорость движения диаграммной ленты - 720 мм/час, масштаб регистрации- 0,8 ед.о.п., время регистрации сигнала 0,6 сек.
Как свидетельствуют полученные данные, в предлагаемых условиях время удерживания кар-бофурана составило 3,46 мин, коэффициент ёмко-
Таблица 1
Влияние количества внесённого в биоматериал (трава пастушьей сумки) карбофурана на степень извлечения вещества смесью этилацетат-ацетон (1:1) в оптимальных условиях
Внесено карбофурана Найдено, %
мг в 25 г биоматериала X S S х Ах
50,0 67,02 0,92 0,38 0,97
25,0 66,89 1,31 0,53 1,37
12,5 66,45 1,74 0,71 1,83
5,0 66,32 2,19 0,89 2,30
2,5 66,10 2,41 0,98 2,53
Таблица 2
Некоторые основные оптические характеристики карбофурана в среде различных растворителей
Растворитель Положения точек максимумов X, нм V 1 / 1 см 8
ДМФА 278 124 2907
Этанол 208 309 8697
278 110 3088
Гексан 217 217 7286
279 74 2480
Метиленхлорид 278 181 3015
сти - 1,21, число теоретических тарелок - 1731, фактор асимметрии пика - 0,94%. Открываемый минимум - 0,02 мкг в хроматографируемой пробе.
Количественное определение карбофурана методом ВЭЖХ проводили, используя уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имело вид: S= 3,10458 • С- 0,01061 ^ - площадь пика, С - концентрация вещества в хроматографируемой пробе, мкг). Интервал линейности - 0,02-1,60 мкг в хроматографируемой пробе.
По результатам предварительных исследований разработана схема химико-
токсикологического исследования, состоящая в следующем.
Изолирование. 5 г искусственной смеси или такое же количество контрольного образца растительного биологического материала настаивали дважды (по 30 минут) с порциями системы растворителей этилацетат-ацетон в соотношении 1:1 по 10 г каждая. Отдельные извлечения объединяли.
Объединённое извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 2 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1 -1,5 см, слой сульфата натрия промывали 10 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединённого фильтрата испаряли при комнатной температуре. Остаток растворяли в 2-3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС № 3 80/120 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в хроматографическую колонку размерами 490^11 мм, заполненная 10 г сорбента КСС №3 80/120 мкм.
Хроматографировали, используя элюент гек-сан-ацетон (8:2). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 7 по 13 включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20-22°С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили соответственно 0,1 -2,0 мл и 1,0-5,0 мл ацетонового
раствора и испаряли растворитель.
Определение методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ЦУ-254. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-ацетон в соотношении 6:4. Исследуемое вещество идентифицировали по совпадению его значения с таковым вещества-свидетеля.
Определение методом электронной спек-трофотометрии. После предварительного хроматографирования методом ТСХ участок хроматограммы с пятном карбофурана вырезали и элюировали вещество из сорбента 10 мл этанола в течение 15 минут. Светопоглощение элюата исследовали в интервале длин волн 190-400 нм. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат разбавляли этанолом. Карбофуран идентифицировали по положению точек максимумов, совпадающих с положением таковых в спектре вещества-стандарта.
Определение методом ВЭЖХ. Остаток в чашке № 2 растворяли в 5 мл диоксана, раствор переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляли 1 мл пропанола-2 и доводили содержимое колбы до метки гексаном. 2-16 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали на приборе «Милихром» с УФ-детектором в колонке размерами 64^2 мм, заполненной гидроксилированным сорбентом «Силасорб-600» по вышеописанной схеме. Анализируемое соединение идентифицировали по времени удерживания. Количественное содержание анализируемого соединения рассчитывали, исходя из площади хроматографического пика, с использованием уравнения градуировочного графика и пересчитывали на навеску, предварительно добавленную в искусственную смесь.
Спектры карбофурана, извлечённого из надземных и подземных частей лекарственных растений, представлены на рис. 1. Как видно
Рис. 1. Спектры поглощения карбофурана при его изолировании из различного растительного лекарственного сырья системой растворителей этилацетат - ацетон в соотношении 1:1.
Примечание: 1 - трава хвоща; 2 - цветки календулы; 3 - корни одуванчика, 4 - корневище с корнями валерианы, 5 - листья подорожника, 6 - трава пастушьей сумки.
Рис. 2. BЭЖX-хроматограммы полученных извлечений карбофурана из растительного биологического материала.
Примечание: 1 - трава хвоща; 2 - цветки календулы; 3 - корни одуванчика, 4 - корневище с корнями валерианы, 5 - листья подорожника, б - трава пастушьей сумки.
Таблица 3
Результаты изолирования различных концентраций карбофурана из мелкоизмельчённого растительного биологического материала
Внесено карбофурана мг в 25 г биоматериала Найдено методом спектро-фотометрии, % Внесено карбофурана мг в 25 г биоматериала Найдено методом ВЭЖХ, %
S Sx Дх X S Sx Дх
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Корни одуванчика
50,0 88,06 1,93 0,86 2,40 50,0 88,14 1,99 0,81 2,09
25,0 87,75 2,01 0,90 2,50 25,0 87,92 2,06 0,84 2,16
12,5 87,51 2,20 0,98 2,73 12,5 87,67 2,18 0,89 2,29
5,0 87,13 2,41 1,08 2,99 5,0 87,25 2,35 0,96 2,47
2,5 86,92 2,59 1,16 3,22 2,5 87,06 2,51 1,02 2,63
Трава пастушьей сумки
50,0 66,48 0,66 0,35 0,98 50,0 66,52 0,74 0,30 0,78
25,0 66,28 0,96 0,43 1,18 25,0 66,37 0,88 0,36 0,92
12,5 65,88 1,56 0,70 1,94 12,5 66,04 1,38 0,56 1,45
5,0 65,52 2,02 0,90 2,51 5,0 65,72 1,84 0,75 1,93
2,5 65,27 2,13 0,95 2,65 2,5 65,40 2,01 0,82 2,11
Цветки календулы
50,0 88,20 1,89 0,85 2,35 50,0 88,33 1,82 0,74 1,91
25,0 88,02 2,07 0,93 2,58 25,0 88,18 2,04 0,83 2,14
12,5 87,99 2,31 1,03 2,87 12,5 87,97 2,25 0,92 2,36
5,0 87,58 2,70 1,21 3,35 5,0 87,65 2,59 1,06 2,72
2,5 87,37 2,90 1,30 3,61 2,5 87,45 2,81 1,15 2,95
Трава хвоща
50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0
12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5
5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Листья подорожника
50,0 72,31 1,22 0,55 1,52 50,0 72,39 1,26 0,51 1,32
25,0 72,11 1,49 0,67 1,85 25,0 72,16 1,51 0,62 1,58
12,5 71,93 1,87 0,84 2,23 12,5 72,01 1,77 0,72 1,86
5,0 71,4 2,11 0,94 2,63 5,0 71,64 1,95 0,80 2,05
2,5 71,06 2,56 1,15 3,19 2,5 71,11 2,33 0,95 2,44
Корневище с корнями валерианы
50,0 75,84 1,02 0,46 1,27 50,0 75,98 0,92 0,38 0,97
25,0 75,63 1,20 0,54 1,49 25,0 75,75 1,09 0,44 1,14
12,5 75,45 1,54 0,69 1,92 12,5 75,59 1,40 0,57 1,47
5,0 75,10 1,91 0,85 2,38 5,0 75,23 1,79 0,73 1,88
2,5 74,81 2,21 0,99 2,75 2,5 75,06 2,03 0,83 2,13
из рисунка, положения максимумов и формы спектральных кривых в целом соответствуют таковым вещества-стандарта.
На хроматограммах анализируемого соединения, выделенного из рассматриваемых биологических объектов, полученных при использовании метода ВЭЖХ (рис. 2), по сравнению с хроматограммой стандарта карбофурана не удаётся вы явить дополнительные пики и заметное смещение
базовой линии.
Результаты количественного определения карбофурана в 6 видах лекарственного растительного сырья разработанной методикой представлены в табл. 3.
Как свидетельствуют полученные данные, предлагаемая методика позволяет определить до 88,57% карбофурана в надземных и до 88,06% в подземных органах растений с достаточной
для биологических исследований воспроизводимостью и правильностью. При уменьшении содержания анализируемого вещества в модельных смесях с 0,2 до 0,01% полуширина доверительного интервала возрастает с 1,53 до 2,60 (для модельных смесей с высушенным растительным лекарственным сырьем надземных органов растений) и с 2,09 до 2,63 (для модельных смесей с высушенным растительным лекарственным сырьем подземных органов растений) (п = 6; Р = 0,95).
Использование смеси этилацетат - ацетон в отношении 1:1 в качестве изолирующего агента и предложенные условия изолирования и очистки позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения анализируемого соединения из различных биологических объектов растительного происхождения. Открываемый минимум составляет 0,05-0,2 мг карбофурана в 100 г биологического материала. Разработанная методика хорошо воспроизводима и отличается достаточной простотой выполнения.
Она может быть использована для контроля содержания остаточных количеств рассматриваемого соединения в лекарственном растительном сырье.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Показана возможность и определены оптимальные условия изолирования карбофурана из растительного биологического материала смесью растворителей этилацетат-ацетон (1:1).
2. Для идентификации и количественного определения исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, элек-
тронной спектрофотометрии и нормальнофазовой ВЭЖХ.
3. Показана возможность применения разработанной методики для исследования различных видов лекарственного растительного сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клисенко М.А., Александрова Л.Г. Определение остаточных количеств пестицидов. - Киев: Здоровья, 1983. - 284 с.
2. Мансурова Р.Г., Кубасова Н.В., Попкова В.В., Юсупова Ф.Г. Изолирование карбофурана из биологического материала, его идентификация и количественное определение // Актуальные вопросы судебной медицины и права. - Казань, 2010. -Вып. 1. - 282 с.
3. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. -Т. 1 / Под ред. М.А. Клисенко. - М.: Колос, 1992. -566 с.
4. Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Коваленко Е.А. Изолирование карбофурана из растительного биологического материала // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - № 22. - Вып. 20/1. - С. 130-133.
5. Шорманов В.К., Иванов В.П., Королев В.А. и др. Судебно-химическое определение фурадана // Судебно-медицинская экспертиза. - 2005. - Т. 48, № 3. - С. 27-31.
6. Шорманов В.К., Коваленко Е.А., Дурицын Е.П. Определение фурадана в биологических жидкостях // Судебно-медицинская экспертиза. - 2005. -Т. 48, № 5. - С. 36-39.
