Научная статья на тему 'Определение хлорпромазина и левомепромазина в крови газовой хроматографией смассселективным детектором'

Определение хлорпромазина и левомепромазина в крови газовой хроматографией смассселективным детектором Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
685
169
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ХЛОРПРОМАЗИН / ЛЕВОМЕПРОМАЗИН / ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ / МАСС СПЕКТРОМЕТРИЯ / CHLORPROMAZINE / LEVOMEPROMAZINE / A GAS CHROMATOGRAPHY / MASS SPECTROMETRY

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Шумская Н. В., Мелентьев А. Б., Тюрин А. Ю.

Разработан метод одновременного определения хлорпромазина и левомепромазина в крови с использованием газовой хроматографии с масс селективным детектированием, предназначенный для токсикологических анализов. Пробоподготовка включает введение внутреннего стандарта (трифтазин), жидкость-жидкостную экстракцию и газохроматографический анализ образцов в режиме селективного ионного мониторинга. Предел обнаружения для обоих аналитов равен 0,1 мкг/мл. Диапазон количественного определения 0,2 до 3,0 мкг/мл. Максимальная внутрисерийная относительная погрешность не превышает 11%. Максимальные межсерийные относительные погрешности равны 7,62% для концентрации 0,2 мкг/мл и 4,83% для концентрации 2 мкг/мл. Методика опробована на экспертном материале при производстве судебно-химических исследований и в клинических токсикологических анализах.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

DETERMINATION OF CHLORPROMAZINE AND LEVOMEPROMAZINE IN BLOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY

The method of simultaneous determination of chlorpromazine and levomepromazine in blood with use of a gas chromatography this mass selective detecting, intended for toxicological analyses is developed. Preparation of biological fluid includes introduction of the internal standard (trifluoperazine), liquid liquid extraction and GC analysis of samples in a mode of selective ionic monitoring. The LOD is equal 0,1 mkg/ ml, LOQ is 0,2 up to 3 mkg/ ml. The maximal intra-day relative error does not exceed 11%. The maximal inter-day relative errors are equal 7,62 %for concentration of 0,2 mkg/ ml and 4,83 %for concentration of 2 mkg/ ml. The technique is tested on an expert material by manufacture forensic chemical researches and in clinical toxicological analyses.

Текст научной работы на тему «Определение хлорпромазина и левомепромазина в крови газовой хроматографией смассселективным детектором»

элюента систему растворителей систему растворителей 1 н. раствор серной кислоты — ацетонитрил в соотношении 8:2 в присутствии вещества-свидетеля. Участок хроматограммы с анализируемым веществом вырезали и элюировали вещество 5 мл смеси растворителей 1 н. раствор серной кислоты — ацетонитрил (8:2). Оптическую плотность элюата после его предварительного фильтрования через капроновый фильтр, измеряли на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при аналитической длине волны 310 нм. В качестве фона использовали элюат, полученный в контрольном опыте. Количественное содержание рассматриваемого вещества рассчитывали с помощью уравнения градуировочного графика.

Результаты изолирования диквата из трупной печени различными растворителями представлены в табл. 1. Сравнение результатов изолирования показало, что наибольшая степень извлечения рассматриваемого вещества достигается при использовании в качестве изолирующего агента системы растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2). Нагревание смеси биологического объекта с данным изолирующим агентом до кипения и далее при 100оС в течение 10 минут позволяли повысить степень извлечения анализируемого вещества.

Установлено, что максимальная степень извлечения диквата из трупной печени достигается при продолжительности настаивания 45 минут.

Исследование зависимости степени извлечения этого диквата от кратности настаивания показало, что для достаточно полного извлечения рассматриваемого вещества из трупной печени необходимо двукратное настаивание биологического материала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом

случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза по массе (табл. 2). Как свидетельствуют данные эксперимента, представленные в табл. 3, увеличение содержания диквата в модельных смесей в достаточно широком интервале концентраций (0,5-15,0 мг) при постоянной массе навески ткани печени (25,0 г) сопровождается лишь незначительным изменением значений степени извлечения, не превышающим 2%.

Использование в качестве изолирующего агента системы растворителей этанол — 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и предложенные условия изолирования позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения анализируемого вещества из ткани печени трупов. Открываемый минимум составляет 2 мг диквата в 100 г биологического материала. Предложенная методика хорошо воспроизводима, отличается простотой выполнения, не требует применения сложной аппаратуры и значительных затрат времени на воспроизведение. Она может быть использована в практике при проведении экспертизы в случае отравления дикватом.

В результате проведенного исследования мы пришли к следующим выводам:

1. Изучена возможность использования смеси растворителей этанол — 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) при химико-токсикологическом исследовании диквата.

2. Определены оптимальные условия изолирования диквата смесью растворителей этанол — 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2).

3. Дана количественная оценка изолирования смесью растворителей этанол — 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) рассматриваемого вещества из модельных смесей с тканью печени.

Литература:

1. Бихари Ф. Химические средства борьбы с сорняками / Перевод с венгерского Куренного И.Ф. — М.: Агропромиздат. — 1986. — 413 с.

2. Мельников Н.Н. Пестициды. — М.: Химия. — 1987. — 712 с.

3. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Справочник в двух томах / Под

ред. М.А. Клисенко.- М.: Колос. — 1992. — 566 с.

4. Паракват и дикват. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 39 // Совместное издание программы ООН по окружаю-

щей среде, Международной организации труда и Всемирной организации здравоохранения. — Женева. — ВОЗ. — 1989. — 152 с.

5. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешённых к применению в РФ. — М.: «Изд-во АГРОРУС», 2000. — 220 с.

6. Справочник по пестицидам / Н. Н. Мельников, К. В. Новожилов, С. Р Белан, Т. Н. Пылова. — М.: Химия. — 1985. — 352 с.

© Н.В. Шумская, А.Б. Мелентьев, А.Ю. Тюрин, 2006 УДК 340.6 : 616

Н.В. Шумская, А.Б. Мелентьев, А.Ю. Тюрин ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРПРОМАЗИНА И ЛЕВОМЕПРОМАЗИНА В КРОВИ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С МАСС СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТОРОМ

Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы (нач. — проф. П.И. Новиков) Челябинская областная клиническая больница (гл. врач — А.Л. Журавлев)

Разработан метод одновременного определенияхлорпромазина илевомепромазина в крови с использованием газовой хроматографии с масс селективным детектированием, предназначенный для токсикологических анализов. Пробоподготовка включает введение внутреннего стандарта (трифтазин), жидкость-жидкостную экстракцию и газохроматографический анализ образцов в режиме селективного ионного мониторинга. Предел обнаружения для обоих аналитов равен 0,1 мкг/мл. Диапазон количественного определения 0,2 до 3,0 мкг/мл. Максимальная внутрисерийная относительная погрешность не превышает 11%. Максимальные межсерийные относительные погрешности равны 7,62% для концентрации 0,2 мкг/мл и 4,83 % для концентрации 2 мкг/мл. Методика опробована на экспертном материале при производстве судебно-химических исследований и в клинических токсикологических анализах.

Ключевые слова: хлорпромазин, левомепромазин, газовая хроматография, масс спектрометрия.

DETERMINATION OF CHLORPROMAZINE AND LEVOMEPROMAZINE IN BLOOD BY GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY

N.V. Shumskaya, A.B. Melentyev, A.U. Turin The method of simultaneous determination of chlorpromazine and levomepromazine in blood with use of a gas chromatography this mass selective detecting, intended for toxicological analyses is developed. Preparation of biological fluid includes introduction of the internal standard (trifluoperazine), liquid - liquid extraction and GC analysis of samples in a mode of selective ionic monitoring. The LOD is equal 0,1 mkg/ ml, LOQ is 0,2 up to 3 mkg/ ml. The maximal intra-day relative error does not exceed 11 %. The maximal inter-day relative errors are equal 7,62 % for concentration of 0,2 mkg / ml and 4,83 % for concentration of 2 mkg / ml. The technique is tested on an expert material by manufacture forensic chemical researches and in clinical toxicological analyses.

Key words: chlorpromazine, levomepromazine, a gas chromatography, mass spectrometry.

Хлорпромазина гидрохлорид — аминазин (рис. 1а) наиболее распространенный нейролептический препарат из группы производных фенотиазина, вызывающий сильный седативный эффект, усиливающий действие снотворных, наркотических препаратов, анальгетиков и местноанестезирующих веществ [1].

Левомепромазина гидрохлорид — (тизерцин) — производное фенотиазина (рис. 1б), используемое в медицине в качестве нейролептического средства с ярко выраженным седативным эффектом. Препарат обладает противо-гистаминой активностью, вызывает сильную гипотензию, по анальгетической активности сравним с морфином [1].

Оба препарата применяются при лечении шизофрении и других психических заболеваний. Так как они широко используются в психиатрии, нередко в больших дозах, мы наблюдали ряд случаев тяжелых осложнений в виде развития нейролептического синдрома с кататонией, гипотермией, артериальной гипотензией и глубоким сопором. В таких случаях количественное определение концентрации нейролептиков и ее динамики ложится в основу лечебной тактики токсикологов. Эти препараты показаны, в основном, людям с неустойчивой психикой, поэтому нередко наблюдаются и случаи летальных отравлений, как при суициде, так и при случайной передозировке. В табл. 1 приведены терапевтические, токсические и летальные концентрации хлорпрома-зина и левомепромазина по литературным данным [7].

Таблица 1.

Терапевтические, токсические и летальные концентрации хлорпромазина и левомепромазина в крови

Вещество Концентрация, мкг/мл

Терапевтическая Токсическая Летальная

Хлорпромазин 0,05-0,5 0,5-2,0 3

Левомепромазин 0,03-0,15 0,5 н.д.

В большинстве опубликованных работ количественное определение нейролептиков фенотиазинового ряда проводятся методами спектрофотометрии в видимой области [2, 4] или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [3, 6]. Однако спектрофотометрические методы обладают низкой специфичностью, так при анализе производных фенотиазина этим методом в измеряемое значение кроме нативного соединения попадает и ряд его метаболитов (сульфоксидов). Анализ же методом ВЭЖХ не всегда доступен, кроме того, стоимость анализов этим методом

Рис.1. Структуры анализируемых соединений и внутреннего стандарта. Хлорпромазин (а), левомепромазин (б), трифлюоперазин (в).

значительно выше стоимости анализа методом газовой хроматографии (ГХ). Одиночные работы, например [5], посвященные анализу производных фенотиазина в биологических жидкостях методом газовой хроматографии с масс селективным детектором рассчитаны на терапевтический мониторинг, а не на токсикологические анализы. В большинстве разработанных ранее методов количественного определения производных фенотиазинового ряда методами ГХ и ВЭЖХ возникали трудности с воспроизводимостью и точностью получаемых результатов, из-за легкости окисления серы в фенотиазиновом кольце.

Цель данной работы: разработка методики количественного определения хлорпромазина и левомепромазина в крови (плазме), предназначенной для использования в токсикологических и судебно-химических анализах, используя метод газовой хроматографии с масс селективным детектированием.

Оборудование. Газовый хроматограф с масс-селектив-ным детектором «Shimadzu» PQ-5050A. Набор пипеток-дозаторов («Biohit», Финляндия), встряхиватель АВУ-6.

В качестве стандартов использовали 2,5% раствор аминазина для инъекций (ОАО «Львовский химикофармацевтический завод») и 2,5% раствор тизерцина для инъекций (EGIS, США), а также 0,2% раствор трифтазина (трифлюоперазина гидрохлорида) (рис. 1в), применяемого в методике в качестве внутреннего стандарта (ОАО «Московский эндокринный завод»). Другие растворители и реактивы использовались квалификации хч или чда.

Стандартные и калибровочные растворы. Для приготовления стандартных растворов хлопромазина и лево-мепромазина с концентрацией 1 мг/мл на основание, 890 мкл соответствующих 2,5% растворов аминазина или тизерцина смешивалось с 19,1 мл этанола. Рабочие растворы для калибраторов готовились из стандартных растворов анализируемых соединений. Раствор с концентрацией хлорпромазина и левомепромазина по 0,1 г/л готовили добавлением в виалу по 100 мкл стандартных растворов хлопромазина и левомепро-мазина с концентрацией по 1 мг/мл и 800 мкл этанола. Раствор с концентрацией хлорпромазина и левомепромазина по 0,01 г/л готовили добавлением в виалу по 100 мкл раствора с концентрацией анализируемых соединений по 0,1 мг/мл и 800 мкл этанола. Калибраторы для ГХ анализа готовили на «холостой» крови, предварительно проверенной на наличие наркотических и психотропных веществ. Для приготовления калибровочных растворов использовали схему, приведенную в табл. 2. К 1 мл «холостой» крови добавлялось соответствующее количество одного из рабочих растворов (табл. 2). После этого калибровочные пробы проходили все процедуры пробоподготовки и анализа. По результатам анализов калибраторов строилась калибровочная кривая.

Раствор внутреннего стандарта. Раствор внутреннего стандарта трифлюороперазина гидрохлорида (трифтазина) с концентрацией 0,04 мг/мл готовился добавлением 118 мкл

коммерческого препарата трифтазина с концентрацией 0,2% в виалу, содержащую 4,85 мл этанола с добавлением 32 мкл 1н раствора соляной кислоты, служащей стабилизатором.

Подготовка проб крови. К 1 мл крови или плазмы во флаконе добавлялось 50 мкл раствора внутреннего стандарта (трифтазин 0,04 мг/мл), 100 мкл 1н раствора едкого калия и 5 мл дихлорметана в качестве экстрагента. Пробы помещались во встряхиватель на 10 мин., после разделения органического и водного слоев отбиралось 4 мл органического экстракта, который пропускался через слой безводного сульфата натрия в 5 мл инсулиновый флакон. Растворитель испарялся в потоке азота при температуре не выше 400оС досуха. Перед анализом к сухому остатку добавлялось 80 мкл изопропанола и 1 мкл вводился в инжектор газового хроматографа.

ГХ анализ с масс селективным детектированием. Газовый хроматограф с масс-селективным детектором «SЫmadzu» PQ-5050A, капиллярная колонка DB-5MS, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм, начальная температура колонки 80°С, выдержка 1,0 мин, увеличение температуры со скоростью 40 град/мин до 200°С, дальнейшее увеличение температуры со скоростью 12,5 град/мин до 300°С с

Таблица 2.

Схема приготовления калибраторов

№ Название пробы Калибровочная концентрация в крови мкг/мл Концентрация рабочего раствора, г/л Объем рабочего раствора на 1 мл крови, мкл

1 Точка 6 3 0,1 30

2 Точка 5 2 0,1 20

3 Точка 4 0,5 0,01 50

4 Точка 3 0,2 0,01 20

5 Точка 2 0,1 0,01 10

6 Точка 1 0 — 0

выдержкой при конечной температуре 5 минут. Имитация режим постоянного потока 1,5 мл/мин. Температура инжектора 250°С, устройства сопряжения с детектором 280°С. Ввод пробы без разделения потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1:10 (Split/Splitless) Режим SIM по ионам 318,272,228 (хлорпромазин), 328, 228, 272 (левомепромазин), 407,306,248 (трифлюороперазин). Напряжение на электронном умножителе на 400 вольт выше «Autotune». Первыми в списке приведены ионы, по пикам которых проводили количественное определение, остальные ионы использовали для определения качества идентификации анализируемых соединений. Регистрация ионного тока начиналась через 10,5 мин и заканчивалась через 12 минут после ввода пробы.

Определенные в ходе построения калибровочной кривой пределы обнаружения и интервал линейности, наряду с внутрисерийной и межсерийной воспроизводимостью результатов служат основными критериями, по которым проводится оценка применимости данного варианта методики для химико-токсикологических анализов наркотических и психотропных веществ.

Таблица 3.

Правильность и воспроизводимость методики определения хлорпромазина и левомепромазина в крови (Р = 0,95; n = 6)

Серия определе- ний Вещество Найдено,* мкг/мл Sr Най- дено,** мкг/мл Sr

1 Хлорпромазин 0,190±0,015 0,099 1,88±0,07 0,050

Левомепромазин 0,190±0,015 0,101 1,97±0,14 0,089

2 Хлорпромазин 0,188±0,012 0,079 1,87±0,07 0,049

Левомепромазин 0,190±0,012 0,079 1,95±0,10 0,064

3 Хлорпромазин 0,185±0,010 0,070 1,96±0,07 0,044

Левомепромазин 0,194±0,12 0,059 1,99±0,07 0,046

Где: Р — доверительная вероятность; п — количество опытов в серии; Бг — относительное стандартное отклонение; * — нижний контроль 0,2 мкг/мл; ** — верхний контроль 2,0 мкг/мл.

Разработанная методика охватывает область от терапевтических до летальных концентраций анализируемых веществ в крови. Предел обнаружения для хлорпромазина и левомепромазина — 0,1 мкг/мл. Предел количественного определения равен 0,2 мкг/мл. Калибровочные кривые линейны в диапазоне от 0,2 до 3 мкг/мл они, описываются уравнениями: У1 = 0,754*Х1 + 0,023 (г = 0,9998) для хлорпромазина,

У2 = 1,024*Х2 — 0,035 (г = 0,9972) для левомепромазина.

Где У1 и У2 — концентрации хлорпромазина и лево-мепромазина в мкг/мл, а Х1 и Х2 — отношение площадей пиков целевых ионов анализируемых веществ и внутреннего стандарта, г — коэффициент корреляции.

Сухие экстракты после пробоподготовки хранению не подлежат, вследствие окисления анализируемых соединений на воздухе (особенно на свету). Во избежание получения некорректных результатов, пробы экстрактов в изопропаноле должны быть проанализированы в течение суток. Результаты проверки методики на воспроизводимость и точность представлены в табл. 3.

Максимальная внутрисерийная относительная погрешность не превышает 11%. Максимальные межсерий-ные относительные погрешности равны 7,62% для концентрации 0,2 мкг/мл и 4,83% для концентрации 2 мкг/мл. Следует отметить, что приемлемую воспроизводимость метрологических характеристик газохроматографического определения хлорпромазина и левомепромазина нам удалось обеспечить только при использовании азота в качестве газа для удаления органического растворителя после экстракции. Использование в этом качестве воздуха приводит к окислению анализируемых соединений и ухудшению воспроизводимости анализа.

Предлагаемая методика была опробована в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы и в Челябинском областном токсикологическом центре для подтверждения и количественного определения хлорпромазина и левомепромазина в крови и плазме как при направленном химико-токсикологическом анализе, так и при обнаружении этих веществ при скрининге биологических жидкостей на наркотические, психотропные и сильнодействующие лекарственные вещества.

Литература:

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. — М., Медицина, 1993. — Т.1. — 610 с.

2. Чернова Л. ВКарташов В.А. // Некоторые вопросы химико-токсикологического анализа: Сб. науч. тр. — Барнаул, 1989. — С. 74-79.

3. Allender W.J., Archer A.W., Dawson A.G. // J. Anal. Toxicol. — 1983. — Vol. 7. — P. 203-206.

4. Nascentes C.C., Cardenas S., Gallego M., Valcarcel M. // Anal. Chem. Acta. — 2002. — Vol. 462. — P 275-281.

5. Olmos-Carmona M.-L., Hernandez-Carrasquilla M. // J. Chrom. B. — 1999. — Vol. 734. — P 113-120.

6. Sgaragli G.P., Valoti M., Palmi M., Frosini M., Giovannini M.G., Bianchi L., Della Corte L. // J. Pharm. Pharmacol. — 1995. — Vol. 47. — P. 782-790.

7. Uges D. R.A. // TIAFT bulletin the international of forensic toxicologist. —1996. — Vol. 26. — № 1. — Supplement.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.