CC BY
65
бутылки, в которых обнаружены интенсивные пики железа. Исследованные образцы не были загрязнены кровью. На основании вышеизложенного сделан вывод, что подлинные повреждения могли быть причинены представленной бутылкой.
В двух других случаях исследования ран, имеющих морфологические признаки действия острой кромки травмирующего предмета, методом РСФА обнаружено достоверное превышение железа. На стенках повреждений выявлены микроосколки стекла. После предоставления следователями в качестве предполагаемых травмирующих предметов разбитых бутылок из под пива «Балтика» со следами крови, было проведено рентгеноспектральное исследование их незагрязненных наружной боковой поверхности и сколов, в которых выявлены интенсивные
1.
2.
3.
4.
5.
пики железа. Учитывая вышеописанные случаи, возможно превышение уровня железа в повреждениях в сравнении с контролем не только при наличии микроосколков стекла, как это приводится в литературных источниках [3], но и в результате контактного взаимодействия неповрежденной травмирующей поверхности бутылки.
В рамках интересующего нас вопроса были проведены экспериментальные исследования бутылок из зеленого, коричневого и прозрачного стекла. Во всех экспериментальных спектрах на наружной поверхности и на сколах методом РСФА обнаружены интенсивные пики железа.
Таким образом, мы предлагаем включать в экспертную деятельность сравнительное исследование не только морфологических особенностей подлинных повреждений и экспериментальных следов-отпечатков, но и учитывать элементный состав самого травмирующего предмета.
Литература:
Диагностикум механизмов и морфологии повреждений мягких тканей при тупой травме. Т. 6: Механизмы и морфология повреждений мягких тканей /В.Н. Крюков, Б.А. Саркисян, В.Э. Янковский [и др.] - Новосибирск: Наука, 2001. - 142 с.
Диагностические и идентификационные исследования повреждений тупыми твердыми предметами /В.В. Томилин, С.С. Абрамов, И.А. Гедыгушев [и др.] // Медико-криминалистическая идентификация / Под ред. В.В. 'Томилина, - М. Издательская группа НОРМА-ИНФРА М, 2000. -Гл. 5. - С. 43-60.
Назаров Г. H., Макаренко Т. Ф. Методы спектрального анализа в судебной медицине: Практическое руководство - М., 1994. - 359 с.
Пашкова В. И., Томилин В. В. Лабораторные и специальные методы -исследования в судебной медицине: Практическое руководство - М., 1975. - 125 с.
Самойлова Т. М., Заславский Г. И., Олейник В. H., Попов В. Л. Метод рентгеноспектрального флуоресцентного анализа (РСФА) в судебно-медицинской практике: Информационное письмо. - М., 2004. -9 с.
© А.Б. Мелентьев, А.В. Лаврентьева, 2010 УДК 340.67:616.634.94-074:543.544.45
А.Б. Мелентьев, А.В. Лаврентьева ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГАЛОПЕРИДОЛА В КРОВИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ — МАСС СПЕКТРОМЕТРИИ
ОГУЗ «Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы» (нач. - к.м.н. Е.Ф. Швед); Челябинская областная клиническая больница (гл.врач - А.Л. Журавлев)
Галоперидол (4- [4- (4-хлорфенил)-4-гидрокси-1 -пи-перидинил]-1-(4-фторфенил)-1-бутанон широко распространенный в психиатрической практике нейролептик, обладающий седативным действием и потенциирующий действие снотворных веществ и наркотических анальгетиков. Терапевтические концентрации в плазме крови 0,0050,04 мкг/мл, токсические 0,05-0,1 мкг/мл [3]. Галоперидол эффективен для купирования разного рода возбуждений, особенно при маниакальных состояниях и остром бреде [2]. Однако при передозировке или злоупотреблении может приводить к тяжелым отравлениям [1]. Для контроля детоксикации при отравлении галоперидолом, а также для терапевтического мониторинга необходима чувствительная и экспрессная методика определения галоперидола в плазме крови, которая была бы применима и для судебнохимических анализов при летальных отравлениях.
Целью данной работы явилась разработка методики количественного определения галоперидола в плазме и цельной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс селективным детектором, предназначенной для токсикологического, терапевтического мониторинга и судебно-химического анализа.
Материалы и методы исследования.
Оборудование. Жидкостный хроматограф с диодноматричным детектором Agilent Technologies 1200 с масс-селективным детектором 6120А. Предколонка 2,1*12,5 мкл с сорбентом SB-C8 5 мкм и хроматографическая колонка
Eclipse XDB-C18, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,5 мм и размером частиц фазы C18 5 мкм. Встряхиватель АВУ-6, набор пипеток-дозаторов фирмы Biohit.
Материалы и реактивы.
В качестве исходного раствора анализируемого вещества использовали порошок галоперидола соответствующий ФС 42-0225-07. Для приготовления раствора внутреннего стандарта использовали 1% раствор пир-роксана (пророксана) для инъекций фирмы «Фармакон», а также использовали следующие растворители: гептан, изоамиловый спирт, метанол, муравьиную кислоту квалификации ХЧ и деионизированную воду.
Внутренний стандарт. Стандартный раствор пиррок-сана с концентрацией 1 мг/мл готовили добавлением 100 мкл 1% раствора пирроксана к смеси 850 мл этанола и 50 мкл 0,1 н раствора хлористоводородной кислоты. Рабочий раствор с концентрацией пирроксана 0,01 мг/мл готовили добавлением 20 мкл стандартного раствора пирроксана с концентрацией 1 мг/мл к 1980 мкл этанола.
Стандартные и калибровочные растворы. Стандартный раствор галоперидола с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением 10 мг порошка галоперидола в 9,9 мл этанола с добавлением 100 мкл 0,1 н раствора хлористоводородной кислоты. Калибровочные растворы с концентрацией галоперидола 0,01; 0,001 и 0,0001 мг/мл готовили ступенчатым разведением стандартного раствора галоперидола этанолом. При приготовлении образцов
крови для построения калибровочной кривой использовали схему, приведенную в табл. 1. К 1 мл «холостой» крови добавлялось соответствующее количество одного из рабочих растворов (табл. 1). После этого калибровочные пробы проходили все процедуры пробоподготовки и анализа. По результатам анализов калибраторов строилась калибровочная кривая.
Таблица 1
Приготовление образцов для построения калибровочной кривой
№ пп. Название пробы Калибровочная концентрация в крови, мкг/мл Концентрация рабочего раствора, мг/мл Объём рабочего раствора на 1 мл крови, мкл
1 Бланк 0 0 0
2 Точка 1 0,001 0,0001 10
З Точка 2 0,005 0,0001 50
4 Точка 3 0,02 0,001 20
5 Точка 4 0,2 0,01 20
6 Точка 5 0,5 0,01 50
Результаты и их обсуждение.
В качестве внутреннего стандарта для анализа галоперидола выбран пирроксан (пророксан), так как он имеет близкие к галоперидолу физико-химические константы (рКа и logP), что обеспечивает их одинаковое поведение при экстракции и хроматографическом анализе. Кроме того, пирроксан в настоящее время в России не производится, потому вероятность его присутствия в анализируемых образцах минимальна, и нет необходимости проверять перед анализом на галоперидол образцы на его присутствие для получения достоверного результата.
Таблица 2
Воспроизводимость методики определения галоперидола в крови (Р=0.95, n=6)
Серия определений Найдено, *нг/мл Sr Найдено, **нг/мл Sr
1 11,5 ± 1,0 0,106 504 ± З1 0,077
2 9,7 ± 0,5 0,067 495 ± 26 0,066
З 11,З ± 0,6 0,065 516 ± 16 0,0З8
Для исследований и отработки методики использовали плазму или трупную кровь, проверенную на отсутствие галоперидола. До анализа образцы холостой и анализируемой крови хранили в морозильной камере при температуре минус 12°С. Подготовку крови проводили по следующей методике: к аликвотной части 1 мл крови добавляли 50 мкл раствора внутреннего стандарта (пирроксан - 0,01 мг/мл), 100 мкл 1н раствора гидроксида калия и 5 мл гептана с 2% изоамилового спирта. Содержимое встряхивалось 10 минут, органический слой отделялся и фильтровался через безводный сульфат натрия в полиропиленовую пробирку на 10 мл с завинчивающейся крышкой, куда добавлялось 250 мкл 0,5% раствора муравьиной кислоты. Содержимое встряхивалось 10 минут и 200 мкл нижнего водного слоя переносилось в виалу для автосамплера.
Хроматографический анализ: Образцы анализировали на жидкостном хроматографе LC-MS 1200 фирмы “Agilent Technologies” с масс-спектрометрическим детектором 6120А. Условия анализа: предколонка 2,1*12,5 мкл с сорбентом SB-C8 5 мкм, хроматографическая колонка 2,1*150 мм с обращено-фазным сорбентом Zorbax Eclipse XDB-18 Narro-Bore 5 мкм, температура колонки 40°С. Элю-енты - 0,2% муравьиной кислоты с рН=2,7 (А) и метанол (В), скорость подачи элюента 0,25 мл/мин, градиентный режим: в течение 15 мин поток элюента А меняется от 60 до 50% с и регенерация колонки в течение 3 мин 60% элюента А. Объем вводимой пробы 10 мкл. Масс-спектрометрический детектор работал в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Поток азота в источник ионов 5 л/мин, давление на небулайзере 20 psi, температура осушающего газа 350°С, испарителя 250°С, напряжение на капилляре 2000 вольт, ток коронного разряда 4 мка, Gain = 10, напряжение на фрагменторе 100 вольт, в режиме SIM с регистрацией положительных ионов: 376,2 (галоперидол), 338,2 (пророксан).
Правильность и воспроизводимость методики определяли по результатам анализа трех серий проб крови по 6 образцов каждая, содержащих по 10 и 500 нг/мл галоперидола.
* Введено 10 нг/мл (нижний контроль).
** Введено 500 нг/мл (верхний контроль)
В табл. 2 приведены данные по воспроизводимости разработанной методики. Предел обнаружения галопери-дола в плазме крови 0,5 нг/мл, в трупной гемолизированной крови 1 нг/мл. Предел количественного определения для плазмы и цельной крови 5 нг/мл, линейность 5-500 нг/мл.
Рис. 1. Хроматограммы экстракта плазмы крови, содержащей 200 нг/мл галоперидола, по протонированным молекулярным ионам галоперидола (а) и внутреннего стандарта (б). По абсцисс - время (мин), по оси ординат -интенсивность сигнала масс-селективного детектора.
На рисунке приведена хроматограмма экстракта трупной крови, содержащей 10 нг/мл галоперидола. Калибровочная кривая, полученная при отработке методики, описывается уравнением:
Y = 0,012 + 2,058*Х, R = 0,9991, где Y-концентрация галоперидола, Х- отношение площадей пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта, R- коэффициент корреляции.
Описанная методика охватывает область от терапевтических до летальных концентраций галоперидола в крови. Она применяется в настоящее время для судебно-химических анализов в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы, а также для токсикологических анализов в Челябинском областном токсикологическом центре.
Литература:
1. Клиническая токсикология детей и подростков /Подред. И.В. Марковой и др. - Спб., 1998, — Т.1.— 304 с.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х томах. Т.1.— 9-е изд., М.: Медицина, 1984. - 624 с.
3. Uges D.R.A. // TIAFT bulletin of the international association offorensic toxicologist - 1996. - Vol.26. №1.— Supplement.
