CC BY
13
УДК 577.175.8; 616.72-002.77-078
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ К АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМУ ФЕРМЕНТУ И ВАЗОАКТИВНЫМ ПЕПТИДАМ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ СИСТЕМНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
М. А. Мягкова1, Т. В. Абраменко1, И. П. Киселев1, М. Л. Станислав2*, O. A. Кост3*, И. И. Никольская , Е. В. Гарац , Алекперов Р. Т.
Институт физиологически активных веществ РАН; 2Институт ревматологии РАМН; ъкафедра энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва 119899, Россия; факс: (095)-939-54-17, e-mail: kost@enzyme.chem.msu.ru)
Впервые были определены уровни естественных антител (е-Ат) к ангиотензин-превращаю-щему ферменту (АПФ) класса IgM у больных системными заболеваниями соединительной ткани - системной красной волчанкой (СКВ), ревматоидным артритом (РА) и системной склеродермией (ССД). В целом по группам достоверных различий между уровнями анти-АПФ не выявлено. Установлено, что активность АПФ в сыворотке больных СКВ и ССД была ниже, чем в контрольных образцах. Анализ IgM е-Ат к вазоактивным пептидам показал повышение количества е-АТ к брадикинину (БК) в сыворотках больных СКВ и РА по сравнению с донорами и значительное снижение уровня антител к ангиотензину II (АН ) у больных ССД. При СКВ самые низкие уровни е-АТ ко всем исследованным медиаторам наблюдались у больных с нефритом, а уровни, превышающие значения доноров, - у больных с мочевым синдромом. У больных с нефритом уровень антител к вазопрессину (ВП) был ниже, чем у доноров. Для пациентов с РА наблюдались самые высокие значение е-Ат ко всем медиаторам при суставной форме заболевания. Отмечены различия по количеству циркулирующих е-Ат к БК по сравнению с донорами как в группе в целом, так и в подгруппах с системными проявлениями и суставной формой. Для ССД отмечены различия между подгруппой с диффузной и лимитированной формами по уровням е-Ат к БК и к АПФ.
Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пепти-дил дипептидаза, КФ 3.4.15.1) играет важную роль в регуляции гомеостаза, участвуя в функционировании ре-нин-ангиотензин-альдостероновой и калликреин-кинино-
вой систем. АПФ гидролизует декапептид ангиотензин I (А1) путем отщепления С-концевого дипептида (гисти-дил-лейцина), образуя прессорный октапептид ангиотензин II (А11). Кроме того, он участвует в деградации
*Адресат для переписки.
брадикинина - наиболее активного сосудистого вазодиля-тора. АПФ обнаружен во многих тканях, в частности в нервных клетках, в легочной ткани, в канальцах и клубочках почек, клетках семенных придатков, сердца, а также в циркулирующих клетках крови, а именно в моноцитах [1]. Однако основным местом локализации фермента является сосудистый эндотелий, где концентрация АПФ значительно выше, чем в циркулирующей крови. Установлена роль А11 в патогенезе застойной сердечной недостаточности и артериальной гипертензии [2], разрабатывается гипотеза, что АПФ, как и антиген фактора фон Виллебранда, является маркером поражения эндотелия при заболеваниях почек [3], а также при склеродермии [4] и других патологических состояниях. В последние годы АПФ привлекает внимание исследователей способностью влиять на иммунологические и воспалительные процессы. Показано, что низкая концентрация АПФ приводит к повышенным уровням брадикинина, субстанции Р, а те, в свою очередь, влияют на пролиферацию лимфоцитов, хемотаксис нейтрофилов и моноцитов [5] и высвобождение в кровь цитокинов (интерлейкина-6, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли) [6].
С развитием высокочувствительных методов иммунологических исследований было установлено, что в сыворотках здоровых людей содержатся в низких концентрациях антитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. В отличие от патологических, вызывающих аутоиммунные заболевания, они получили название естественных антител (е-Ат) [7, 8]. При повышении уровня эндогенных соединений или их метаболитов, происходит индукция иммунологических механизмов, что приводит к повышению уровня е-Ат против этих веществ, а затем и к их выведению с целью сохранения химического го-меостаза. Этот процесс протекает постоянно и является обязательным дополнением к ферментативным реакциям, протекающим в организме.
Цель данного исследования - оценка уровней е-Ат к АПФ и эндогенным медиаторам, влияющим на тонус сосудов (брадикинин, ангиотензин II, вазопрессин), а также выявление уровней активности сывороточного АПФ у больных с системными заболеваниями соединительной ткани, являющихся аутоиммунными болезнями.
Методы исследования
Исследования проводили на сыворотках крови больных ревматическими заболеваниями: системной красной волчанкой (СКВ), ревматоидным артритом (РА), системной склеродермией (ССД). Контрольную группу составили 10 практически здоровых доноров.
Характеристика больных. I группа включала больных СКВ (30 человек), II группа - больных РА (19 человек, из них 12 - с системными проявлениями заболевания, 7 - с суставной формой), III группа состояла из 36 больных ССД (из них 22 человека с лимитированной формой и 14 - с диффузной). Группы были сопостави-
мы по полу и возрасту (р > 0,05, где р - коэффициент достоверности [9]. При р < 0,05 ошибка эксперимента не превышает 5%).
Выделение АПФ. АПФ выделяли из мембранной фракции почек человека экстракцией в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 150 мМ №С1, 1 мкМ 2иС12 0,1% Тритон Х-100. Затем фермент очищали до электро-форетической гомогенности посредством аффинной хроматографии на лизиноприл-агарозе. Элюцию фермента осуществляли с помощью 50 мМ боратного буфера (рН 9,5), содержащего 0,1% Тритона Х-100. Концентрацию активных молекул АПФ определяли с помощью стехио-метрического титрования специфическим ингибитором АПФ лизиноприлом, как описано в [10].
Определение естественных антител к АПФ проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). Планшеты сенсибилизировали раствором антигена (100 мкл в лунку) в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 ч при 4°. При этом в ряду с 1 по 10 проводили титрование антигена с помощью двойных разведений, начиная с концентрации 10 мкг/мл. Затем после инкубации планшеты отмывали трижды 0,05%-м раствором Твин-20 в за-буференном физиологическом растворе (ЗФР) при рН 7,2 и вносили в лунки по 100 мкл исследуемой сыворотки в ЗФР, содержащем 0,1% Твин-20, которую предварительно раститровывали в ряды с помощью двойных разведений, начиная с разведения сыворотки 1:100. После инкубации в течение 1 ч при 37° планшеты отмывали, как описано выше, и добавляли в лунки конъюгаты антител против ^М человека, меченные пероксидазой хрена, в разведении 1:2000. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°, промывали, как описано выше, и заполняли субстратной смесью, содержащей 1,25 мМ о-фенилендиамина и 12% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере (рН 5,0). После 20-минутного инкубирования в темноте добавляли по 50 мкл 10% раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм (Б492). Затем строили кривые изменения зависимости оптической плотности как от концентрации сорбируемого антигена, так и от разведения исследуемой сыворотки для выбора условий индивидуального тестирования.
На основании разработанного ИФА анализировали содержание е-Ат к АПФ в индивидуальных сыворотках больных и доноров. Планшеты сенсибилизировали антигеном в концентрации 5 мкг/мл, разведение сыворотки составляло 1:200.
Определение антител против брадикинина (БК), ан-гиотензина II (А11), вазопрессина (ВП) проводили с помощью метода ИФА. Конъюгаты соответствующих антигенов были синтезированы на полимерной матрице 4-поли-нитрофенилакрилата по разработанным ранее методикам [11, 12].
Ферментативную активность АПФ в сыворотке крови измеряли по начальной скорости реакции гидролиза 50 мкМ раствора СЪ7-РЬе-Н18-Ьеи на спектрофлуориметре
«Hitachi MPF-4» (Япония), определяя продукт реакции (His-Leu) с помощью о-фталевого альдегида [10]. За единицу активности принято количество АПФ, расщепляющее 1 мкМ субстрата за 1 мин при 37°.
Полученные результаты были статистически обработаны на ПЭВМ в системе STATISTICA®в для Windows с использованием общепринятых в биометрии методик.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенного исследования были впервые определены уровни е-Ат к АПФ у больных системными заболеваниями соединительной ткани (таблица). Из-за значительных индивидуальных колебаний в целом по группам достоверных различий между уровнями анти-АПФ не было выявлено, но обращает на себя внимание некоторое повышение средних значений в группе больных СКВ и снижение в группе больных ССД. Именно при этих заболеваниях в большей степени наблюдаются сосудистые нарушения. Максимальные значения уровней анти-АПФ во всех группах больных более высокие, чем у здоровых доноров, что отражает типичную для аутоиммунных заболеваний гиперпродукцию антител.
Результаты оценки активности сывороточного АПФ (M±SD) представлены на рис. 1. Активность АПФ в крови больных СКВ (0,0248±0,0183) и ССД (0,0221±0,0218) почти в 2 раза ниже уровня активности у здоровых доноров (0,0442±0,0285), различия достоверны (p = 0,016 и p = 0,011 соответственно). В группе пациентов с РА активность АПФ определяли лишь у 8 человек, и у них средние значения не отличались от среднего уровня доноров. Снижение активности сывороточного АПФ при ССД подтверждено рядом ранее проведенных исследований [13] и косвенно отражает степень поражения эндотелия при данном заболевании [5]. Литературные данные по активности АПФ в сыворотке крови при СКВ не столь однозначны. С одной стороны, показано, что при люпус-нефрите наблюдается локальная внутрипочечная активация ренин-ангиотензиновой системы [14] с повышением уровня А11 и увеличением активности АПФ. С другой стороны, отмечается связь между показателями активности СКВ и генотипом II, обусловленным полиморфизмом 16 интрона гена, кодирующего АПФ. Генотип II связан с пониженным уровнем АПФ в крови [15, 16].
Литературные данные о степени активности АПФ при РА также противоречивы. Наблюдались как сравнимые с
0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0
доноры
СКВ
РА
ССД
Ат к БК
Ат к АН
Ат к ВП
Ат к АПФ
Рис. 1. Зависимость уровня активности АПФ в сыворотках больных различными заболеваниями соединительной ткани
□ РА все
□ РА с системными проявлениями
□ РА суставная форма
□ доноры
Рис. 2. Зависимость уровней естественных антител в сыворотках больных различными формами ревматоидного артрита.*- Различия достоверны (по сравнению с донорами).** - Различия достоверны между группами (РА с системными проявлениями и РА суставная форма)
уровнем доноров [17], так и высокие значения активности АПФ в сыворотке крови [18]. Отмечено, что при слегка повышенных уровнях активности АПФ в сыворотке активность АПФ в синовиальной жидкости более низкая. При этом степень активности фермента в синовиальной жидкости при РА выше, чем у больных с заболеваниями суставов, не относящихся к группе аутоиммунных, в частности, при остеоартрите [17].
В нашем исследовании не было получено корреляций между уровнями анти-АПФ и активностью самого фермента. Возможно, это связано с тем, что обнаруженные нами антитела могут образовываться к АПФ эндотелия сосудов или плазмы, в то время как для определения их использовался АПФ мембранной фракции почек человека. Кроме того, как уже отмечалось, АПФ может влиять на функцию лимфоцитов, и скорость и количество образования антител к нему могут не иметь линейной зависимости от активности фермента.
Уровни е-Ат к вазоактивным пептидам также представлены в таблице. Достоверные различия по группам в целом по отношению к донорам отмечены для антител к брадикинину в сыворотках больных СКВ и РА (в обоих случаях их уровни выше, чем у здоровых лиц, р < 0,05) и отмечено значительное снижение уровня антител к А11 у больных ССД (р = 0,000073). Объяснение полученных фактов требует дополнительных исследований, но необходимо отметить, что группы больных всех нозологий неоднородны по клиническим проявлениям, характеру течения заболевания и активности болезни в момент исследования. Кроме того, проводимая терапия также может влиять на концентрацию в крови эндогенных медиаторов, на скорость их деградации и, соответственно на процессы образования и элиминации аутоантител.
На рис. 2 представлены уровни е-АТ у больных РА (вся группа в целом и 2 подгруппы с системными проявлениями и с суставной формой) в сравнении с донорами. Отмечены достоверные различия по количеству циркулирующих е-Ат к БК по сравнению с донорами как в группе в целом (р = 0,0074), так и в подгруппах (с системными проявлениями р = 0,0478, с суставной формой р =0,0236). У больных с суставной формой был самый
Уровни естественных антител к ангиотензин-превращающему ферменту (АПФ) и вазоактивным пептидам у больных
системными заболеваниями соединительной ткани (М±8Б)
Группы Уровень антител к АПФ Антитела к брадикинину (D492) Антитела к ангиотензину II (D492) Антитела к вазопрессину (D492)
Среднее значение (D492) Колебание значений (D492)
Системная красная волчанка 0,23 0,10-0,51 0,330±0,125* 0,318±0,144 0,227±0,104
Ревматоидный артрит 0,21 0,08-0,46 0,332±0,095* 0,313±0,122 0,228±0,007
Системная склеродермия 0,16 0,01-0,39 0,228±0,064 0,201±0,061** Не определялись
Доноры 0,21 0,01-0,29 0,252±0,006 0,316±0,114 0,213±0,034
* p < 0,05 (в сравнении с донорами). ** p <0,001 (в сравнении с донорами).
высокий уровень е-Ат к БК, как, впрочем, и уровни е-АТ к другим субстратам. Этот феномен представляет особый интерес, так как суставы поражены у всех больных, а ревматоидный васкулит бывает только у больных с системными проявлениями, и можно было бы предполагать обратное соотношение.
Анализ полученных данных показал, что при СКВ у больных с нефритом уровень антител к ВП достоверно ниже, чем у доноров (р =0,03). В то же время у больных с мочевым синдромом (т.е. с умеренным поражением почек) он был даже выше, чем у доноров, хотя достоверно не отличался от среднедонорского уровня. Различия между подгруппами больных СКВ по данному параметру достоверно отличались (р =0,015). В отношении е-АТ к БК наблюдается та же зависимость. Самые высокие уровни антител к БК среди больных СКВ наблюдались у больных с мочевым синдромом (0,371±0,144), отличия от доноров достоверны (р = 0,0078), у больных с нефритом они были ниже (0,275±0,066), отличия между подгруппами больных СКВ также достоверны (р = 0,028). При сравнении уров-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yamada, H., Fabris, B, Allen, A.M., Jackson, B., Johnston, C.I.,
Mendelsohn, A.O. II Circ. Research. 1991. 68. P. 141.
2. Hirsch, A.T., Dzau, D.J.I Heart Failure and Arrythmias. I Еds. J.
Brachmann, R. Dietz, W. Kubler, Springer-Verlag, 1990. P. 7.
3. Romer F.K., Schmitz O. II Clin. Nephrol. 1984. 21. P. 178.
4. Matucci-Cerinic M., Pignone A., Lotti T., Sptillantini J., Kurradi C.,
Leontini G., Iannone F., Falcini F., Hirsch, A.T., Dzau, D.J. I Heart Failure and Arrythmias. / Еds. J. Brachmann, R. Dietz, W. Kubler, Springer-Verlag, 1990. P. 142.
5. Tiffany C.W., Burch R.M. II FEBS Lett. 1989. 247. P. 189.
6. Vandekerckhove F., Opderakker G., Ranst M. van, Lenaerts J.P.,
Put W., Billian A., Damme J. van II Lymphokine Cytokine Res. 1991. 10. P. 285.
7. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. II Антитела к физиологически ак-
тивным соединениям. М., 1981.
8. Lorber, M., Kra-Oz, Z, Shoenfeld, Y. II Lupus. 1995. 4. Suppl. 2.
P. 108.
9. Гланц С. II Медико-биологическая статистика. М., 1999. C. 117.
ней антител к БК, А11, ВП у больных как с тяжелым (нефрит), так и с умеренным поражением почек (мочевой синдром) в сравнении с донорами отмечена одна и та же тенденция: при нефрите наблюдались самые низкие уровни циркулирующих е-Ат. Хотя последние традиционно не считаются участвующими в патогенезе заболеваний, полученные данные могут послужить основой для дальнейших исследований, так как при нефрите происходит отложение иммунных комплексов в почках, что вызывает снижение их концентрации в сыворотке. При ССД достоверные различия между подгруппой с диффузной ССД и лимитированной получены по е-Ат к БК (р = 0,009) и е-Ат к АПФ (р = 0,018).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при системных заболеваниях соединительной ткани отмечаются особенности в уровнях циркулирующих е-Ат, они зависят как от нозологий, так и от особенностей клинической картины. Для уточнения физиологической или патологической роли антител к эндогенным медиаторам требуются дальнейшие исследования.
10. Биневский П.В., Никольская И.И., Позднев В.Ф., Кост О.А. // Биохимия. 2000. 65 (в печати).
11. Мягкова М.А., Бачурин С.О., Савицкий А.А., Станислав М.Л., Балабанова Р.М., Жохова Н.И., Панченко О.Н., Савицкая Ю.А. // Клин. лаб. диагн. 1999. № 4. С. 20.
12. Мягкова М.А., Панченко О.Н., Трубачева Ж.Н. // Ж. эксп. клин. диагн. 1997. № 6. P. 18.
13. Matucci Cerinic M., Borsotti M., Barbieri R., Lombardi A. // Clin. Rheumatol. 1987. 6. P. 300.
14. Harris R.C., Martinez-Maldonaldo M. // Miner Electrolyte Metab. 1995. 21. P. 328.
15. Rigat B., Hubert C., Alhenc Gelas F., Cambien F., Corvol P., Soubrier F. // J. Clin. Invest. 1990. 86. P. 1343.
16. Sato H., Akai Y., Iwano M., Kurumatany N., Kurioka H., Kubo A., Yamaguchi T., Fujimoto T., Dohi K. // Lupus. 1998. 7. P. 530.
17. Lowe J.R., Dixon J.S., Gutherie J.A., Mtwhinney P. // Ann. Rheum. Dis. 1986. 45. P. 921.
18. Sheikh I.A., Kaplan A.P. // Arthr. Rheum. 1987. 30. P. 138.
Поступила в редакцию 20.06.00
