CC BY
53
игинальные иссле
ü
в а н и я
'Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт
ревматологии» РАМН, Москва, 2Институт биохимической физики
им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва
'Research Institute of Rheumatology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow; 2N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow
Контакты: Анатолий Илларионович Сперанский labklim@mail.ru
Contact: Anatoly Illarionovich Speransky labklim@mail.ru
Поступила 01.06.2011
Экстрацеллюлярная ДНК и уровень еe метилирования при различных ревматических заболеваниях
Н.О. Шубаева1, В.А. Кузьмин2, О.А. Купавцева1, Е.Н. Александрова1, А.И. Сперанский1
Цель — изучить у больных с ревматическими заболеваниями (РЗ) качественный и количественный состав экстрацеллюлярной ДНК (эцДНК) сывороток: апоптотическую (нуклеосомы) и некротическую фрагментацию; комплексирование монометиновых белков с эцДНК; уровни метилирования эцДНК в сопоставлении с аутоиммунными и воспалительными маркерами.
Материал и методы. Обследован 101 больной: 28 — ревматоидным артритом (РА), 20 — системной красной волчанкой (СКВ), 14 — анкилозирующим спондилитом (АС), 31 — системной склеродермией (ССД), 8 — другими РЗ. Все больные отвечали требованиям классификационных критериев РЗ, принятых в НИИР РАМН. В контрольную группу вошли 15 здоровых лиц. Были исследованы: концентрация эцДНК в сыворотке крови, содержание фрагментов ДНК различной длины и монометинового белка, комплексированного с ДНК, степень метилирования ДНК, уровни сывороточного С-реактивного белка (СРБ), определявшегося высокочувствительным методом, ревматоидного фактора (РФ), антител к ДНК (а-ДНК), антинуклеарных антител (АНА). Результаты. У 50—70% больных РА, СКВ, АС, ССД по сравнению со здоровыми донорами определяются повышенные уровни эцДНК, апоптотической и некротической ДНК в сыворотке крови; изменена степень метилирования эцДНК (гипо- и гиперметилирование). Гипометилирование эцДНК при СКВ и ССД сопровождалось аутоиммунными нарушениями: наличием аутоантител к собственной ДНК и АНА. Высокие уровни метилирования эцДНК при РА ассоциировались с аутоиммунитетом и воспалением (повышением уровня РФ и СРБ). При АС гиперметилирование апоптотической и некротической ДНК и монометиновых белков коррелировало с воспалительной активностью и аутоантигенностью (появлением АНА и антител к нейтрофилам).
Заключение. РЗ характеризуются повышенной концентрацией апоптотической и некротической ДНК, нарушениями метилирования эцДНК, различной степенью комплексирования эцДНК с монометиновыми белками, что ассоциируется с гиперпродукцией аутоантител (включая антитела к эцДНК) и маркеров воспаления. Ключевые слова: экстрацеллюлярная ДНК, метилирование, апоптотическая и некротическая ДНК, аутоантитела, нуклеосомы, ревматические заболевания
EXTRACELLULAR DNA AND THE LEVEL OF ITS METHYLATION IN DIFFERENT RHEUMATIC DISEASES N.O. Shubayeva1, V.A. Kuzmin2, O.A. Kupavtseva1, E.N. Aleksandrova1, A.I. Speransky1
Objective: to study the qualitative and quantitative composition of serum extracellular DNA (exDNA); apoptotic (nucle-osomes) and necrotic fragmentation; complexification of monometinic proteins with exDNA; and the levels of exDNA methylation as compared to those of autoimmune and inflammatory markers in patients with rheumatic diseases (RD). Subjects and methods. One hundred and one patients, including 28 with rheumatoid arthritis (RA), 20 with systemic lupus erythematosus (SLE), 14 with ankylosing spondylitis (AS), 31 with scleroderma systematica (SDS), and 8 with other RDs, were examined. All the patients met the classification criteria accepted at the Research Institute of Rheumatology. A control group included 15 healthy individuals. The investigators studied the serum concentration of exDNA, the content of DNA fragments of different lengths and the monometinic protein complexified with DNA, the degree of DNA methylation, the levels of serum C-reactive protein (CRP) detectable by a high-sensitivity method, rheumatoid factor (RF), anti-DNA antibodies, and antinuclear antibodies (ANA).
Results. 50—70% of the patients with RA, SLE, AS, and SDS were found to have elevated serum levels of exDNA, apoptotic and necrotic DNA; the degree of exDNA methylation (hypo- and hypermethylation) was altered. In SLE and SDS, exDNA hypomethylation was attended by autoimmune disorders: the presence of proper DNA autoantibodies and ANA. In RA, the high levels of exDNA methylation were associated with autoimmunity and inflammation (increased RF and CRP levels). In AS, the hypermethylation of apoptotic and necrotic DNA and monometinic proteins correlated with inflammatory activity and autoantigenicity (the appearance of ANA and anti-neutrophil antibodies).
Conclusion. RDs are characterized by the higher concentration of apoptotic and necrotic DNA, impaired exDNA methylation, varying complexification of exDNA with monometinic proteins, which is associated with the hyperproduction of autoantibodies (including anti-exDNA antibodies) and inflammatory markers.
Key words: extracellular DNA, methylation, apoptotic and necrotic DNA, autoantibodies, nucleosomes, rheumatic diseases
Системная красная волчанка (СКВ), системная склеродермия (ССД), ревматоидный артрит (РА) относятся к системным аутоиммунным органонеспецифическим заболеваниям и характеризуются хроническим генерализованным воспалением, продукцией широкого спектра аутоантител (таких как антинук-леарные антитела — АНА, ревматоидный фактор — РФ, антитела к цитруллинсодержащим белкам), являющихся диагностическими кри-
териями аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний, которыми страдает около 10% населения планеты [1—4].
Современная клиническая концепция патогенеза ревматических заболеваний (РЗ), разработанная В.А. Насоновой, состоит в том, что иммуновоспалительные реакции патологических процессов и ассоциированные с ними клинические проявления болезни развиваются в организме с генетически нарушенным
Ор игинальные иссле д о в а н и я
иммунным ответом, являются многоплановыми и складываются из процессов воспаления и аутоиммунитета [5, 6].
Генез аутоиммунных нарушений рассматривается как результат воспаления с образованием модифицированных продуктов гибели клеток и изменениями экспрессии генов в Т-, В-клетках и макрофагах, связанных с эпигенетическими нарушениями метилирования ДНК [7—9].
В отличие от здоровых лиц, при СКВ определяется повышенная концентрация экстрацеллюлярной ДНК (эцДНК) — до 1180 нг/мл [10], при этом эцДНК представлена в виде фрагментированной ДНК (нуклеосом); некротической ДНК, обогащенной дезоксигуанозином и дезок-сицитозином; ДНК в составе иммунных комплексов, комплексов с ядерными белками, фибронектином, HMGB1 (группа хромосомных белков и провоспалительных медиаторов), монометиновыми белками, что отражает патологические процессы в иммунной системе и органах-мишенях [11—13]. Наличие гипометилированной эцДНК в Т- и В-лимфоцитах ассоциируется с гиперпродукцией антинукле-арных антител и сенсибилизированных лимфоцитов к ну-клеосомам. Для опухолевых заболеваний характерно гиперметилирование тотальной ДНК, включая циркулирующую [14]. Изменение в метилировании представляет собой так называемый эпигенетический механизм регуляции генов, который нарушен у больных ревматическими и опухолевыми заболеваниями. Для большинства РЗ характерно хроническое воспаление, обусловленное фактором некроза опухоли а (ФНО а), обладающим свойством вызывать и регулировать, наряду с другими белками, апоптоз и инициировать дальнейшую хронизацию воспалительных и аутоиммунных заболеваний [15].
Цель исследования — изучить качественный и количественный состав эцДНК, уровень метилирования эцДНК сывороток больных СКВ, ССД, РА, анкилозирую-щим спондилитом (АС) и другими заболеваниями, определить ассоциации увеличенного содержания эцДНК и ее качественных характеристик (апоптотическая, некротическая) со степенью метилирования эцДНК, уровнем аутоантител и маркерами воспаления.
Материал и методы
Исследования проведены у 101 больного РЗ: 18 больных РА (средний возраст 50,5±9,4 года; все пациенты серопозитивны по РФ, со II—III клинико-рентгенологической стадией), 20 больных СКВ (средний возраст 37,1±9,2 года; все позитивные по АНА, 6 — положительных по антителам кДНК — а-ДНК), 14 больных АС (средний возраст 40,8+12,1 года, 10 — положительны по HLA-B27), 31 больной ССД (из
них 15 — с лимитированной формой, 3 — с overlap-синдромом, 4 — с диффузной формой), 8 больных другими РЗ (подагра — 3, полиостеоартроз — 1, псориатический артрит — 1, мультифокальный фибросклероз — 1, эозинофильный фас-циит — 1, серонегативный спондилоартрит — 1). У 10 больных РА (средний возраст 41,3+11,6 года, все пациенты серопозитивны по РФ, со II—III клинико-рентгенологической стадией) исследовали уровень метилирования фрагмента 28S рДНК с использованием дот-гибридизации по Саузерну [16].
Все больные отвечали требованиям классификационных критериев РЗ, принятых в НИИР РАМН [1].
В контрольную группу вошли 15 здоровых доноров (средний возраст 37,3+15,2 года).
ДНК выделяли методом фенольной экстракции. Концентрацию выделенной ДНК определяли флюоримет-рически на приборе Shimadzu RF-5301PC (Япония) с использованием ДНК-связывающегося красителя Hoechst 33258. Белковый компонент, связанный с ДНК, выявляли по спектрам флюоресценции комплекса белок-краситель с помощью несимметричного метинцианинового красителя бис-Hoechst(’5), разработанного в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН [17].
Уровень моно- и олигонуклеосом, высокомолекулярной (ВМ) ДНК в сыворотке крови оценивали методом электрофореза в агарозном геле, окрашенном этидиум бромидом, с использованием программы анализа изображений Gel Analysis («Литех», Россия). Длина фрагментов определялась с помощью маркера DNA ladder (фрагменты стандартной длины, от 100 до 5000 п. н.).
Уровень метилирования ДНК анализировали с использованием сравнительного гидролиза ДНК двумя рест-риктазами (Нра11 и MspI):
- метилирование ДНК - методом денситометриче-ского анализа продуктов рестрикции при электрофорезе в агарозном геле с помощью программ обработки изображений Gel Imager и Gel Analysis 1.0, а также Adobe Photoshop [18];
- регионарное метилирование фрагмента 28S рДНК - методом количественной гибридизации с олигонуклеотидными и ДНК-зондами [17] (см. рисунок).
Диапазон определяемого уровня метилирования эцДНК составляет в норме 1,0—1,2 у. е., повышенным считается показатель метилирования >1,2 y. e., пониженным <1 у. е.
Концентрацию С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови измеряли высокочувствительным (вч) иммунонефе-лометрическим методом с латексным усилением с помощью
11,0 т.п.н. 246
2413
ÍT
1 2
<е246
Использование метода блот-гибридизации для анализа метилирования фрагмента гена 288 рДНК [19]. 1 - С5р6/-гидролизат ДНК; 2 - (Сэр6/+Нра//)-гидролизат ДНК. При отсутствии метилирования гидролизат данного фрагмента содержит очень короткие фрагменты (246 п.н.). Если часть сайтов метилированы, то в гидролизате присутствуют фрагменты большей длины
ор
игинальные иссле
в а н и я
автоматического анализатора BN-100 фирмы BEHRING (Германия). АНА определяли иммунофлюоресцентной техникой на срезах печени крыс и культуре клеток НЕр-2 (IMMCO, США), антитела к нативной ДНК (аДНК) — методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов производства Sigma Chemical (США), РФ — методом латекс-агглютинации.
Статистическая обработка проводилась с использованием программы Statistica 8.0. При статистическом анализе количественные показатели характеризовались средними значениями (М) и стандартным отклонением (SD), различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05, анализ корреляций проводился с использованием параметрического критерия Пирсона.
Результаты
Больные РЗ характеризуются повышенной концентрацией эцДНК в сыворотке крови по сравнению с нормой (р<0,05; табл. 1). Показатель метилирования >1,3 у. е. выявляется у 33% больных АС, 26% — РА, 29% — ССД, 5% -СКВ; показатель <1 у. е. обнаруживается у 32% больных СКВ, 20% - РА, 15% - АС, 6,5% - ССД.
Среднее содержание монометинового белка, компле-ксированного с эцДНК, у больных РА составило 57,3+21,2 у. е., СКВ - 91,9+53,5 у. е, ССД - 42,6+10,0 у. е., АС -83,7+40,0 у. е., при подагре - 74,3+40,0 у. е., других РЗ -57,0+16,6 у. е., в норме - 30,5+12,8 у. е. При всех заболеваниях, включенных в исследование, содержание мономети-нового белка было значительно превышено по сравнению со здоровыми донорами (p<0,05).
У всех больных РЗ определялась не только некротическая, но и апоптотическая ДНК в виде олиго- и монону-клеосом. У больных подагрой и АС в общем содержании ДНК преобладают некротические компоненты, тогда как у больных РА, СКВ и ССД в структуре эцДНК отмечается преобладание фрагментированной апоптотической ДНК, которая у здоровых лиц отсутствует (см. табл. 1).
У больных АС увеличенная концентрация эцДНК коррелировала с ее гиперметилированием (r=0,46; p<0,02), наличием моно- и олигонуклеосом (r=0,25; р<0,05), повышенным количеством лейкоцитов (r=0,48; р<0,05), повышением СОЭ (>20 мм/ч; r=0,41; p<0,039) и возрастанием уровня вчСРБ (r=0,38; p<0,015). Следовательно, процесс апоптоза при АС ассоциируется с гиперметилированием ДНК. Концентрация ВМ ДНК при АС прямо коррелирует с уровнем белка, комплексированного с ДНК (комплекс монометин-белок-ДНК; r=0,37; р<0,004) и обратно - с содержанием специфической щелочной фосфатазы (r=-0,26;
р<0,0035). Эти корреляции дают возможность предположить, что процессы апоптоза ассоциируются с воспалением, а некроза — с процессами деструкции и пролиферации.
При СКВ существует прямая корреляция между повышенной концентрацией эцДНК и уровнями олигонуклео-сом (г=0,64; р=0,0056) и мононуклеосом (г=0,58; р=0,009), что позволяет сделать вывод о происхождении эцДНК в основном из апоптотических клеток. В группе больных СКВ (п=5) с гиперметилированием эцДНК (показатель метилирования >1,3 у. е.) была отмечена корреляция между уровнем ВМ ДНК и метилированием (г=033; р=0,043).
В группе больных ССД с нормальным и гипометилированием (п=27) общая концентрация эцДНК составляла 217,0+96,0 нг/мл, что было достоверно ниже, чем в группе больных с гиперметилированием (п=4; показатель метилирования >1,3 у. е.) — 533,8+583,2 нг/мл (р=0,02).
При ССД, в отличие от АС и СКВ, отмечена достоверная прямая корреляция между уровнем метилирования и концентрацией эцДНК (г=0,65; р=0,013), некротической эцДНК, олиго- и мононуклеосом, монометинового белка (г=0,45; р<0,05), что свидетельствует о параллельно протекающих процессах некроза и апоптоза у больных ССД.
У 20% больных РА исследованной группы уровень метилирования был снижен по сравнению со здоровыми донорами (0,94+0,17 у. е.; р<0,05), общая концентрация эцДНК составляла 289,3+160,9 нг/мл. В данной группе обнаружена корреляция концентрации эцДНК с уровнями олиго- и мононуклеосом (г=0,29; р=0,038, и г=0,33; р=0,04), а также гипометилированием эцДНК (г=0,54; р=0,027). Повышенная концентрация эцДНК и высокий уровень олиго-и мононуклеосом у больных РА с гипометилированием эцДНК ассоциируются с гибелью клеток путем апоптоза. У 26% больных РА уровень метилирования эцДНК был повышен по сравнению со здоровыми донорами (1,56+0,11 у. е.; р<0,05), а общая концентрация эцДНК составляла 655,5+450,8 нг/мл, что ассоциировалось с повышенным содержанием СРБ (64,6+41,7 мг/л), тогда как в группе с нормальным и сниженным метилированием уровень СРБ был достоверно ниже (р=0,04), составляя 15,3+10,5 мг/л, т. е. при РА воспалительная активность ассоциируется с гиперметилированием. Монометиновый белок положительно коррелировал с некротической ДНК (г=0,66; р=0,013) и отрицательно — с уровнем олигонуклеосом (р=0,049; г=-0,46).
У 4 больных РА (достоверным, II—IV рентгенологическая стадия, давность болезни более 2 лет) и у нормальных доноров (п=8) было исследовано геномное метилирование эцДНК (гена рибосомных повторов 28Б рДНК). У одного больного было выявлено гиперметилирование ге-
Таблица 1 Концентрация ДНК, степень метилирования эцДНК, уровни высокомолекулярной (3000 п. н.),
олигонуклеосомальной (312 п. н.) и мононуклеосомальной (156 п. н.) ДНК в сыворотках больных РЗ, М±8й
Группы обследованных эцДНК, нг/мл Метилирование эцДНК, у. е. Высокомолекулярная эцДНК, у. е. Олигонуклеосомальная эцДНК, у. е. Мононуклеосомальная эцДНК, у. е.
РА 558,2±312,5* 1,4±0,3* 1,3±0,9* 1,2±0,5* 1,8±0,9*
СКВ 353,5±225,9* 1,2±0,4 1,4±0,7* 1,5±0,7* 1,4±0,8*
ССД 309,0±154,3* 1,3±0,3* 1,4±0,7 0,7±0,5* 1,2±0,6*
АС 388,1±245,3* 1,6±0,5* 1,6±0,9* 1,0±0,9* 1,1±0,9*
Подагра 249,4±111,9* 1,3±0,3* 1,8±0,6* 1,2±0,6* 1,0±0,5*
Другие РЗ 209,8±176,5* 1,1±0,1 0,7±0,4 0,7±0,4* 0,8±0,4*
Здоровые доноры 102,5±56,2 1,1±0,1 0,5±0,2 0 0
Примечание. *- р<0,05 по сравнению с донорами.
Ор игинальные иссле д о в а н и я
на 288 рДНК, у 3 больных — нормальный уровень метилирования. У всех больных отмечено увеличение концентрации эцДНК (2027,5+676,8 нг/мл), повышение уровней мо-но- и олигонуклеосом и ВМ ДНК по сравнению с нормой, что свидетельствует о наличии процессов и апоптоза, и некроза. У больного с гиперметилированием гена 28Б рДНК выявлен очень высокий уровень СРБ (65 мг/л), тогда как у других уровень СРБ составлял 10—28 мг/л.
В табл. 2 представлены результаты определения антител к собственной эцДНК с использованием иммунофер-ментной техники. У больных СКВ средний уровень антител к эцДНК составлял 35,3+20,5 ед., у трех больных уровень антител был ниже 20 ед. (отрицательный результат). Уровень метилирования в данной группе составлял 1,1+0,2 у. е. При ССД были выявлены наиболее высокие уровни антител.
При СКВ повышенные уровни антител к собственным нуклеосомам обратно коррелировали с уровнем моно-нуклеосом (г=-0,74; р=0,044), при ССД — с уровнем олиго-нуклеосом (312 п. о.; г=-0,19; р=0,039). Отмечена прямая корреляция уровней олигонуклеосом с титрами РФ (г=0,53; р=0,01) и обратная корреляция с концентрацией вчСРБ (г=-0,47; р=0,005). Гипометилирование эцДНК при ССД ассоциируется с повышением уровня СРБ (г=-0,71; р=0,025) и антител к собственным нуклеосомам (г=-0,39; р=0,005) в сыворотке крови. Напротив, при РА высокие уровни СРБ коррелируют с гиперметилированием эцДНК (г=0,37; р=0,035), образованием РФ (г=0,25; р=0,048) и отсутствием антител к собственным нуклеосомам (г=-0,57; р=0,044).
При СКВ уровень антител в группе с метилированием эцДНК >1,5 у. е. составлял в среднем 10,8+8,9 у. е. и достоверно отличался от среднего уровня антител в группе с метилированием <1,1 у. е., составлявшего 29,4+16,3 у. е.
Повышенные уровни антител к эцДНК были выявлены у единичных больных инфекционным эндокардитом (ИЭ), гломерулонефритом с почечной недостаточностью и перинуклеарными антинейтрофильными цитоплазматическими антителами, у двух больных АС.
Обсуждение
Обобщая имеющиеся данные литераты и результаты собственных исследований, можно сформулировать следующее представление о роли продуктов гибели клеток в ге-незе воспаления и аутоиммунных проявлений при СКВ, РА, АС, ССД.
Эти заболевания характеризуются активацией про-воспалительных цитокинов, образованием аутоантител, сенсибилизированных Т-лимфоцитов, процессами повышенной гибели клеток, накоплением в органах-мишенях апоптотических клеток или продуктов их гибели — нуклео-сом с аномально метилированной ДНК или в комплексе
с HMGB-1 и другими белками с последующей фиксацией аутоантител, цитотоксичных лимфоцитов, комплемента.
И.В. Давыдовский в 1929 г. [20] описал образование ядерного детрита в пораженных органах у больных СКВ и предполагал его роль в аллергизации и патогенезе этого заболевания. Появление в крови и межтканевых пространствах различных продуктов гибели клеток отражает патологические процессы, происходящие в различных органах и системах организма. С другой стороны, эти продукты обладают свойством вызывать образование аутоантител, про-воспалительных цитокинов, индуцировать пролиферацию. Исследование качественного и количественного состава эцДНК, ее комплексирования с белками расширяет наши представления о генезе воспалительных и аутоиммунных реакций при различных РЗ.
В последние годы значительно возрос интерес к исследованиям роли маркеров гибели клеток, или так называемых эндогенных лигандов, в оценке процессов аутоиммунитета, воспаления, повреждения тканей, клеток, онкогенеза, пролиферации, атеросклероза и др.
Выяснено, что эти процессы в организме можно оценивать, определяя в кровотоке и межтканевых пространствах уровень эцДНК [10].
У больных опухолевыми заболеваниями в результате гибели клеток в крови обнаруживается измененная гипермети-лированная ДНК тумор-супрессирующих генов, что в настоящее время используется для создания коммерческих тест-систем диагностики злокачественных новообразований [15].
Гипометилирование ДНК является причиной аномальной экспрессии отдельных генов в клетках иммунной системы, кератиноцитах, синовиоцитах, купферовских, эндотелиальных клетках у больных аутоиммунными РЗ [21, 22].
У большинства больных СКВ и у 20% больных РА эцДНК гипометилирована, у 26% больных РА — гипермети-лирована. Возможно, что такое гипометилирование при РА и СКВ отражает гипометилирование Т-клеточной ДНК, что приводит к генерированию аутореактивных Т-клеток [23, 24].
Циркулирующие и фиксированные нуклеосомы являются основными аутоантигенами для Т- и В-клеток [25]. У больных СКВ кератиноциты содержат фрагментированную ДНК и могут выполнять роль антиген-презентирую-щих клеток [26].
Отмечено, что при иммунизации мышей нуклеосома-ми из апоптотических клеток у отдельных особей могут появляться антитела к Бс1-70, Jo-1, 88А-Яо, 88В-^, Ш-КОТ, ДНК и гистонам [13, 27—29]. Основным источником образования АНА являются нуклеосомы и метилированная ДНК, комплексированная с белками, образующаяся в процессе апоптоза. При СКВ люпус-нефрит связан с интрагломеру-лярным клеточным апоптозом с образованием нуклеосом, являющихся мишенью для нефритогенных аутоантител [30].
Таблица 2 Уровень метилирования эцДНК, концентрация эцДНК и антитела к собственным нуклеосомам, М±80*
Показатели Диагноз (число больных)
РА (п=5) СКВ (п=11) ССД (п=14) АС (п=3) ИЭ (п=1) СЗСТ (п=1) ЮХА (п=1) здоровые доноры (п=7)
Антитела к собственным нуклеосомам, у. е. 12,5±13,6** 35,3±20,5** 95,9±56,9** 22,9±5,6** 38,2** 19,0 1,5 1,0±0,4
Уровень метилирования эцДНК, у. е. 1,7±0,6** 1,1±0,2 1,2±0,2 1,9±0,4** 1,2 - 1,0 1,1±0,1
Концентрация ДНК, нг/мл 485,4±246,4** 430,0±272,6** 307,0±97,8** 445,7±102,3** 571,1 - 166,5 64,5±28,7
Примечание. *- Данные для пациентов, у которых определялось наличие антител к собственным нуклеосомам; **- р<0,05 по сравнению со здоровыми донорами. СЗСТ - системные заболевания соединительной ткани; ЮХА - ювенильный хронический артрит.
OP
игинальные иссле
в а н и я
Наличие гиперметилированной ДНК в сыворотке при РА, возможно, ассоциируется с тем, что CpG-островки DR3-гена синовиальных клеток гиперметилированы и резистентны к апоптозу [31]. Наличие гиперметилированной ДНК в наших исследованиях ассоциировалось с повышенными уровнями некротической ДНК и высокими уровнями СРБ, т. е. отражало воспаление.
У больных ССД аутоиммунный процесс характеризуется избыточным отложением экстрацеллюлярного матрикса, фиброзом, облитерацией сосудов в соединительной ткани, легких, желудочно-кишечном тракте, сердце, почках. Топоизомераза I и ДНК обнаруживаются фиксированными на фибробластах, секретирующих профибротиче-ские цитокины, активируют циркулирующие моноциты, что приводит к воспалению и развитию аутоиммунитета. Антитела к топоизомеразе I связывают на клеточной поверхности нуклеосомы, ДНК-гистоновые комплексы, двуспиральную ДНК [32]. В результате эндотелиального апоптоза у больных с локализованной формой образуются антитела к топоизомеразе На, реагирующие с односпиральной ДНК, гистонами, наличие которых ассоциируется также с идиопатическим легочным фиброзом [33].
У больных АС средний уровень метилирования был повышен. ЭцДНК при АС связана с гиперметилированной некротической ДНК, комплексированной с монометиновым белком. Возможно, таким иммуногенным пептидом является аггрекан (основной компонент протеогликанов), поскольку в экспериментальных исследованиях показано, что введение его лабораторным животным вызывает спондилит [34].
На эндотелиальных клетках и кератиноцитах у больных СКВ, ССД, с синдромом Шегрена обнаруживается постоянная экспрессия интерферон-индуцибельных протеинов, стимулирующих апоптоз каспазо-зависимым путем, что позволяет рассматривать их роль в этиопатогенезе аутоиммунных заболеваний [35].
В группах больных с повышенными уровнями антител к собственной эцДНК обнаружена апоптотическая и некротическая ДНК, т. е. у больных СКВ и ССД наличие гипометилированной эцДНК, как апоптотической, так и некротической, является основным фактором аутоанти-генности, тогда как концентрация ДНК не является решающим фактором в образовании аутоантител, поскольку она была ниже, чем при РА, но выше, чем в норме.
Заключение
Таким образом, иммунный ответ на повреждающие организм реакции является нормальным процессом их элиминации в отсутствие эпигенетически модифицированной ДНК, тогда как присутствие такой ДНК (гипо- или гиперметилированной) может приводить к формированию аутоиммунитета, воспалению, хронизации процесса и развитию болезни. Качественные и количественные исследования циркулирующей ДНК позволяют оценить развитие патологических процессов, ассоциированных с воспалением, аутоиммунитетом, выявить генетический фенотип, ассоциирующийся с отдельными заболеваниями, с ги-периммунным ответом на аутоантигены и воспалительными деструктивными изменениями в организме.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ревматология. Клинические рекомендации. Под ред.
Е.Л. Насонова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008.
2. Насонов Е.Л. Перспективы развития ревматологии в XXI веке. Рус мед журн 2001;9:1031-7.
3. Siegal L.M., Lypsky P. Autoimmunity. In: F. Kelly. Textbook of Rheumatology. Philadelphia: W.B. Saunders Company, 2008.
4. Насонов Е.Л., Соловьев С.К., Ананьева Л.П. и др. Ритукси-маб: прогресс в лечении аутоиммунных ревматических болезней. Науч-практич ревматол 2010;4:3-9.
5. Насонова В.А. Ревматология: взгляд в XXI век. Вестн РАМН 2003;71:3-6.
6. Насонова В.А. Системная красная волчанка. В кн.: Ревматизм и другие коллагеновые болезни. Методические указания МЗ СССР. М., 1961;108 с.
7. Guendel I., Carpio L., Pedati C. et al. Methylation of the tumor suppressor protein, BRCA1, influences its transcriptional cofactor function. PLoS One 2010;29:11379.
8. Гвоздев В.А. Регуляция активности генов, обусловленная химической модификацией (метилированием) ДНК. Соросов-ский образоват журн 1999;10:11-7.
9. Александрова Е.Н., Шубаева Н.О., Купавцева О.А. и др. Метилирование экстрацеллюлярной ДНК при различных ревматических заболеваниях: Доклад. В кн.: VIII конференция ревматологов Урала, 28-30 июня 2010 г.
10. Steinman C.R. Circulating DNA in systemic lupus erythematosus. Isolation and characterization. J Clin Invest 1984;73(3):832—41.
11. Mortensen E.S., Rekvig O.P. Nephritogenic potential of antiDNA antibodies against necrotic nucleosomes. J Am Soc Nephrol Review 2009;20:696-704.
12. Seredkina N., Zykova S.N., Rekvig O.P. Progression of murine lupus nephritis is linked to acquired renal Dnase1 deficiency and not to up-regulated apoptosis. Am J Pathol 2009;175:97-106.
13. Urbonaviciute V., Furnrohr B.G., Meister S. et al. Induction of inflammatory and immune responses by HMGB1-nucleosome
complexes: implications for the pathogenesis of SLE. J Exp Med 2008;205:3007-18.
14. Robertson K.D. DNA methylation and human disease. Nature Rev Genetics 2005;6:597-610.
15. Laird P. The power and the promise of DNA methylation markers. Nature Reviews Cancer 2003;3:253-66.
16. Вейко Н.Н. Структурно-функциональная организация рибосом-ных повторов человека: Дис. ... д-ра биол наук. М., 2001;121 с.
17. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.
18. Wahlfors J., Hiltunen H., Heinonen K. et al. Genomic hypomethyla-tion in human chronic lymphocytic leukemia. Blood 1992;80:2074-80.
19. Cote B.D., Uhlenbeck O.C., Steffensen D.M. Quantitation of in situ hybridization of ribosomal ribonucleic acids to human diploid cells. Cromosoma 1980;80:349-67.
20. Давыдовский И.В. К вопросу об острой красной волчанке. Рус вестн дерматол 1929;7:450-72.
21. Gopalakrishnan S., van Emburgh B.O., Robertson D. DNA mety-lation in development and human disease. Mutat Res 2008;647(1-2):30-8.
22. Areti R., Polidoros K., Panayiotis M. et al. Systemic lupus erythematosus and epigenetics. E-Journal Sci Technol(e-JST) 2009;4:75-85.
23. Richardson B., Scheinbart L., Strahler J. et al. Evidence for impaired T cell DNA methylation in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Arthr Rheum 1990;33:1665-72.
24. Yung R.L., Richardson B.C. Role of T-cells DNA Methylation in lupus syndromes. Lupus 1994;3:487-91.
25. Bruns A., Bläss S., Hausdorf G. et al. Nucleosomes are major T and B cell autoantigens in systemic lupus erythematosus. Arthr Rheum 2000;43:2307-15.
26. Denfeld R.W., Kind P., Sontheimer R.D. et al. In situ expression of B7 and CD28 receptor families in skin lesions of patients with lupus erythematosus. Arthr Rheum 1997;40:814-21.
