CC BY
39
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHaibHoro ymBepcHrery BeTepHHapHoi' MeguuHHH
Ta 6ioTexHonoriH iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7318
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 619:619:616.981.51:615.33:616-085
Визначення чутливосл виробничого штаму Bacillus anthracis UA-07
до антибiотикiв
1.О. Рубленко1, В.Г. Скрипник2 rubs@ukr.net
1Бглоцеркгвсъкий нацюналъний аграрний умверситет, вул. Ставищансъка, 126, м. Б1ла Церква, 09100, Укра'на; 2Державний науково-дослгдний тститут з лабораторно'1 дiагностики та ветеринарно-сантарно' експертизи,
вул. Донецъка, 30, м. Киёв, 03151, Укра'на
Довготривале використання антибютиюв призводитъ до антибготикорезистентностг збудниюв. Окргм того, iснуе ймовгршстъ посттних генетичних змт у штамiв вна^док впливу навколишнъого середовища. Тому виникае необхiднiстъ у перiодичному до^дженш вакцинних штамiв на чутливктъ до антибютиюв iз метою вивчення та контролювання 'ix пас-портних характеристик. Метою наших до^дженъ було провести визначення чутливостi штаму Bacillus anthracis UA-07 до антибютиюв. Наведено резулътати до^дженъ чутливостi штаму Bacillus anthracis UA-07 до 50 антибютиюв, яку визначали за розмiром дiаметру зон затримки росту. Зону затримки росту до 15 мм вважали ознакою слабкоi чутливостi до антибiотика, зону 15-24 мм - ознакою чутливостi i зону понад 24 мм - ознакою високоi чутливостi штаму до даного антибiотика. Вiдсутнiстъ зон затримки росту вказувала на нечутливктъ штаму до даного антибiотика.
Резулътати до^дженъ свiдчатъ, що штам Bacillus anthracis UA-07 е високочутливим до офлоксацину (üf), амтци-лт/сулъбактаму (A/S10/10), лiнезолiду (LZ30), амоксицилту (AMX30), норфлоксацину (NX10), цефалотту (CEP30), тетрациклту (TE30). Не впливаютъ на розвиток до^джуваного мжрооргатзму антибiотики: цефетм (CPM30), шстатин (NS100U), цефуроксин (CXM30), цефексим (CFM5), сулъфадiазiн (SZ300), метротдазол (MT4), цефазолт (Cz30).
Krn4oei слова: сибiрка, чутливктъ, сттюстъ, резистенттстъ, зони росту, Bacillus anthracis UA-07, антибютики, концентращя, паперовi диски, л^вання.
Определение чувствительности производственных штаммов Bacillus anthracis UA-07 к антибиотикам
И.А. Рубленко1, В. Скрипник2 rubs@ukr.net
1 Белоцерковский националъный аграрный университет, пл. Соборная 8/1, г. Белая Церковъ, 09100, Украина;
2Государственный научно-исследователъский институт по лабораторной диагностике и ветеринарно-санитарной экспертизы, ул. Донецкая, 30, м. Киев, 03151, Украина
Длителъное исполъзование антибиотиков приводит к антибиотикорезистентности возбудителей. Кроме того, существует вероятностъ постоянных генетических изменений у штаммов вследствие воздействия окружающей среды. Поэтому возникает необходимостъ в периодическом исследовании вакцинных штаммов на чувствителъностъ к антибиотикам с целъю изучения и контроля их паспортных характеристик. Целъю наших исследований было провести определение чувствителъности штамма Bacillus anthracis UA-07 к антибиотикам. Приведены резулътаты исследований чувствителъ-ности штамма Bacillus anthracis UA-07 к 50 антибиотикам, которую определяли по размеру диаметра зон задержки
Citation:
Rublenko, I., Skripnik, V. (2017). Determination of sensitivity production strains Bacillus anthracis UA-07 to antibiotics. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(73), 84-88.
роста. Зону задержки роста до 15 мм считали признаком слабой чувствительности к антибиотику, зону 15-24 мм - признаком чувствительности и зону более 24 мм - признаком высокой чувствительности штамма к данному антибиотику. Отсутствие зон задержки роста указывало на нечувствительность штамма к данному антибиотику.
Результаты исследований свидетельствуют, что штамм Bacillus anthracis UA-07 является высокочувствительным к офлоксацину (Of), ампициллин / сульбактаму (A/S10/10), линезолиду (LZ30), амоксициллину (AMX30), норфлоксацину (NX10), цефалотину (CEP30), тетрациклина (TE30). Не влияют на развитие исследуемого микроорганизма антибиотики: цефепим (CPM30), нистатин (NS100U), цефуроксин (CXM30), цефексим (CFM5), сульфадиазин (SZ300), метронидазол (MT4), цефазолин (Cz30).
Ключевые слова: сибирская язва, чувствительность, устойчивость, резистентность, зоны роста, Bacillus anthracis UA-07 антибиотики, концентрация, бумажные диски, лечение.
Determination of sensitivity production strains Bacillus anthracis UA-07
to antibiotics
I. Rublenko, V. Skripnik rubs@ukr.net
Bila Tserkva National Agrarian University, Soborna sq., 8/1, Bila Tserkva, Kievska obl., 09117, Ukraine;
The State Scientific Research Institute of Laboratory Diagnostic and Veterinary Sanitary Expertise,
Donetska Str., 30, Kyiv, 03151, Ukraine
Long-term use of antibiotics leads to antibiotic resistance in pathogens. In addition, there is a possibility of permanent genetic changes in strains due to environmental influences. Therefore there is a need for periodic study vaccine strains for sensitivity to antibiotics in order to study and control of their passport characteristics. The aim of our research was necessary to determine the sensitivity of the strain of Bacillus anthracis UA-07 to antibiotics. The results of studies of sensitivity of strain Bacillus anthracis UA-07 to 50 antibiotics were determined by the size of the diameter of the zones of growth retardation. Zone growth delay of 15 mm was considered a sign of a weak antibiotic sensitivity, zone 15—24 mm - a sign of sensitivity and area of more than 24 mm - a sign of the high sensitivity of the strain to this antibiotic. Lack of stunted growth areas points to the insensitivity of the strain to this antibiotic.
The research results show that the strain of Bacillus anthracis UA-07 is highly sensitive to ofloxacin (Of), ampicillin / sulbactam (A/S10010), linezolid (LZ30), amoxicillin (AMX30), norfloxacin (NX10), cefalotin (CEP30), tetracycline (TE30). Not affect the development of the studied microorganism antibiotics, cefepime (SPM30), nystatin (NS100U) tsefuroksyn (CXM30) tsefeksym (CFM5), sulfadiazine (SZ300), metronidazole (MT4), cefazolin (C^°).
Key words: anthrax, sensitivity, stability, resistance, growth zone, Bacillus anthracis UA-07 antibiotics concentration, paper disc treatment.
Вступ
&6ipKa - це особливо небезпечне захворювання, яке рееструетъся серед тварин та людей майже у вах крашах земно1 кул^ характеризуется рiзними шляхами передачi шфекцп та тривалим часом юнування збудника у грунп (Devrishov еt al., 2005). Як наслвдок, кожна держава мае велику шльюсть стацюнарно-неблагополучних пункт. В Укрш'ш гх натчують понад 10000, Росп - 10000, Казахстан - 1293, Таджикистан - 1144, Узбекистан - 679, Молдовi - 765 (Devrishov еt al., 2005; Muminov еt al., 2010; Muminov еt al., 2012). В Украш для профшактичних та виму-шених щеплень тварин проти сибiрки застосовують споровi вакцини 3i штамiв Sterne, K79Z, UA-07 (Skripnik еt al., 2011). Проте недотримання рекомен-дацш ветеринарно1 служби власниками чи певними керiвниками господарств, призводить до виникнення захворювання. Для устшного лшування шфекцшного захворювання тварин у ветеринарнш практищ широко використовують антибютики. З метою вибору най-бшьш ефективного антибютика фахiвцi лабораторш проводить дослвдження визначаючи стутнь чутливо-ctî культури збудника до препарату (Tihonov еt al., 2004; Tekin еt al., 2013). У ветеринарп та твариннищга широко використовуються десятки антибютишв, як
випускае бюлопчна промисловють р1зних краш. Проте у свт icHye велика проблема резистентносп mîk-рооргашзм1в до антибютишв i збудник cибiрки не е винятком.
Також одшею i3 основних загроз захворювання тварин i людей на cибiркy е поширення збудника внаслвдок дiй бiотерориcтiв. На сьогодн icнye проблема швидкого i яшсного лiкyвання людей хворих чи шдозрших у захворюваннi. Ранiше вважалося, що збудник cибiрки високочутливий до пенщил^, але, вже доведено, що юнують штами зовciм не чyтливi до нього (Esel еt al., 2003). Тому вибiр ефективного лшування безпосередньо залежить вiд вивчення антибю-тикорезиcтентноcтi вiдомих штамiв Bacillus anthracis (Cavallo еt al., 2002; Esel еt al., 2003).
Choe еt al. (Choe еt al., 2004) проводили досль дження з вивчення причин резистентносп Bacillus anthracis штаму Sterne до антибактерiальних препа-pamie. Дослвдники довели вiдcyтнicть змш резистент-ноcтi протягом 5 пасаж1в збудника, але при подаль-ших доcлiдженнях виявлено наявнicть змiн, яш проявили себе через 18 пасаж1в.
На жаль, довготривале збер^ання збудника, паса-жування, використання антибютишв призводить до певно1 резиcтентноcтi мшрооргашзму до рiзних речо-вин. Тому виникае необхвдшсть у доcлiдженнi вак-
цинних шташв на чутливють до антибютишв i3 метою тдтвердження 1х паспортних характеристик.
Метою даних досл1джень було визначення чутли-восл штаму Bacillus anthracis UA-07 до антибютишв методом паперових дискiв. Було поставлено завдання провести оцiнку резистентносп штаму, виходячи з розмiру зон пригшчення росту: визначити не чутли-вiсть, слабку чутливiсть, чутливiсть та високу чутли-вiсть вакцинного штаму до антибактерiальниx препа-ратiв, як iснують на ринку Украши.
MaTepiai i методи дослiдження
Дослiдження проводилися на базi Державного на-уково-контрольного iнституту бютехнологп i штамiв мiкроорганiзмiв (м. Ки1в) та Бiлоцеркiвського нацю-нального аграрного унiверситету.
Дослiджували виробничий штам Bacillus anthracis UA-07, отриманий iз Нацiонального центру штамiв мiкроорганiзмiв Державного науково-контрольного iнституту бютехнологп i штамiв мiкроорганiзмiв (ДНК1БШМ).
За дослщження були використанi стандартнi папе-ровi диски дiаметром 7 мм, насинен антибiотиками, виробництва HIMedia Laboratories Pvt. Limited.
Для оцшки чутливостi використовували поживне середовище агар Хоттiнгера, яке готували iз сухого середовища промислового виробництва, вiдповiдно до шструкцп виробника. Шсля стерилiзацü' його роз-ливали у стерильш бактерiологiчнi чашки. Товщина агару у чашках була не менше 4 мм (на чашку дiамет-ром 100 мм було використано 25 см3 середовища). Чашки залишали у бока за шмнатно! температури для застигання. Перед шокулящею чашки пiдсушували у термостатi за 35 оС з привiдкритою кришкою протя-гом 10-20 хв. Конденсату рвдини на внутрiшнiй пове-рхш кришок не було.
Мiкробну суспензш дослiджуваного мжроорга-нiзму використовували в концентрацп 1х109 мжроб-них клггин у 1 см3. 1нокулюм був використаний про-тягом 15 хв iз моменту приготування. Його наносили пшеткою на поверхню поживного середовища в об'е-мi 1 см3, рiвномiрно розподiляючи по поверxнi.
Через 20 хвилин на поверхню поживного середо-вища розкладали диски з антибiотиками. Апткащю дискiв проводили за допомогою стерильного тнцета.
Вiдстань вiд диска до краю чашки i мiж дисками була 15-20 мм. Для кращо! дифузп антибiотикiв в агар, бактерюлопчш чашки з дисками витримували за шм-натно1 температури протягом 1,5 год.
Ввдразу пiсля аплiкацü' дисшв чашки помiщали у термостат догори дном i культивували за температури 37 °С протягом 24 год. Пiсля шкубацп чашки помща-ли догори дном на темну матову поверхню так, щоб свило падало на них тд кутом 45 °.
За дiаметру зон затримки росту до 15 мм штам Bacillus anthracis UA-07 вважали слабкочутливим до антибютика, за зон затримки у 15-24 мм - чутливим i понад 24 мм - високочутливим. Ввдсутнють зон затримки росту вказувала на нечутливiсть Bac. anthracis до даного антибiотика.
Результати та ix обговорення
Результати дослiджень наведенi у таблищ 1. Ана-лiз матерiалiв дослiджень свiдчить, що штам Bacillus anthracis UA-07 чутливий до б№шосп дослiджениx антибiотикiв, що пiдтверджуеться дiаметрами зон затримки росту. При порiвняннi розмiрiв зон затримки росту виявлено, що до 14 % антибютишв (цефуро-ксину, сульфадiазiну, метротдазолу, цефазолiну та iн.) штам не чутливий (рис. 1).
1 El ДСу ТШ СТЬ
затримки росту i Е1Д 1 ДО 15 мм
■ Е1д 15 до 24 мм
■ бшьшс 24 мм
Рис. 1. Чутливiсть штаму Bacillus anthracis UA-07 у ввдсотках
Лише 2% антибютишв (олеандомщин, метицилин, метрощдазол) проявляють слабку дiю на Bacillus an-thracis UA-07. Штам UA-07 виявився високочутли-вим до багатьох антибютишв.
Таблиця 1
№з/п Ha3Ba aHTH6ioTHKiB Концентрацiя, мкг/диск Позначення на диску Дiаметр зони затримки росту, мм
1 Ofloxacin (o^okc^hh) 5мкг/диск Of5 35
2 Furazolidone ($ypa3omgoH) 50 мкг/диск Fr50 16
3 Spiramycin (cmpaMiuHH) 30 мкг/диск SR30 25
4 Vancomycin (BaHKOMiuuH) 30 мкг/диск VA30 15
5 Azithromicin (a3npoMiuuH) 15 мкг/диск AZM15 22
6 Norfloxacin (Hop^noKcauuH) 10 мкг/диск NX10 27
7 Vancomycin (BaHKOMiuuH) 5 мкг/диск VA5 14
8 Nitroxoline (HiTpoKco^HH) 30 мкг/диск NO30 21
9 Novobiocin (H0B06i0UHH) 30 мкг/диск NV30 23
10 Chloramphenicol (xnopaM^emKon) 25 мкг/диск C25 24
11 Cefepime (це$епiм) 30 мкг/диск CPM30 0
12 Linezolid (mHe3omg) 30 мкг/диск LZ30 31
13 Cefamandole ^e^aMaHgon) 30 мки/джк FAM30 23
14 Sulfasomidine (cynt$a3oMigHH) 300 мкг/диcк SO300 21
15 Kanamycon (KaHaMiuHH) 30 мкг/диcк K30 25
16 Cefoperazone ^e$anepa3oH) 75 мег/ДЖК CPZ75 20
17 Bacitracin (6auHTpauHH) 10U мкг/диcк B10U 13
18 Ampiclin/Sulbactum (aMniqeniH/cynt6aKTaM) 10/10 мки/джк A/S^0 33
19 Teicoplanin (TeftKonnaHiH) 30 мкг/диcк TEI30 21
20 Nystatin (HicTaTHH) 100U мкг/диcк NS1uuU 0
21 Oleandomycin (oneaHgoMiuHH) 15 мки/джк OL15 14
22 Cefuroxime ^e^ypoKCHH) 30 мкг/диcк CXM30 0
23 Methicillin (MeTiuHnnrn) 10 мки/джк MET10 13
24 Tetracycline (TeTpauHKniH) 30 мкг/диcк TE30 27
25 Doxycycline Hydrochloride (goKCHunnma rigpoxnopngy) 30 мкг/диcк DO30 25
26 Cefixime (^^hkchm) 5 МЕГ/ДИЖ CFM5 0
27 Cephalothin ^ei^anoTm) 30 мкг/диcк CEP30 27
28 Clindamycin (KniHgaM^iH) 2 МЕГ/ДИЖ CD2 19
29 Tobramycin (тo6paмiцiн) 30 мкг/диcк TOB30 23
30 Rifampicin (pi^aMm^H) 30 мкг/диcк RIF30 16
31 Methicillin (MeTHunnHH) 5 мег/ДИЖ MET5 13
32 Amoxycillin (aMoKc^iniH) 30 мкг/диcк AMX30 30
33 Tobramycin (To6paMi^H) 10 мки/джк TOB10 20
34 Lincomycin (nimoMiqiH) 2 мкг/диcк L2 25
35 Ticarcillin/Clavulanic (тiкapцnнн/ KnaBynoHOBa KucnoTa) 75/10 мкг/диcк TCC75/10 25
36 Ceftazidime ^e$Ta3igiH) 30 мки/джк CAZ30 21
37 Netillin (HeTinMiuHH) 30 мкг/диcк NET30 23
38 Ticarcillin (THKapunniH) 75 мкг/диcк TI'5 26
39 Oaxacillin (oKcauHnrn) 5 мкг/диcк OX5 21
40 Sulphadiazine (cynt$agia3m) 300 мкг/диcк SZ300 0
41 Streptomycin (crpenTOMiuHH) 10 мкг/диcк S10 20
42 Metronidazole (MeTpoHiga3on) 5 мкг/диcк MT5 9
43 Metronidazole (MeTpoHiga3on) 4 мкг/диж MT4 0
44 Cefazolin ^e$a3onm) 30 мкг/диcк Cz30 0
45 Levomicytin ,HeBoMk[eTiH 30 мкг/диcк L30 22
46 Neomicin (HeoMiuHH) 30 мкг/диcк N30 18
47 Amikacin (aMkauHH) 30 мкг/диcк Ak30 26
48 Fusidic acid ($y3igiH) 10мкг/диcк Fc10 16
49 Gentamicin (reHTaMiuHH) 10 мкг/диcк G10 23
50 Erythromycin (epmpoMiqHH) 15 мкг/диcк E15 15
Ошбливо cлiд вiдмiтити нaйбiльшy чутливють (зони зaтpимки pocтy 35-30 мм) до oфлoкcaцинy, aмпiцeлiн/cyльбaктaмy, лiнeзoлiдy, ^о^идил^. Дeщo мeнший дiaмeтp зaтpимки pocry (24-29 мм) виявили до нopфлoкcaцинy, дeфaлoтiнy, тeтpaциклiнy тa iн.
Висновки
3a peзyльтaтaми дocлiджeнь вcтaнoвлeнo, що штш Bacillus anthracis UA-07 e втеокочутливим до офлок-caцинy (Of5), aмпiдeлiн/cyльбaктaмy (A/S1010), лжзо-лiдy (LZ30), aмoкcидилiнy (AMX30), нopфлoкcaдинy (NX10), цeфaлoтiнy (CEP30), тeтpaциклiнy (TE30). He впливэють нa picт дocлiджyвaнoгo штйму arn^iora-ки: дeфeпiм (CPM30), нicтaтин (NS100U), дeфypoкcин (CXM30), дeфeкcим (CFM5), cyльфaдiaзiн (SZ300), мeт-poнiдaзoл (MT4), цeфaзoлiн (Cz30).
У пepcпeктивi пoдaльших дocлiджeнь плaнyeтьcя вивчeння чyтливocтi до am^iora^ y польових ку-льтyp збуднига cибipки. Вивчeння впливу arn^iora-шв нa видiлeнi пoльoвi кyльтypи дозволить удоотота-лити зняння щодо змш у aнтибioтикopeзиcтeнтнocтi
Bacillus anthracis, допоможе при необхвдносп прово-
дити ефективне лшування тварин та людей.
Бiблiографiчнi посилання
Devrishov, D.A., Navruzshoeva, G.S., Anojatbekov, M.A. (2005). Jepiootologicheskie dannye po sibirskoj jazve zhivotnyh v Tadzhikistane. Veterinarnaja medicina. 1, 27-28 (in Russian).
Devrishov, D.A., Navruzshoeva, G.S., Anojatbekov, M.A. (2005). Jeksperemental'nye ispetanija antraks-vakcin. Veterinarnaja medicina. 1, 25-27 (in Russian).
Muminov, A.A., Devrishov, D.S. (2012). Geograficheskoe raspostranenie i osnovnye cherty jepizootologii sibirskoj jazvy v Tadzhikistane. Veteri-narnaja medicina. 2, 57-61 (in Russian).
Muminov, A.A., Anojatbekov, M., Jarbaev, N., Rez-bonov, R. (2010). Sovremennaja jepizooticheskaja situacija severnogo Tadzhikistana po sibirskoj jazve Veterinarnaja medicina. 5-6, 78-80 (in Russian).
Skripnik, V.G., Kovalenko, V. (2011) Sibirskaja jazva. The Ukrainian farmer. http://www.agrotimes.net/ magazines. (in Russian).
Tihonov, I.V., Mirzoev, M.N., Cherkashina, N.V., Va-sil'ev, P.G., Galiullin, A.N., Mahortov, V.L., Litusov, N.V., Rogozhin, A.Z., Zabokrickij, A.N., Demina, L.V., Il'jasova, O.I. (2004). Sovremennye podhody k primeneniju antibiotikov v veterinarii. Veterinarnaja medicina. 4, 38-40 (in Russian).
Tekin, M.Z., Ari, S., Dal, T., Kaya, S., Kortak, B. Dursun, S., Dayan, R. (2013) Evaluation of cutaneous palpebral anthrax Cutaneous Ocular Toxicology. 32(4), 294-298. doi:10.3109/15569527.2013.781620.
Esel, D., Doganay, M., Sumerkan, B. (2003) Antimicrobial susceptibilities of 40 isolates of Bacillus anthracis isolated in Turkey Int. J. Antimicrob Agents. 22(1), 70-72.
Cavallo, J., Savallo, J., Ramisse, F., Girardet, M., Vaissaire, J., Mock, M., Hernandez, E. (2002). Antibiotic Susceptibilities of 96 isolates of Bacillus anthracis Isolated in France between 1994 and 2000. Antimicrob Agents Chemother. 46(7), 2307-2309. doi:10.1128/AAC.46.7.2307-2309.2002.
Choe, C.H., Bouhaouala, S.S., Brook, I., Elliot, T.B., Knudson, G.B. (2004). In vitro development of resistance to ofloxacin and doxycycline in Bacillus an-thracis Sterne. J. Antimicrobial agents and chemotherapy. 44(6), 1766-1766. PMID:10896651.
Стаття надiйшла до редакцИ' 24.02.2017
