CC BY
132
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 123-128.
УДК 543.48:547-3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ С ПОМОЩЬЮ РЕАКЦИЙ ОКИСЛЕНИЯ 3,3',5,5-ТЕТРАМЕТИЛБЕНЗИДИНА ПЕРСУЛЬФАТОМ И ПЕРЙОДАТОМ
© Г.А. Крывшенко , М.К. Беклемишев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119992 (Россия) e-mail: [email protected]
Предложен метод оценки антиоксидантных свойств индивидуальных соединений и растительных экстрактов по отношению к окрашенным продуктам реакций окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) перйодатом и персульфатом. Сопоставлены характеристики предложенной методики и известных способов определения антиоксидантной активности, Ключевые слова: 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, антиоксиданты, окислительно-восстановительная реакция, персульфат, перйодат,
Введение
Для определения антиоксидантной активности (АОА) отдельных соединений и сложных смесей, в том числе растительных экстрактов, предложен ряд химических методов. Среди спектрофотометрических наиболее распространены методы, основанные на получении устойчивых окрашенных комплексов, катион-радикалов (таких как 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислота) (АБТС) [1] или стабильных радикалов (например, 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ) [2] и их дальнейшего взаимодействия с соединением, обладающим антиоксидантной активностью. Чаще всего используют генерацию устойчивого окрашенного катион-радикала в системе АБТС - пероксид водорода - пероксидаза с последующим его взаимодействием с антиоксидантом, приводящим к уменьшению светопоглощения [1]. Разработаны усовершенствованные способы получения АБТС-радикала: взаимодействием исходного АБТС с радикалом феррилмио-глобина, который образуется в результате реакции метмиоглобина с пероксидом водорода [33], окислением АБТС оксидом марганца(1У) [4] и персульфатом [5]. Количественно АОА выражают в единицах TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) [6].
Некоторые методики дают завышенные результаты при определении АОА вследствие взаимодействия реагента с соединениями, не обладающими антиоксидантной активностью. Так, в методе с использованием реактива Фолина, основанном на подавлении окраски восстановленной формы этого реактива, помимо антиоксидантов окисляются, например сахара [7]. Метод FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power) [8] основан на восстановлении Fe(III) до Fe(II). Предложено несколько соединений, способных восстанавливаться в присутствии антиоксиданта, например, неокрашенный Fe(III)-тpипиpидилтpиaзинoвый комплекс, переходящий в комплекс Fe(II) голубого цвета. Методика проста и экспрессна, однако окрашенный комплекс формируется в кислой среде (pH 3.6), что намного ниже физиологического pH. Кроме того, методика не позволяет определить антиоксиданты, ограниченно растворимые в воде. Метод ORAC (Oxygen Radical Absorption Capacity) [9] основан на измерении не светопоглощения, а флуоресценции (например, флуоресцеина). В присутствии антиоксидантов время флуоресценции увеличивается вследствие защитного действия антиоксидантов; площадь ме^ду кривыми до и после добавления антиоксиданта соответствует величине АОА.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Названные методы принципиально не сложны, однако требуют времени и соблюдения ряда условий на стадии получения окрашенных радикалов и при их хранении. Некоторые методики сложны в приборном оснащении и поэтому не подходят для массового анализа. Кроме того, результаты анализа, полученные различными методами, не всегда сопоставимы, поскольку чувствительность определения индивидуальных антиоксидантов с помощью разных индикаторных реакций различается. В настоящее время нет единого стандарта для количественного определения антиоксидантов [10], что, в свою очередь, затрудняет сравнение результатов, полученных различными методами.
3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) - это ароматический диамин, легко окисляющийся с образованием интенсивно окрашенного продукта, использованный ранее, в том числе нами [11, 12], для определения ионов металлов. В предварительных исследованиях было найдено, что на скорость окисления ТМБ различными окислителями влияют некоторые органические соединения, в том числе сильные восстановители. В связи с этим представлялось возможным использовать реакции окисления ТМБ и заранее полученного продукта его окисления для оценки АОА. В данной работе предложены способы оценки АОА с использованием реакций окисления ТМБ, и их аналитические характеристики сопоставлены с характеристиками известного метода обесцвечивания катион-радикала АБТС.
Рассмотрены два способа определения АОА: первый основан на предварительном получении окрашенного продукта реакции окисления ТМБ и последующем измерении антиоксидантной активности исследуемого объекта по уменьшению интенсивности поглощения этого окрашенного продукта («равновесный вариант»); второй - на фотометрическом измерении скорости образования окрашенного продукта реакции окисления ТМБ, которая должна замедляться в присутствии веществ, обладающих АОА («кинетический вариант»). Параллельно определяли АОА с помощью АБТС.
Экспериментальная часть
Использовали дистиллированную воду, дополнительно очищенную на установке Millipore. Растворы АБТС и окислителей готовили в воде, а ТМБ - в этаноле (ООО «Брынцалов-А»). Радикал-катион АБТС получали согласно методике [5]; максимальная концентрация радикала АБТС"+ достигается спустя 6 ч после добавления окислителя [5]. АБТС"+ имеет три полосы поглощения в видимой области спектра с максимумами при 650, 730 и 812 нм; измерения проводили при 650 нм. Концентрацию АБТС"+ в рабочей смеси готовили такой, чтобы его оптическая плотность при 650 нм составляла около 0,7.
Для оценки АОА соединений в системе с ТМБ получали окрашенный продукт окислением ТМБ персульфатом калия или перйодатом натрия.
Определение антиоксидантной активности в кинетическом варианте. Окисление ТМБ персульфатом протекает очень быстро, поэтому кинетический вариант оценки АОА реализовали на примере реакции окисления ТМБ перйодатом. Для этого непосредственно в кювете смешивали 200 мкл 1 • 10-2 М раствора ТМБ, 100 мкл анализируемого раствора и 100 мкл 2-10-3 М раствора перйодата натрия. Доводили объем смеси водой до 2,0 мл, помещали кювету в спектрофотометр и измеряли светопоглощение синего продукта каждые 10 с при 650 нм. Для построения линейной зависимости скорости реакции от концентрации антиоксиданта использовали площади под кинетическими кривыми за 5 мин, которые рассчитывали при помощи программы GraphPad Prism 5 [14]. Полученные данные далее применяли для расчета TEAC анализируемых объектов.
Определение антиоксидантной активности в равновесном варианте. Для приготовления синего продукта окисления ТМБ в пластиковый контейнер при помощи дозатора вводили 200 мкл 1-10-2 М раствора ТМБ, 100 мкл 1-10-3 М раствора персульфата и затем разбавляли смесь до 10 мл, после чего оставляли раствор на 10 мин в темном месте (продукт фоточувствителен, на ярком свету интенсивность окраски снижается). Далее отбирали аликвоту окрашенного раствора (2 мл) и вводили в нее около 100 мкл анализируемого раствора, выбирая количество вводимого раствора так, чтобы поглощение продукта окисления ТМБ уменьшалось на 30-60%. Далее смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 3 мин и измеряли ее поглощение.
Определение антиоксидантной активности в тест-варианте. Тест-определение с использованием реакции ТМБ-периодат проводили на фильтровальной бумаге (синяя лента). В центр квадрата бумаги размером 1,5х 1,5 см наносили исходные реагенты в следующем порядке: 20 мкл 1-10-2 М раствора ТМБ, 20 мкл раствора исследуемого соединения и 30 мкл 1-10-3 М раствора перйодата. Спустя 1 мин визуально сравнивали интенсивность окраски образовавшегося синего продукта со шкалой. Для получения цветной шкалы
вместо раствора исследуемого соединения на бумагу наносили 20 мкл растворов тролокса в интервале концентраций 1-10-5-1-10-3 М.
Обработка результатов. В качестве характеристики АОА использовали универсальный параметр TEAC [6]. Величина TEAC индивидуального соединения равна концентрации раствора тролокса (ммоль/л), обладающего таким же действием в используемой реакции, как раствор исследуемого вещества с концентрацией 1 ммоль/л или раствор изучаемого объекта с концентрацией 1 г/л.
Объекты исследования. Определяли АОА индивидуальных антиоксидантов различных классов: кверце-тина, аскорбиновой, галловой и мочевой кислот. Кроме того, анализировали растительные объекты - черный и зеленый чай, водные настои ромашки и бессмертника, а также биологические жидкости (мочу). Для измерения светопоглощения использовали спектрофотометр СФ-102 и фотометр КФК-3.
Результаты и обсуждение
Сам ТМБ не поглощает в видимой области спектра. Возможно получение различных окрашенных продуктов: в результате одноэлектронного окисления при недостатке окислителя ТМБ образуется мерихиноид-ный комплекс, имеющий синюю окраску [13]; при избытке окислителя конечный продукт - хинондиимин, окрашенный в желтый цвет (рис. 1); при промежуточных количествах окислителя получаются продукты, окрашенные в зеленые цвета.
В качестве окрашенного соединения, восстанавливаемого антиоксидантами, использовали продукт одноэлектронного окисления ТМБ, имеющий синюю окраску [13], поскольку при получении этого продукта весь окислитель расходуется на реакцию с ТМБ и впоследствии не может вмешаться в реакцию с антиоксидантами. Окрашенный продукт образуется почти полностью через 2 мин, а максимальный его выход наблюдается через 5 мин. Раствор продукта стабилен в широком диапазоне pH (2,0-8,0) и может храниться в течение нескольких дней в темноте.
Данные, полученные методом окисления ТМБ-персульфатом, сравнили с результатами, полученными методом обесцвечивания АБТС-радикала. Среди индивидуальных соединений максимальной антиоксидантной активностью обладает кверцетин. Данные, полученные методами обесцвечивания продуктов окисления АБТС и ТМБ, близки (табл. 1), что подтверждает работоспособность предлагаемого варианта методики.
Использование продукта окисления ТМБ-персульфатом возможно для оценки АОА как индивидуальных соединений, так и объектов различной природы. В таблице 1 приведены наши и литературные результаты определения АОА индивидуальных соединений различными методами. Как можно видеть, предлагаемый метод восстановления продукта окисления ТМБ позволяет получить сигнал для всех трех изученных соединений, причем по чувствительности не уступает ранее предложенным методам.
Вещества, не обладающие антиоксидантной активностью (например, бензиловый спирт, метиламин, теобромин, конваллятоксин, гистамин, меламин, лимонная кислота), не уменьшают поглощение окрашенных соединений. Также не оказывают влияния белки. Так, введение в систему до 2,5 г/л альбумина или глобулина не влияет ни на интенсивность поглощения окрашенного продукта, ни на скорость его образования, что позволяет использовать данный метод для анализа биологических жидкостей. Например, кинетический вариант метода, использующий реакцию окисления ТМБ перйодатом, можно использовать для определения АОА мочи (рис. 2). В присутствии мочи, разбавленной водой в 5 раз, скорость реакции уменьшается вдвое, что соответствует эффекту 1,5 ммоль тролокса. Аналогичные значения АОА получены [16] методом обесцвечивания АБТС - 1,95 ммоль и методом FRAP - 1,52 ммоль в тролоксовом эквиваленте.
Таблица 1. Значения ТЕАС индивидуальных соединений, полученные с помощью различных методов (наши данные относятся к продуктам восстановления хромогенных реагентов указанными окислителями)
Соединение CUPRAC АБТС Реактив FRAP Миоглобин ТМБ- АБТС- АБТС-
[15] [5] Фолина [7] [8] АБТС [3] персульфат персульфат периодат
Кверцетин 4,38 2,77 5,17 2,92 4,7±0,1 3,9+0,6 3,2+0,4 3,4+0,2
Аскорбиновая кислота 0,96 1,03 - 1,01 0,99±0,04 0,8+0,1 0,8+0,1 0,9±0,3
Галловая кислота 2,62 3,48 1,23 1,85 0,90±0,03 2,5+0,2 3,0+0,4 -
Длина волны, нм
Рис. 1. Электронные спектры поглощения продуктов окисления ТМБ персульфатом: 1 - синий продукт, 2 - желтый продукт
Время, С
Рис. 2. Кинетические кривые реакции ТМБ-периодат без мочи (1) ив присутствии мочи, разбавленной водой в соотношении 1 : 10 (2),
1 : 5 (3), 1 : 3 (4), 1 : 2 (5) и 1 : 1 (6)
Предлагаемым методом определены значения ТЕАС водных настоев чая (как растения с весьма высокой АОА), а также ромашки и бессмертника (растений, содержание антиоксидантов в которых не столь высоко). При анализе этих объектов потребовались небольшие объемы (микролитры) настоев, причем при высоком разведении (до 1 : 1000 в случае зеленого чая). Так, если в систему вводят разбавленный в 100 раз 1,5% водный настой зеленого чая, поглощение продукта окисления ТМБ уменьшается на 50%. При большем разбавлении (1 : 1000) интенсивность поглощения окрашенного продукта снижается на 20-30%.
В реакции ТМБ - перйодат компоненты растительного сырья вызывают в больших концентрациях замедление, а в меньших - ускорение реакции (рис. 3). Ускорение реакции мы наблюдаем и при введении в систему кверцетина, поэтому ускорение растительными экстрактами может быть связано с присутствием биофлавоноидов. Так или иначе, использование кинетического варианта определения по реакции ТМБ-периодат не позволяет оценивать антиоксидантную активность биофлавоноидов и содержащих их растительных экстрактов. При исследовании АОА растительного сырья следует использовать равновесный вариант этой реакции или ТМБ-персульфат. Введение в систему разбавленных водой (1:10) водных настоев цветков ромашки и бессмертника вызывает уменьшение поглощения окрашенного продукта примерно вдвое (табл. 2).
Показана возможность использования данной методики в тест-варианте. На рисунке 4 приведена шкала окрасок, полученная при проведении реакции ТМБ-периодат на бумаге по методике, описанной в экспериментальной части, в присутствии раствора тролокса различной концентрации. С ее помощью можно различить концентрации антиоксиданта, отличающиеся на порядок (при концентрациях, соответствующих 1-10-4 - 0.003 М тролокса, - на полпорядка).
Таблица 2. Величины ТЕАС растительных экстрактов, измеренные с помощью восстановления продуктов реакций ТМБ-персульфат и АБТС-персульфат/периодат (п = 5, Р = 0,95)
Объект ТМБ АБТС
персульфат персульфат перйодат
Зеленый чай 1,9+0,2 2,6+0,1 3,4+0,2
Черный чай 1,6+0,1 1,8+0,2 2,6+0,3
Цветки ромашки 0,081+0,002 0,09+0,01 0,19+0,01
Цветки бессмертника 0,067+0,003 0,075+0,005 0,159+0,002
Рис. 3. Кинетические кривые восстановления продукта реакции ТМБ-периодат настоем бессмертника (концентрация, г/мл): 1 - 2,5-10-3,
2 - 4,5-Ю-4, 3 - 4,0-10-5, 4 - 3,
•10-
5 - 0 (контрольный образец)
Время, с
Рис. 4. Шкала окрасок для определения количества антиоксидантов по реакции ТМБ-периодат. Приведены концентрации раствора тролокса, М
Выводы
Предложен способ оценки антиоксидантной активности с использованием реакции окисления 3,3',5,5'-тетра-метилбензидина персульфатом и перйодатом в равновесном и кинетическом вариантах с фотометрическим детектированием. Для практических целей удобно применять реакцию восстановления продукта окисления ТМБ персульфатом. По чувствительности методика не уступает известным, в том числе основанным на восстановлении радикала АБТС, и позволяет использовать минимальные объемы (100 мкл) разбавленных растительных экстрактов. Методика проста и экспрессна (на определение требуется 5 мин, на подготовку реагентов - не более 20 мин, в отличие от методики на основе АБТС, где требуется не менее 6 ч). Белки не мешают определению АОА. При определении АОА объектов животного происхождения могут быть использованы и кинетический, и равновесный варианты метода; в случае растительных экстрактов следует применя-ять равновесный вариант. Предложен тест-вариант метода с визуальным наблюдением окраски на фильтровальной бумаге.
Список литературы
1, Childs R.E., Bardsley W,G, The steady state kinetics of peroxidase with 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid) as chromogen // Biochem, J, 1975, N145, Pp, 93-103,
2, Sanchez-Moreno C,, Larrauri J.A., Saura-Calixto F,A, A Procedure to Measure the Antiradical Efficiency of Polyphenols // J, Sci, Food Agric, 1998, N76, Pp, 270-276,
3, Miller N.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V,, Milner A, A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates // Clin, Sci. 1993, N84, Pp. 407-412,
4, Gorinstein S., Caspi A,, Libman I,, Leontowoicz H., Leontowicz, M., Tashma Z., Katrich E., Jastrzebski Z., Trakhtenberg S. Bioactivity of beer and its influence on human metabolism, // Intern, J, Food Sci, Nutr. 2007, N58, Pp. 94-107,
5, Re R., Pellegrini N., Proteggente A,, Pannala A,, Yang M., Rice-Evans C, Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Rad, Biol, Med, 1999, N26, Pp. 1231-1237,
6, Wang C.C., Chu C.Y., Chy K.O., Choy K.W., Khaw K.S., Rogers M.S., Pang C.P. Trolox equivalent antioxidant capacity assay versus oxygen radical absorbance capacity assay in plasma // Clin, Chem, 2004, N50, Pp. 952-954,
7, Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent // Am. J, Enol, Vitic, 1965, N16, Pp. 144-158,
8. Benzie I.F.F., Strain J. J, The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of 'Antioxidant Power': The FRAP Assay // Anal. Biochem. 1996. N239. Pp. 70-76.
9. Cao G.H., Alessio H.M., Cutler R.G. Oxygen Radical Absorbency Capacity Assay for Antioxidants // Free Rad. Biol. Med. 1993. V. 3, N14. Pp. 303-311.
10. Ou B., Huang D., Hampsch-Woodill M., Flanagan J.A., Deemer E.K. Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assays: A Comperative Study // J. Agric. Food Chem. 2002. N50. Pp. 3122-3128.
11. Beklemishev M.K., Stoyan T.A, Dolmanova I.F. Sorption-Catalytic Determination of Manganese Directly on a Paper-Based Chelating Sorbent // Analyst. 1997. V. 122, N10. Pp. 1161-1165.
12. Beklemishev M.K., Stoyan T.A., Dolmanova I.F. Sorption-catalytic determination of cadmium using bromobenzothiazo noncovalently bound to silica and paper // Fres. J. Anal. Chem. 2000. V. 367, N1. Pp. 17-23.
13. Josephy P.D., Eling T., Mason R.P. The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine: Free radical and charge-transfer complex intermediates // J. Biol. Chem. 1982. V. 257, N7. P. 3669.
14. Gomez-Ruiz J.A., Leake D.S., Ames J.M. In vitro antioxidant activity of coffee compounds and their metabolites // J. Agric. Food Chem. 2007. V. 22, N17. P. 6963.
15. Apak R., Guclu K. Comparative evaluation of various total antioxidant capacity assays applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay // Molecules. 2007. N12. Pp. 1496-1547.
16. Bartosz G. Total antioxidant capacity // Adv. Clin. Chem. 2003. V. 37. Pp. 219-292.
Поступило в редакцию 29 марта 2010 г.
После переработки 23 октября 2010 г.
