Определение антиокислительного действия кверцетина и дигидрокверцетина в составе бинарных композиций Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 66.094.38+634.0.86+674.032.14

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КВЕРЦЕТИНА И ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА В СОСТАВЕ БИНАРНЫХ КОМПОЗИЦИЙ

© В.Р. Хайруллина1, Л.Р. Якупова2, А.Я. Герчиков1, Р.Л. Сафиуллин2, А.Н. Терегулова2,

Л.А. Остроухова3, В.А. Бабкин3

1 Башкирский государственный университет, ул. Фрунзе, 32, Уфа (Россия)

E-mail: gerchikov@inbox.ru

2Институт органической химии УНЦ РАН, пр. Октября, 71, Уфа, 450054 (Россия) E-mail: kinetic@anrb.ru

3Иркутский институт химии СО РАН им. А.Е. Фаворского, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) E-mail: babkin@irioch.irk.ru

На примере модельной реакции радикально-цепного окисления 1,4-диоксана изучены антиокислительные свойства флавоноидов дигидрокверцетина (ДКВ) и кверцетина (КВ), выделенных из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb). Определены количественные характеристики антиокислительной активности этих флавоноидов в виде эффективных констант скорости fkIn,. Изучено взаимовлияние КВ и ДКВ в составе бинарных смесей.

Ключевые слова: кверцетин, дигидрокверцетин, антиоксиданты, радикально-цепные реакции, инициированное окисление, константа скорости ингибирования, синергизм.

Работа выполнена при финансовой поддержке аналитической ведомственной целевой программы Министерства образования и науки РФ «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 годы)», проект РНП 2.2.1.1.6332.

Введение

Кверцетин (КВ) и дигидрокверцетин (ДКВ) зарекомендовали себя в качестве ценных биологически активных веществ широкого спектра действия и эффективных малотоксичных антиоксидантов (АО) жиросодержащих пищевых продуктов, лекарственных препаратов и косметических средств [1-8]. Основным источником их является растительное сырье. В настоящее время в России существуют три предприятия промышленного производства ДКВ. Технология его выделения основана на уникальном методе совмещения процессов экстракции комплекса биологически активных веществ древесины Larix sibirica Ledeb. и Larix gmelini Rupr. органическими растворителями и дистилляции экстрактов с последующим отделением примесей [9]. КВ в промышленных масштабах предлагается получать окислением ДКВ сернистокислым натрием в условиях «взрывного» автогидролиза [10]. Получение КВ этим способом представляет собой трудоемкий энергозатратный технологический процесс, в котором выход целевого продукта главным образом зависит как от технологических условий, так и от способа обработки древесины бисульфитом натрия. Высокая степень структурного сходства и близость физико-химических показателей КВ и ДКВ затрудняют получение КВ в чистом виде. В то же время в литературе приведено значительное число примеров, в которых экстракты и вытяжки из лекарственных растений, а также искусственные би- и трикомпонентные смеси полифе-нольных соединений обладают высоким уровнем антиокислительного действия и не уступают по антиокис-лительной активности (АОА) известным синтетическим АО [11-14]. В связи с этим изучение количествен-

* Автор, с которым следует вести переписку.

ных характеристик влияния добавок ДКВ на антиокислительные свойства КВ является актуальной практической задачей, поскольку это позволяет прогнозировать эффективность антиокислительных свойств смеси.

Целью настоящей работы было сравнительное изучение антиокислительного действия химически чистого КВ (КВ:) и промышленно получаемых из древесины Ьагіх і'іЬігіса ЬвёвЬ. ДКВ и КВ (КВп), а также исследование характера взаимовлияния КВ и ДКВ при их совместном присутствии в модельной системе инициированного окисления 1,4-диоксана.

Экспериментальная часть

ДКВ и КВП выделены из ядровой древесины лиственницы сибирской по оригинальным методикам [9, 10], КВ1 предоставлен фирмой «Биомедхим». На основании анализа спектральных характеристик УФ-спектроскопии установлено, что степень чистоты используемых веществ составляет 99% для КВЬ 96,7% для ДКВ, полученного по технологии [9]. КВП, полученный из древесины Ьагіх і'іЬігіса ЬвёвЬ., содержит 60% основного вещества.

КВх марки «ч». ЯМР1Н (300 МГц, (СБ)зСО, м.д., I, Гц): 6,26 (д, 1=2,1, Н-6), 6,50 (д, 1=2,1, Н-8), 6.99 (д, 1=8,5, Н-5’), 7,70 (дд, 1=8,5, 1=2,1, Н-6’), 7,82 (д, 1=2,1, Н-2’).

УФ-спектр (1,4-диоксан, Х^, нм): 365 (^є=4,25).

КВП. ЯМР'Н (300 МГц, (СБ)3СО, м.д., I, Гц): 4,62 (дд, 1=4,0, 1=11,5, Н-3, транс-), 4,72 (д, 1=4,1, Н-3, цис-), 5,03 (д, 1=11,5, Н-2), 5,95 (д, 1=2,0, Н-8), 5,99 (д, 1=2,1, Н-6), 6,26 (д, 1=2,1, Н-6), 6,50 (д, 1=2,1, Н-8), 6,87 (д, 1=8,1, Н-5'), 6,92 (дд, 1=8,2, 1=1,8, Н-6'), 7,07 (д, 1=1,9, Н-2'), 6,99 (д, 1=8,5, Н-5'), 7,70 (дд, 1=8,5, 1=2,1, Н-6'), 7,82 (д, 1=2,1, Н-2').

УФ-спектр (1,4-диоксан, Х^, нм): 365 (^є=4,03).

ДКВ. ЯМР'Н (300 МГц, (СБ)3СО, м.д., I, Гц): 4,62 (дд, 1=4,0, 1=11,5, Н-3, транс-), 4,72 (д, 1=4,1, Н-3, цис-), 5,03 (д, 1=11,5, Н-2), 5,95 (д, 1=2,0, Н-8), 5,99 (д, 1=2,1, Н-6), 6.87 (д, 1=8,1, Н-5'), 6,92 (дд, 1=8,2, 1=1,8, Н-6'), 7,07 (д, 1=1,9, Н-2').

Из сравнения ЯМР:Н -спектров двух образцов КВ видно, что в КВП, помимо сигналов протонов КВ появляются сигналы в области 5,03, 5,99 и 4,62 м.д. Это позволяет заключить, что преобладающим примесным компонентом (около 40%) является ДКВ.

Изучение антиокислительной активности (АОА) исследуемых соединений и бинарных композиций на их основе проводили на примере модельной реакции радикально-цепного окисления 1,4-диоксана (инициатор -азодиизобутиронитрил, скорость инициирования У1 = 1,3-10-7 моль/л^/с). Эффективность ингибирующего действия образцов оценивали по степени снижения начальной скорости поглощения кислорода при окислении модельного субстрата. Подробное описание методики кинетического эксперимента приведено в работе [13]. 1,4-диоксан предварительно очищали по стандартной методике [15]. В качестве количественной характеристики АОА использовали константу скорости обрыва цепи окисления /кы, где / - радикалоемкость

АО, т.е. - число радикальных интермедиатов, погибающих на одной молекуле АО в актах обрыва цепи [1617]. Для сравнения АОА исследуемых веществ использовали ионольный эквивалент (ИЭ), величину которого оценивали в результате сопоставления полученных из эксперимента /кы для исследуемых веществ с аналогичной характеристикой для ионола.

Обсуждение результатов

Поскольку в качестве объектов исследований мы использовали КВ разной степени очистки, было важно определить степень влияния примесей на АОА этих образцов в окисляющемся 1,4-диоксане. Инициированное окисление 1,4-диоксана в условиях эксперимента протекает в кинетическом режиме по радикальноцепному механизму с квадратичным обрывом цепи по реакции (4) и включает общий для большинства органических соединений ряд элементарных стадий [17]:

I ^ 2г^, г• + ИИ ^ гН + Я•; (1)

Я + О2 ЯО2;

(1)

Определение антиокислительного действия кверцетина ... 61

ЯО2 + ЯН ^ ЯООН + Я•; (2)

ЯООН ^ ЯО + НО^; (3)

2ЯО2 ^ ЯООЯ + О2; (4)

ЯО2 + 1пН ^ КООН + 1п•, (5)

где Я• и Я0’2 - алкильные и пероксильные радикалы 1,4-диоксана. Вкладом реакции (3) в инициирование радикально-цепного процесса можно пренебречь, так как мы измеряли начальную скорость окисления, когда К, >> кз^[Я00И ] [17].

Введение в реакционную смесь образцов КВ приводит к снижению начальной скорости окисления модельного субстрата вследствие обрыва цепи на молекулах биофлавоноида по реакции (5) [16]. На рисунках 1-2 приведены зависимости начальной скорости поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана от концентрации добавок исследуемых образцов Кв. Полученные результаты позволяют заключить, что КВ: и КВП эффективно ингибируют процесс инициированного радикально-цепного окисления 1,4-диоксана в интервале концентраций 10-5-10-4 моль/л, и ~ в 1,5 раза отличаются друг от друга по эффективности антиокислительного действия. Так, введение добавок КВ: в окисляющийся 1,4-диоксан при температуре 347 К в интервале концентраций (1,2-7,0)^ 10-4 моль/л приводит к снижению скорости его окисления в 1,5-6,6 раз. Сходное антиокислительное действие в аналогичных условиях эксперимента КВП проявляет в интервале концентраций (1,0-4,0)^10-4 моль/л.

Анализ реакционной способности флавоноидов в качестве антиоксидантов проводили на основании сравнения численных значений удельных характеристик их антиокислительного действия /к1п. Для определения fkIn экспериментальные результаты трансформировали в координатах уравнения (1) [16-17]:

' = Т~ - 7°т = кп. [АО , (1)

' 0 Т 0

где Т00 и Т0 - начальные скорости поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в отсутствии и в присутствии ингибиторов, соответственно, [АО] - концентрация добавки АО, /кПп и 2к4 - константы скорости обрыва цепи окисления на АО и квадратичного обрыва цепи на пероксильных радикалах 1,4-диоксана, соответственно [16-18]. При расчете использовали 2к4 = 6,67 -107 л/моль • с [18].

Как видно из рисунков 1-3, экспериментальные данные в исследованном интервале концентраций добавок АО удовлетворительно линеаризуются в координатах данного уравнения (коэффициент корреляции г=0,98). На основании полученных экспериментальных результатов были найдены эффективные константы скорости ингибирования /кы, значения которых приведены в таблице.

Кинетические характеристики антиокислительной активности исследованных объектов

Антиоксидант Т, К ікїп-10'4, л-(моль-с)'1 * ИЭ

КВ1 333 3,60±0,10 1,9

КВП 5,80±0,30 3,0

КВ1+ДКВ (доля ДКВ 22%) 6,10±0,40 3,2

ДКв 5,40±0,20 2,8

Ионол 0,70±0,05 1,0

КВ1 347 6,10±0,20 2,2

КВ її 15,00±1,00 5,4

ДКВ 17,00±1,00 8,6

Ионол 1,00±0,100 1,0

* При расчете принимали 2к4 = 6,7-107 л-(моль-с)'1 [18].

Для сравнения эффективности антиокислительного действия этих веществ в этой же таблице приведены значения ионольных эквивалентов, вычисленные по формуле (2):

Из таблицы видно, что среди изученных нами веществ наибольшую АОА по отношению к пероксильным радикалам 1,4-диоксана проявляет КВП, при этом все исследованные нами флавоноиды по АОА значительно превосходят стандартный ингибитор ионол.

Основным сопутствующим компонентом в КВП является ДКВ. Этот флавоноид зарекомендовал себя в качестве эффективного АО в различных модельных системах [1-8, 19-21]. Для установления механизма влияния ДКВ на АОА КВ нами были изучены двухкомпонентные системы на основе КВ: и ДКВ, в которых содержание каждого из компонентов варьировалось в интервале 0-100%. На рисунке 4 приведена зависимость начальной скорости окисления 1,4-диоксана от содержания ДКВ в бинарных смесях КВ: и ДКВ. Как следует из полученных данных (рис. 4), двухкомпонентные композиции на основе КВ и ДКВ при любых соотношениях компонентов по эффективности антиокислительного действия превосходят индивидуальные вещества, изученные при том же содержании в модельной системе. Вместе с тем, максимальный ингибирующий эффект наблюдается в смеси, содержащей 22% примеси ДКВ. Скорость ингибированного окисления при этом соотношении КВ: и ДКВ в смеси снижается в 2 раза, что свидетельствует о синергическом эффекте.

Для более детального изучения наблюдаемого экспериментального факта была поставлена серия опытов по изучению зависимости скорости ингибированного окисления 1,4-диоксана от концентрации двухкомпонентной смеси с содержанием ДКВ 22 %. На основании обработки данных экспериментов в рамках соотношения (1) определено значение эффективной константы скорости ингибирования для этой композиции. Сравнение значений параметра ингибирования Б для смеси с аналогичной характеристикой для КВ и ДКВ высокой степени очистки позволяет заключить, что бинарная композиция с содержанием ДКВ 22% во всем исследованном диапазоне концентраций превосходит индивидуальные вещества по эффективности торможения окисления 1,4-диоксана. Как следствие, эта смесь характеризуется максимальным значением эффективной константы скорости ингибирования ]кПп.

У„-106, моль-/л-с

2,5

2,0 -

347К.

1,5 ■

к. \о

1,0 •

1 333К

0,5

0,0 С

У„-10 , моль-/л-с

347К

[КВ:]-104, моль/л

- 8

- 6

- 4

- 2

Рис. 1. Зависимость скорости поглощения кислорода (1,2) и параметра Б (3,4) от концентрации КВ при 333 и 347 К;

V = 1,3 •Ю-7 моль/л-с

Рис. 2. Зависимость начальной скорости поглощения кислорода (1,2) и параметра Б (3,4) от концентрации КВП при 333 и 347 К;

V = 1,3-10-7 моль/л-с

Б

4

3

2

0

0

0

2

[AQ]-104, моль/л

Рис. 3. Зависимость скорости поглощения кислорода и параметра Б от концентрации исследуемых веществ.Т=333 , V =1,3-10-7 моль/л-с

V0-106,MiMb/n*c

дкв,%

Рис. 4. Зависимость скорости ингибированного окисления 1,4-диоксана от состава бинарных композиций на основе КВ1 и ДКВ, Т=333 К,

VI =1,3-10-7 моль/л-с

Заключение

Таким образом, изученные нами эффективные антиоксиданты КВ1 и ДКВ в составе двухкомпонентных смесей обнаруживают синергический эффект антиокислительного действия. Максимальной АОА характеризуется бинарная смесь, содержащая 22% ДКВ. Результаты настоящих исследований позволяют предсказать оптимальный состав пищевых стабилизаторов на основе КВ и ДКВ и могут быть полезны при разработке новых БАД к пище, направленных на коррекцию антиоксидантного статуса организма.

Список литературы

1. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Природные флавоноиды как биологические антиоксиданты и биологически активные добавки // Вопросы питания. 1996. №2. С. 33.

2. Теселкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., Клебанов Г.И., Тюкавкина Н.А. Антиоксидантные свойства ди-гидрокверцетина // Биофизика. 1996. Т. 41. №3. C. 621-624 .

3. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А. Дигидрокверцетин - новая антиоксидантная и биологически активная добавка // Вопросы питания. 1997. №6. С. 12-15.

4. Miura S., Watanable J., Tomita T., Sano M., Tomita I. The inhibitory effects of tea polyphenols (flavan-3-ol derivatives) on Cu2+ mediated oxidative modification of density lipoprotein // Biol. Pharm.Bull. 1994. V. 17. №12. P. 1567-1572.

5. Бурлакова Е.Б., Мазалецкая Л.И., Шелудченко Н.И., Шишкина Л.Н. Ингибирующее действие смесей фенольных антиоксидантов и фосфатидилхолина // Известия АН. Серия химическая. 1995. №6. C. 1053-1059.

6. Saija A., Scalese M., Lanza M., Marzullo D., Bonina F., Castelli F. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes // Free Radical Biology and Medicine. 1995. V. 19. №4. P. 481-486.

7. Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds // Trends in Plant Science. 1997. V. 2. №4. P. 152-159.

8. Burda S., Qleszek W. Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. №6. P. 2774-2779.

9. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Малков Ю.А., Иванова С.З. и др. Ресурсосберегающая и экологически безопасная переработка древесины и коры лиственницы // Наука - производству. 2004. №1. С. 52-58.

10. Кузнецов Б.Н., Левданский В.А., Кузнецова С.А., Полежаева Н.И., Левданский А.В. Получение кверцетина из древесины лиственницы сибирской в условиях «взрывного» автогидролиза в присутствии сернистокислого натрия // Химия растительного сырья. 2003. №4. С. 37-41.

11. Гарифуллина Г.Г., Денисова С.Б., Хайруллина В.Р., Герчиков А.Я. Выделение фенольных соединений корня солодки голой и оценка их антиоксидантной активности // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2003. Т. 46. Вып. 7. С. 102-106.

12. Хайруллина В.Р., Гарифуллина Г.Г., Герчиков А.Я. Изучение ингибирующей эффективности экстрактов растений сем. Geraniaceae, Rosaceae на примере модельной реакции окисления изопропилового спирта // Химикофармацевтический журнал. 2005. Т. 39. №3. С. 103-105.

13. Хайруллина В.Р., Гарифуллина Г.Г., Герчиков А.Я., Остроухова Л.А., Бабкин В.А. Количественное изучение анти-окислительной активности этилацетатного экстракта коры лиственницы сибирской и отдельных его компонентов // Химия природных соединений. 2006. №2. С. 131.

14. Гарифуллина Г.Г., Ишмуратова М.М., Фахрутдинова Е.И., Герчиков Г.Г. Антиокислительная активность экстрактов из корневищ и корней Rhodiola Rosea L. и R. Iremelica Boriss. // Растительные ресурсы. 1998. T. 34. №3. C. 69-73.

15. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. 542 c.

16. Денисов Е.Т., Мицкевич Н.И., Агабеков В.Е. Механизм жидкофазного окисления кислородсодержащих соединений. Минск, 1975. 335 c.

17. Денисов Е.Т., Азатян В.В. Ингибирование цепных реакций. Черноголовка, 1997. 268 с.

18. Denisov E.T., Afanas'ev I.B. Oxidation and Antioxidants in Organic Chemistry and Biology.// Taylor and Francis, Boca Raton. 2005. 982 p.

19. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Иванова С.З., Иванова Н.В. и др. Продукты глубокой химической переработки биомассы лиственницы. Технология получения и перспективы использования // Российский химический журнал. 2004. Т. XLIII. №3. С. 62-69.

20. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Остроухова Л.А. и др. Флавоноидные соединения коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2002. №4. С. 5-13.

21. Захарова Н.А., Богданов Г.Н., Запрометов М.Н., Тюкавкина Н.А. и др. Антирадикальная активность некоторых природных флавоноидных соединений // Журнал общей химии. 1972. Т. 42. №6. С. 1220-1414.

Поступило в редакцию 17 марта 2008 г.