CC BY
62. На основе рекомбинантного антигена чувствительность разработанного теста p65 разработана иммуноферментная тест- относительно коммерческого набора «My-система для определения антител к M. hyo- coplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» pneumoniae в сыворотках крови свиней. (IDEXX, США) составляет 95,6% и 96,7%,
3. Установлено, что специфичность и соответственно. РЕЗЮМЕ
Экспрессией в Е. coli получен рекомбинантный белок р65 Mycoplasma hyopneumoniae. На основе рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к M. hyopneumoniae в сыворотках крови свиней. Установлена очень хорошая согласованность (k=0,97) разработанной тест-системы и коммерческого набора «Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit» (IDEXX, США).
ABSTRACT
Mycoplasma hyopneumoniae recombinant p65 protein was prepared by expression in E. coli. Indirect enzyme immunoassay has been developed on the basis of recombinant antigen, for the detection of antibodies to M. hyopneumoniae in porcine blood sera. Very good consistency (k=0.97) has been established between the developed test-system and commercial test kit "Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit" (IDEXX, USA).
Литература
1. О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчи-кова и др. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК // Биохимия. 1996. Т. 21, № 6. С. 1064-1070.
2. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 399 с.
3. S.N. Done. Enzootic pneumonia (mycoplasmosis) revisited // Pig J. 1996. V 38. P. 40-61.
4. K. Cheikh, IF Shareck, S. Dea. Monoclonal antibodies
to Escherichia coli — expressed p46 and p65 membraneous proteins for specific immunodetection of Mycoplasma hyopneumoniae in lungs of infected pigs // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. V 10, № 3. P. 459-468.
5. EC Minion, E.J. Lefkowitz, M.L. Madsen et al. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis // J. Bacteriol. 2004. V 186, № 21. P. 7123-7133.
6. E.L. Tracher. Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae // Anim. Health Res. Rev. 2004. V 5. P 317-320.
УДК 619:616.98:579. 843. 95:578.74:616 - 097:470 О.И. Ручнова, О.В. Прунтова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОГО РОДСТВА ИЗОЛЯТОВ PASTEURELLA МиЕГОСГОА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Введение
Пастереллезы — остро и хронически протекающие инфекционные болезни сельскохозяйственных животных и птиц. Широко распространены во всех странах мира. Экономический ущерб особенно велик при остром течении болезни, когда проводят вынужденный убой больных животных [1].
Pasteurella multocida является наиболее важным патогенным видом рода Pas-teureUa, который имеет широкий круг хозяев, включая большинство млекопитающих, птиц, а также человека. Этот микроорганизм является возбудителем геморрагической септицемии животных (серова-риант В6), холеры птиц (серовариант А1 и А3), а также легочных пастереллезов (се-рогруппы А и Д), осложняющих респира-
торные инфекции вирусной и микоплаз-менной этиологии [2].
Основным звеном в системе мер борьбы с этим заболеванием является специфическая профилактика. Но для того, чтобы вакцины против пастереллеза были эффективны, в их состав должны входить те сероварианты пастерелл, которые вызывают вспышку заболевания.
Установлено, что антигенная структура пастерелл сложна и включает капсуль-ный и соматический антигены. По современной классификации представители вида P multocida подразделяются на 5 кап-сульных серогрупп (А, В, D, Е и F) и 16 се-ровариантов по соматическому антигену (с 1 по 16) [1]. В настоящее время бульшая часть референтных штаммов различных серовариантов пастерелл находится толь-
ко в коллекциях некоторых зарубежных лабораторий и исследователей и не доступны для приобретения. Коммерческие диа-гностикумы для идентификации пастерелл в РФ, как и в большинстве стран мира, не производятся.
Целью данной работы было изучение изолятов Р. тиМосМа типов А, В и Д по кап-сульному антигену, выделенных из патологического материала от свиней различного возраста и молодняка крупного рогатого скота на территории РФ, в перекрестной реакции агглютинации (РА) для выяснения их родства или различия по соматическому антигену с референтными штаммами.
Учитывая, что основная роль в данной патологии животных принадлежит серова-риантам А1, А3, А4, В6 и Д3, определение степени антигенного родства проводили относительно штаммов Р. тиЫоайа именно этих серовариантов.
Материалы и методы
В работе использовали следующие референтные штаммы Pasteurella тиЫосМа, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС): Р. multocida А1 № 11039, Р. multocida А3 № 15742 и референтные штаммы, полученные из коллекции ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»: Р. multocida А1 № 115; Р multocida А3 № 1231; Р multocida А4 № ВК-3; Ешикойёа В6 № 656; Р. multocida Д3 № 9.
8 изолятов бактерий РМ-1...РМ-8 были выделены из патологического материала от свиней и молодняка крупного рогатого скота в лаборатории микробиологии ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Выделенные бактерии были идентифицированы по биохимическим свойствам как Pasteurella multocida и серо-типированы по капсульному антигену.
Бактерии культивировали на твердой питательной среде, приготовленной на основе мясного перевара по Хоттингеру с добавлением 10% экстракта эритроцитов лошади, в термостате при 37° С в течение 18 ч. Морфологию бактерий изучали в фиксированных мазках, окрашенных по Гра-му.
О-антигены изолятов и штаммов получали по традиционной методике [3]. Сыворотки были изготовлены в лаборатории микробиологии ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по схеме Картера [3].
Серотипирование штаммов по соматическому антигену проводили в реакции аг-
глютинации (РА) в полистироловых планшетах по традиционной методике [3] с гомологичными и гетерологичными гипериммунными сыворотками крови кролика.
Степень антигенного родства изолятов и референтных штаммов Р. multocida серо-групп А, В и Д определяли по соматическому антигену и рассчитывали по формуле Архетти и Хорсфала [5].
титр S : АГ
___ станд. испыт.
1 титр S : АГ
станд. станд.
титр S
испыт. АГ станд. испыт. станд.
испыт. АГ испыт. испыт. испыт.
2 титр S]
R% =100 Уг1 г2, где: титр S : АГ — средний геометри-
^ станд. испыт. ^ ^ ^
ческий титр сыворотки крови кролика, полученный на референтный штамм с антигеном из испытуемого штамма; титр S
' ^ станд.
: АГ — средний геометрический титр
станд. ^ ^ ^ ^
сыворотки крови кролика, полученный на референтный штамм с антигеном из референтного штамма; титр S : АГ —
т ^ ' ^ испыт станд.
средний геометрический титр сыворотки крови кролика, полученный на испытуемый штамм с антигеном из референтного
штамма; титр S : АГ — средний гео' ^ испыт испыт. ^ ^
метрический титр сыворотки крови кролика, полученный на испытуемый штамм с антигеном из испытуемого штамма; г1 и г2 - коэффициенты одностороннего антигенного родства; R% — коэффициент двустороннего антигенного родства штаммов.
Для определения степени родства проводили перекрестное титрование сывороток сравниваемых штаммов с гомологичными и испытуемыми антигенами с вычислением одностороннего гг Также имея гипериммунную сыворотку крови кроликов, полученную на испытуемый штамм, определили значение г2 [4]. При R>75% штамм относили к одному сероварианту [4]. Результаты исследования Гипериммунные сыворотки крови кролика и О-антигены были получены на все испытуемые изоляты и референтные штаммы.
Результаты расчета коэффициента двустороннего родства представлены на диаграмме (рис. 1).
Как видно из диаграммы, у изолята «РМ-5» коэффициент двустороннего родства равен 98,5% с референтным штаммом № 11039, что свидетельствует о принадлежности этого изолята к сероварианту А1.
У изолята «РМ-3» коэффициент родства был равен 87,3% с референтным штам-
1-1ПЭ9 1231 15742 В к-З 650
№ [и.!' ||1.;|.и.!н I:.1 и 1г1г. г.НгЗ
Рисунок 1. Степень антигенного родства (R,%) изолятов и референтных штаммов бактерии Рав!еи-ге11а шикиск!; (п=3)
мом №656, что показывает на принадлеж-
ность этого изолята к сероварианту В6.
Коэффициент двустороннего родства изолята «РМ-4» с референтным штаммом №15742 составляет 82,5%. Это свидетельствует о принадлежности данного изолята к сероварианту А3.
При расчете коэффициента двустороннего родства изолятов «РМ-1», «РМ-7» и «РМ-8» наивысшее значение ^=96,7%>, R=92% и R=80%, соответственно) было отмечено с референтным штаммом №9. Исходя из полученных данных, видно, что эти изоляты принадлежат к серовариан-ту Д3.
Изоляты «РМ-2» и «РМ-6», принадлежащие к серогруппе А по капсульному
антигену, не являются родственными по соматическому антигену референтным штаммам, т.к. коэффициенты двустороннего родства не превышают 75%.
Заключение Исследуемые изоляты Ра81еиге11а ти1-Шаёа, выделенные от свиней и молодняка крупного рогатого скота на территории РФ, принадлежали к серогруппам А, В и Д по капсульному антигену. По соматическому антигену 3 из них — «РМ-1», «РМ-7», «РМ-8» были отнесены к сероварианту Д3, «РМ-3» — к сероварианту В6, «РМ-5» — к сероварианту А1 и «РМ-4» — к серова-рианту А3. 2 изолята («РМ-2» и «РМ-6») не были родственны использованным в данной работе референтным штаммам.
РЕЗЮМЕ
В работе представлены результаты опытов по определению серо »вариантной принадлежности изолятов бактерии Pasteurella multocida в сравнении с референтными штаммами. Коэффициенты одностороннего и двустороннего родства рассчитывали по формуле Архетти и Хорсфала. Авторы установили, что 3 исследуемых изолята P. multocida по соматическому антигену можно отнести к сероварианту Д3, 1 - к сероварианту В6, 1 - к сероварианту А1, 1 - к сероварианту А3. 2 изолята отличались от референтных штаммов, использованных в данной работе.
ABSTRACT
The Pasturella multocida isolates classification by sero-variants as compared to the reference strains was carried out. The results of the investigation are shown. The unilateral and bilateral relatedness was estimated according to the formula derived by Archetti and Horsfall. Three investigated P. multicida isolates were classified as D3 sero-variant according to the somatic antigen, one was determined as sero-variant B6, one was classified as sero-variant A1, one was identified as sero-variant A3. Two isolates were different from the reference strains used.
Литература
1. Р.В. Душук, Э.В. Романенко, Е.К. Шапошникова, 3. Методы общей бактериологии: в 3-х т.-М.: Мир,
Л.М. Шапошникова. Антигенная характеристика Ра81еиге11а тикоаёа и эпизоотическая значимость сероваров // ЖМЭИ. 1998. № 3. С. 108-112. 2. РВ. Душук. Болезни, вызываемые пастереллами. Пастереллезы // Инфекционные болезни животных: справочник / ред. Д.Ф.Осидзе. М., 1987 С. 188-194.
1983. Т. 1. 536 с.
4 Ю.А. Черняев, А.И. Собко. Определение соответствия эпизоотических штаммов вируса ящура производственным // Ветеринария. 1973. № 1. С. 43-46.
5. J. Archetti, EL. Horsfall. Persistent antigenic variation of influenza // J. Exp. Med. 1950. V 92. P. 441.
