CC BY
40
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ________________________________2009, том 52, №10___________________________
БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577.1
Ш.А.Эсаналиева, М.А.Бабаджанова, член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев , Б.А.Солиева ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ РИБУЛОЗОЯЯСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЬЯХ РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРОДУКТИВНОСТИ ФОРМ ХЛОПЧАТНИКА
К настоящему времени получено большое количество экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что в метаболизме клетки одним из ведущих регуляторных механизмов является образование и функционирование ферментных надмолекулярных комплексов [1-5].
Для того, чтобы показать, что мультиферментные комплексы существуют т \1\о в неочищенных хлоропластных экстрактах, не имеют артефактного происхождения, не образуются в процессе выделения и очистки, был проведён имунноблот-анализ. Анализ показал, что ферменты цикла Кальвина в неочищенных хлоропластных экстрактах образуют мульти-ферментные комплексы в самых разнообразных сочетаниях. Кроме того, антитела реагировали со «своими» ферментами и в мультиферментном комплексе, выделенном при нативном ПААГ-электрофорезе [5,6].
Целью данной работы являлось одновременное получение экстрактов из листьев четырёх генотипов хлопчатника, различающихся по продуктивности, и определение в них ри-булозобисфосфаткарбоксилазной активности мультиферментных комплексов в онтогенезе растений.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили контрастные по показателям фотосинтеза и морфобиологическим характеристикам листья хлопчатника (Ооззуртт Ыг8Шит Ь.) сорта 108-Ф и инбредные линии Л-3, Л-461, Л-601 из генетической коллекции Ташкентского государственного университета им. Улугбека, любезно предоставленные нам академиком АН Республики Узбекистан Д.А.Мусаевым и профессором М.Ф.Абзаловым.
Растения выращивали в полевых условиях с выполнением общепринятых агротехнических мероприятий на экспериментальном участке Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан (г. Душанбе).
Получение экстрактов из листьев. Для получения экстракта из листьев использовали наиболее фотосинтетически активные листья - 3-4-ый сверху (15-25-дневного возраста), взя-
тые в фазах развития растений: массовая бутонизация, массовое плодообразование, начало созревания коробочек.
Листья были промыты дистиллированной водой, высушены фильтровальной бумагой, затем их выдерживали в холодильнике при температуре -5оС в течение 30 мин. Из охлаждённых листьев выбивались высечки сверлом, затем высечки охлаждались до 0оС. Навеску высечек измельчали и гомогенизировали в охлаждённой фарфоровой ступке с 0.1М Трис -НС1- буфера, pH 8.5, содержащего 0.2 М ШСЬ, 0.01 М М§С12, 0.0005 М ЭДТА,0.01 М №НС03, 0.01 М дитиотрейтол (ДТТ) и 1% поливинилпирролидон, 25000. Листья и буфер брали в соотношении 1:2. Полученный гомогенат отжимали через капроновую ткань, измеряли объём и pH, затем центрифугировали в течение 30 мин. при 15000 об./мин на центрифуге марки К-24 с охлаждением. Супернатант использовали для определения количественного содержания водорастворимых белков и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности.
Количественное определение белка определяли с реактивом Бенедикта по методике, описанной Г.А.Кочетовым [8]. Измерения велись на спектрофотометре иШЮБРЕС II (ЬКВ, Швеция) с полной шкалой от 0 до 0.001 единицы экстинции. Калибровочный график построен по бычьему сывороточному альбумину.
Определение карбоксилазной активности рибулозобисфосфат-карбоксилазы/окси-геназы (РБФК/О). РБФ - карбоксилазную активность определяли спектрофотометрическим методом [9]. В качестве субстрата использовали рибозо-5-фосфат + АТФ, так как он является первым субстратом метаболической последовательности, состоящей из пяти ферментов: ри-бозофосфатизомеразы, фосфорибулокиназы, рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, фосфоглицераткиназы, глицеральдегидфосфатдегидрогеназы образующих мультифермент-ный комплекс с молекулярной массой 520 кД [5,6].
Результаты и их обсуждение
В табл.1 представлены результаты определения содержания водорастворимых белков в экстрактах из листьев различных генотипов хлопчатника в онтогенезе растений.
Таблица 1
Содержание водорастворимых белков в экстрактах из листьев различных генотипов хлопчатника
Сорт, линия Массовая бутонизация Массовое плодообразование Начало созревания коробочек
мг/г сырого веса мг/дм2 площади листа мг/г сырого веса мг/дм2 площади листа мг/г сырого веса мг/дм2 площади листа
108-Ф 42.36±0.60 162.93±2.34 57.00±0.91 293.80±3.72 63.08±0.95 220.54±3.38
Л-461 66.80 ± 1.0 228.63±3.42 84.82±1.34 337.11±5.14 108.46±1.58 366.41±5.21
Л-3 46.08±0.67 152.17±2.25 58.30±0.88 211.92±3.19 85.45±1.21 260.51±4.04
Л-601 62.72±0.93 193.58±2.91 61.60±0.95 251.73±3.73 70.34±1.12 229.89±3.51
Из представленных в табл. 1 данных видно, что четыре генотипа хлопчатника различались между собой по содержанию водорастворимых белков в экстрактах из листьев на всех фазах развития растений, причём линия Л-461 всегда превосходила три остальные генотипа.
В фазах бутонизации и плодообразования растений хлопчатника сорта 108-Ф и линии Л-3 почти не различались между собой по содержанию водорастворимых белков. В фазе же созревания коробочек линия Л-3 превосходила сорт 108-Ф по содержанию белка в расчёте на г сырого веса листьев на 35%, а в расчёте на дм площади листа - на 18%. Линия Л-601 в фазе бутонизации и плодообразования растений превосходила по содержанию водорастворимых белков линию Л-3 и сорт 108-Ф. В фазе созревания коробочек линия Л-601 и сорт 108-Ф не различались между собой по содержанию белков. Линия Л-3 превосходила линию Л-601 на 13%.
В табл. 2 представлены результаты определения РБФ-карбоксилазной активности мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев четырёх генотипов хлопчатника в онтогенезе растений.
Таблица 2
Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса в экстрактах
из листьев различных генотипов хлопчатника (субстрат: рибозо-5-фосфат + АТФ)
Сорт, линия Массовая бутонизация Массовое плодообразование Начало созревания коробочек
Активность РБФК, мкмоль С02 /мин на:
мг белка 2 дм площади мг белка 2 дм площади мг белка 2 дм площади
108-Ф 0.044±0.002 7.13±0.11 0.033±0.001 7.91±0.12 0.021±0.002 4.63±0.07
Л-461 0.056±0.002 12.8±0.22 0.028±0.002 9.44±0.14 0.026±0.003 8.13±0.12
Л-3 0.042±0.003 6.96±0.12 0.040±0.003 8.47±0.13 0.025±0.001 6.64±0.11
Л-601 0.054±0.001 10.4±0.28 0.033±0.002 8.31±0.12 0.037±0.001 8.50±0.13
Из представленных в табл. 2 данных видно, что в фазе бутонизации по удельной РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов генотипы хлопчатника можно разделить на две группы: первая - сорт 108-Ф и линия Л-3, вторая - линии Л-461 и Л-601. Линии Л-461 и Л-601 превосходили по удельной РБФ-карбоксилазной активности мультиферментного комплекса сорт 108-Ф и линию Л-3 на 28%.
В сравнении с фазой бутонизации в фазе плодоношения удельная РБФ-карбоксилазная активность мультиферментных комплексов снизилась у всех генотипов хлопчатника, кроме линии Л-3. Следует отметить, что наиболее резкое снижение - в 2 раза произошло у линии Л-461, а у сорта 108-Ф и линии Л-601 - на 25%.
В сравнении с фазой плодообразования в фазе созревания коробочек удельная РБФ-карбоксилазная активность мультиферментного комплекса в экстрактах из листьев линии
Л-601 возросла на 12%, линии Л-461 - не изменилась, линии Л-3 и сорта 108-Ф - снизилась на 37%.
Интегральным показателем многих физиолого-биохимических процессов, в том числе изменений содержания и удельной активности ферментов, является фотосинтетическая активность единицы площади листа [10,11]. Поэтому необходимо было изучить онтогенетические изменения РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов в расчёте на единицу площади листа.
Из представленных в табл. 2 данных видно, что в фазе бутонизации по РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов линия Л-461 значительно превосходила все три генотипа хлопчатника: линию Л-3 в два раза, сорт 108-Ф - на 44%, линию Л-601 - на 22%.
В сравнении с фазой бутонизации в фазе плодообразования РБФ-карбоксилазная активность мультиферментных комплексов двух генотипов хлопчатника снизилась: у линии Л-461 - на 26%, линии Л-601 - на 20%, линия Л-3 - возросла на 20%, сорта 108-Ф - на 11%. При сравнении генотипов хлопчатника между собой по РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов линия Л-461 превосходила все остальные: сорт 108-Ф на 19%, линии Л-3 и Л-601 на 12%.
В сравнении с фазой плодообразования в фазе созревания коробочек РБФ-карбоксилазная активность мультиферментных комплексов оставалась на прежнем уровне у линии Л-601, а у трёх остальных генотипов хлопчатника снизилась: у сорта 108-Ф - на 41%, линии Л-3-на 22%, линии Л-461 - на 16%. При сравнении генотипов хлопчатника между собой величина РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов у линии Л-461 и Л-601 была почти одинаковой, у линии Л-3 и сорта 108-Ф значительно ниже - на 22% и 76% соответственно.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о специфических для каждого генотипа онтогенетических изменениях РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов.
Фаза массовой бутонизации хлопчатника наступила в 2009 г. в конце июля, массового плодообразования - в конце августа, а начала созревания коробочек - в сентябре. За этот период времени произошло постепенное снижение температуры окружающей среды. Известно [12,13 ], что особенно чувствительны к изменениям температуры ферменты, лимитирующие скорость ключевых процессов метаболизма, таких, например, как фотосинтез и дыхание. Поэтому нами были сопоставлены данные об онтогенетических изменениях РБФ-карбоксилазной активности мультиферментных комплексов температуры воздуха и освещённости за 3-5 суток до выделения экстрактов из листьев.
По данным Гидрометеослужбы, в августе отмечено постепенное снижение температуры. Кроме того, резко была снижена освещённость из-за пыльной бури («афганец»). Снижение температуры и освещённости в период массового плодообразования привело к значительному увеличению (в 1.5 раза) содержания водорастворимых белков у всех четырёх генотипов хлопчатника. РБФ-карбоксилазная активность мультиферментных комплексов снизилась у всех генотипов, кроме линии Л-3.
Несмотря на значительное снижение температуры и освещённости в период начала созревания коробочек в сравнении с фазой плодообразования, РБФ-карбоксилазная активность мультиферментных комплексов в экстрактах из листьев линий Л-461 и Л-601 осталась почти на прежнем уровне, а у сорта 108-Ф и линии Л-3 снизилась.
Полученные результаты дают основание считать, что ферментная система ключевой стадии темновой фазы фотосинтеза у линии Л-461 и Л-601 лучше адаптируется, более устойчива к продолжительному действию положительных пониженных температур и освещённости. У этих линий влияние пониженных температур и освещённости компенсируется двумя путями - снижением в определённых пределах каталитической активности ферментов и увеличением содержания ферментов.
Таджикский национальный университет, Поступило 21.09.2009 г.
H«
Институт физиологии и генетики АН Республики Таджикистан
ЛИТЕРАТУРА
1. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. - М.:Мир, 1986, 374 с.
2. Курганов Б.И., Любарев А.Е. - Биохимия, 1991, т. 56, вып.1, с. 19-32.
3. Ермаков Г.Л. - Биохимия 1993, т. 58, вып.5, с.659-674
4. Романова А.К., Павловец В.В - Физиология растений 1997, т. 44, с. 264-274.
5. Gontero B. - Ann. Plant. Reviews. - 2002, v. 7, p. 120-150.
6. М.П. Бабаджанова, М.А. Бабаджанова, К.А. Алиев - Физиология растений 1997, т.53, № 1, с. 3844.
7. Suss K.-H., Arcona C. - Proc.Natl.Acad.Sci. USA. - 1993, - v.90, p.5514-5518.
8. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М.: Высш., 1980, 272 с.
9. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. - М.: Наука, 1980, 158 с.
10. Мокроносов.А.Т. Онтогенетический аспект фотосинтеза. - М.: 1981, 196 с.
11. Мокроносов.А.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма. 42-е Те-мирязевское чтение. - М.: 1983, 64 с.
12. Кузнецов В.В., Дмитрева Г.А. Физиология растений. - Изд. 2-е, М.: Высшая школа, 2006, 742 с.
13. Ермаков И.П. Физиология растений. - Изд. 2-е, М.: 2007, 656 с.
Ш.А.Эсаналиева, М.А.Бабаджанова, К.А.Алиев, Б.А.Солиева ТАГЙИРЁБИИ ФАЪОЛНОКИИ РИБУЛОЗОБЖФОСФАТКАРБОКСИЛАЗИИ МА^МУА^ОИ МУЛТИФЕРМЕНТИИ ДАВРИ КАЛВИН ДАР ОНТОГЕНЕЗИ ЛАЙЩОИ АЗ ЧИТАТИ ^ОСИЛНОКЙ ТАФОВУТДОШТАИ
Муайян карда шудааст, ки 4 генотипи растании пахта байни хамдигар аз руи тагйиротхои онтогенетикии микдори сафедахои дар об халшаванда ва фаъолнокии РБФ-карбоксилазии мачмуахои мултиферментй фаркият доранд. Мутобикшавии лайнхои хосилнок Л-461 ва Л-601 ба таъсири дарозмуддати хароратхои паст ва равшанй дар асоси паст гардидани фаъолнокии каталитикии ферментно, доираи меъёри физиологй ва зиёдшавии микдори онхо дар хучайра ба амал меояд.
Sh.Esanalieva, M.A.Babadzhanova, K.A.Aliev, B.A.Solieva ONTOGENETIC CHANGES OF RIBULOSOfi/VPHOSPHATCARBOXILASE ACTIVITY OF MULTI ENZYME COMPLEXES OF CALVIN CYCLE OF THE
LEAVES ОF THE DIFFERING ON EFFICIENCY FORMS OF COTTON
It is established, that contrast on parameters of photosynthesis and morpho-biological characteristics leaves of four genotypes of a cotton differed on ontogenetic changes of the contents of water-soluble proteins and ribulosoè/sphosphatecarboxilase activity of multienzyme complexes. Adaptation of the productive lines L-461 and L-601 to long impact of the positive lowered temperatures and light exposure have occurred due to decrease of catalytic activity of enzymes within the limits of physiological norm and increasing of their contents in a cell.
