CC BY
23ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС И АПОПТОЗ В ТИМУСЕ КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И ВВЕДЕНИИ АНТИОКСИДАНТОВ
Рожкова И.С.
доцент, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологии и ботаники, г. Астрахань Астраханский государственный медицинский университет
Минздрава России
Фельдман Б.В.
доцент, доктор биологических наук, зав. кафедрой биологии и ботаники, г. Астрахань Астраханский государственный медицинский университет
Минздрава России
OXIDATIVE STRESS AND APOPTOSIS IN TIMUS OF RATS AT CHRONIC INTOXICATION AND INTRODUCTION ANTIOXIDANTS
Rozkova I.S. associate professor, candidate of medical sciences associate professor of biology and botany, Astrakhan Astrakhan state medical university of the Ministry of health of Russia
Feldman B.V. Doctor of biology, associate professor head of the department of biology and botany Astrakhan state medical university of the Ministry of health of Russia
АННОТАЦИЯ
Изучено состояние свободно-радикальных процессов в тимусе белых крыс - самцов в постнатальном онтогенезе в условиях хронической интоксикации и введении комплекса антиоксидантов. Раскрыты возрастные особенности скорости перекисного окисления липидов и апоптотических изменений вилочковой железы в норме, при хроническом воздействии серосодержащего природного газа и введении витамина Е и тималина. Проведено сравнение динамики уровня свободно-радикальных процессов в гомогенатах тканей крыс на различных этапах онтогенеза при хроническом воздействии серосодержащего природного газа и действии комплекса антиоксидантов. Установлено, что полученные экспериментальные данные свидетельствуют о снижении устойчивости ткани тимуса с возрастом и об истощении антиоксидантной системы при хронической интоксикации. Эксперименты показали, что введение комплекса антиоксидантов восстанавливает ослабленную функцию, приводя к снижению уровня свободнорадикальных процессов и апоптоза во всех возрастных группах, но с более выраженным эффектом у старых животных.
ABSTRACT
The condition of free radical processes in a thymus of white rats - males in po^natal ontogenesis in the conditions of chronic intoxication and introduc-tion of a complex of antioxidants is Sudied. Disclosed age features rate of lipid peroxidation and apoptotic changes in the normal thymus, chronic exposure to sulfur-containing natural gas and the introduction of vitamin E and thymalin. A comparison of the dynamics of the level of free radical processes in the tis-sue homogenates of rats at different Sages of ontogenesis of chronic exposure to sulfur in the natural gas and the complex action of antioxidants. It was found that the experimental data show a decrease in the lability of the tissue of the thymus with age and the depletion of the antioxidant sy^em in chronic intoxication. Experiments have shown that the introduction of a complex anti-oxidant re^ores weakened function leads to lower levels of free-radical pro-cesses and apoptosis in all age groups, but with a more pronounced effect in older animals.
Ключевые слова:Интоксикация, свободно-радикальные процессы, возрастные изменения, тимус, оксидативный стресс, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, витамина Е, тималин
Keywords: Intoxication, free radical processes, age changes, thymus gland, oxidative &ress, lipid peroxidation, albumen oxidation modification, vitamin E, timalin.
Постановка проблемы. В последние годы наблюдается значительный интерес к изучению перекисной активности липидов, как в норме, так и при различных патологических состояниях, так как этот процесс является одним из важнейших факторов адаптации организма. Нарушение ба-ланса между образованием и разрушением перекисей, а так же избыточное накопление свободных радикалов в плазме крови, приводит к снижению уровня утилизации кислорода и в конечном итоге к дефициту энергии и тканевой гипоксии. Разрушающее действие продуктов перекисного окисления липидов на мембраны клеток, приводит к нарушению процессов передачи информации от внеклеточных регуляторов к внутриклеточным эффекторным системам.
Вилочковая железа (тимус) является центральным органом иммунной системы, от состояния и активности которой во многом зависит выраженность защитных реакций всего организма. Условия труда при переработке природного газа современными технологическими способами характеризу-
ются воздействием на работников сложного комплекса неблагоприятных производственных факторов. Многочисленными исследованиями показано, что основными значимыми воздействиями нефтегазоперерабатывающих комплексов являются комбинация газов: сероводород в смеси с углеводородами, сернистый ангидрид, оксид углерода, оксиды азота, ряд аэрозолей. В связи с этим, современные крупные промышленные комплексы по переработке нефтяного и газового сырья с их мощной инфраструктурой воздействуют почти на все составные части внешней среды (атмосферу, гидросферу и литосферу), растительный и животный мир. В этих условиях, необходимость восстановления нарушенного экологического равновесия требует углубленных исследований воздействия таких продуктов, как сероводород, сернистый ангидрид и др., на организм человека.
Анализ последних исследований и публикаций. Многочисленными исследованиями разных авторов установлено, что сероводород, являющийся составной частью природно-
го газа Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ), обладает высокой токсичностью для всего живого, а так же вызывает коррозионное повреждение и разрушение используемого оборудования.
В этих условиях в последние десятилетия в Астраханской области произошло резкое ухудшение экологической обстановки, в том числе связанное, с загрязнением атмосферы продуктами Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ). Ежегодно в воздушный бассейн Астра-ханской области поступает до 230 тысяч тонн химических веществ, из которых до 90% составляют выбросы от работы промышленных предприятий и автотранспорта [9, с. 232]. Серосодержащие продукты АГКМ являются мощным токсическим и стрессорным антропогенным фактором, влияющим на жизненно важные биологические системы, к которым относится так же и иммунная система, вызывающим в процессе старения снижение эффективности антиоксидантной защиты [15, с. 189-198, 14, с. 280-285, 19, с. 97-102], снижение содержания витаминовантиоксидантов [16, с. 1713-1726] и в конечном итоге способствует свободно-радикальному повреждению компонентов клеток [3, с. 195, 8, с. 223-225] и развитию различных возрастных патологий [20, с. 10-16]. В основе отрицательного влияния вредных промышленных факторов на организм человека в числе других лежит нарушение процессов апоптоза. Исследования ряда авторов показали, что при развитии целого ряда заболеваний, связанных с воздействием вредных промышленных факторов на организм человека большое значение имеет нарушение регуляции апоптоза, которое также может служить причиной развития преждевременного старения [12, с. 172]. Со-глас-но свободно-радикальной теории старения, выдвинутой в середине 50-х годов прошлого века Д. Харманом [17, с. 5360-5363], в процессе возраст-ной инволюции усиливается перекисное окисление липидов, которое индуцирует апоп-тоз. Свободные радикалы содержат неспаренный электрон, в результате они могут окислять, т.е. повреждать ДНК, белки, липиды и другие молекулы организма [2, с. 37-42, 21, с. 11168]. Белок р53 является главной детерминантой клеточного механизма, приводящего к програмированной смерти [5, с. 276]. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК, вызываемых например, воздействием природного газа, содержащего сероводород, он активируется, результатом чего является запуск апоптоза.
Благодаря высокой проницаемости гистогематических барьеров для сероводорода и образованию низкорастворимых сульфидов, угнетаются ферменты, нарушается кислотно-щелочное равновесие [1, с. 561-581]. Ингибируя электронный транспорт в митохондриях, путем формирования прочной связи с железом в молекулах цитохромоксидаз, сероводород вызывает острую тканевую гипоксию [4, с. 44, 6, с. 219]. Выраженность защитных реакций организма на внешние воздействия во многом зависит от морфофункци-онального состояния тканей органов иммунной системы [7, с. 237-243, 11, с. 151-161], для формирования и функционирования которой необходим апоптоз.
Выделение нерешенных ранее частей общей проблемы. В большинстве работ, посвящённых изучению тимуса, приводится его строение без учёта возрастной и вариантной морфологии. Данное обстоятельство может явиться причиной не вполне объективной оценки данных получен-ных в процессе экспериментальных исследований этого органа.
Малоизученным остается вопрос о возрастных и тканеспец-ифических особенностях реакции тимуса на хроническое воздействие серосодержащего газа, а так же о динамике процессов свободно-радикального окисления обусловленных стрессом.
Цель статьи. Целью данного исследования явилось изучение закономерностей морфофункциональных и апоп-тотических изменений в тканях тимуса крыс - самцов на различных этапах онтогенеза при хроническом воздействии серосодержащего природного газа Астраханского газо-кон-денсатного месторождения (АГКМ) и применения комплекса антиоксидантов.
Изложение основного материала. Объектом исследования служили самцы беспородных белых крыс. Интактные и экспериментальные животные были разделены на три группы по 10 особей в каждой по возрастному признаку: 1 группа: молодые - от 15 дней до 1 месяца, 2 группа: половоз-ре-лые - 6 - ти месячного возраста, 3 группа: старые - 1-2 лет жизни. Экспериментальные животные подвергались воздействию природного газа АГКМ, содержащего сероводород в концентрации 90 - 4 мг/м3 в течение 6 недель по 4 часа в день. Интактные животные находились также по 4 часа в герметически закрытой затравочной камере, что и опытные, но без присутствия серосодержащего газа. После наркотизации животных этаминалом натрия (внутрибрюшинно в дозе 5 мг на 100г массы тела) производили декапитацию. Процесс перекисного окисления липидов индуцировали добавлением в среду аскорбиновой кислоты и ионов железа (II). Гомогенаты из тканей тимуса, лимфатических узлов и селезенки готовили на фосфатном буферном растворе (рН 7,45). Гомогенизацию проводили при температуре 0 - +40С.
Перекисное окисление липидов основано на взаимодействии одного из конечных продуктов пероксидации липи-дов - малонового диальдегида (МДА) - с тиобарбитуро-вой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса, имеющий максимум поглощения при длине волны 530-532 нм [10, с. 66-68, 13, с. 47-50, 18, с. 351-358]. Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре Baekman (США). Определялись следующие показатели свободнорадикальных процессов: исходное пе-рекисное окисление липидов (ПОЛ) по уровню содержания малонового диальдегида (МДА) в нмоль/0,05 г сырого веса ткани, а ско-рость спонтанного (сп. ПОЛ) и аскорбатзави-симого (Аск.ПОЛ) в нмоль образовавшегося МДА в пробе за 1 час инкубации. Окислительную моди-фикацию белков в плазме крови определяли на основании реакции взаи-мо-действия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДФГ) с образованием окрашенных производных динитрофенилгидразона при длине волны 270 нм на спектрофотометре Baekman (США). С применением общегистологических методов и окраски этидием бромидом изучен апоптоз в тканях тимуса в норме и при хроническом воздействии серосодержащего природного газа и в условиях применения комплекса антиоксидан-тов.
Материалы исследования были обработаны статистически с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.
Установлено, что вилочковая железа окружена соединительно-тканной капсулой и в большинстве случаев состоит из двух долей. В трёх случаях (4.3%) обнаружена трёхдоле-вая форма тимуса.
С момента рождения тимус располагается за грудиной в вентральном средостении, и его топография изменяется в процессе постнатального онтогенеза. У крыс в возрасте до трёх недель каудальный полюс вилочковой железы находится на уровне третьего межреберья. К 6 месяцам каудальный полюс достигает своего дефинитивного положения, прикрывая ушко правого предсердия.
Краниальный полюс тимуса у молодых крыс выступает над уровнем яремной вырезки грудины, что в более позднем возрасте наблюдается достаточно редко. К латеральным поверхностям органа прилежат внутренние яремные вены, париетальная плевра, лимфатические узлы и крупное скопление жировой клетчатки, объём которой нарастает к периоду поло-возрелости, достигая максимума у старых крыс.
У новорожденных крыс средняя масса тимуса составила 7,10±0,33мг, у молодых крыс она увеличивается до 238,2±0,03мг и в дальнейшем не изменяется.
При световой микроскопии тимуса выявляется его дольчатое строение. Размеры долек тимуса достигают максимума у молодых крыс и уменьшаются к периоду наступления половой зрелости. Дольки железы разделяются прослойками соединительной ткани, пучки которой ответвляются от тонкой капсулы органа и проникают на разную глубину внутрь органа. Отдельные дольки имеют поперечный размер от 0,2 до 5 мкм, нередко сливаются друг с другом, образуя древовидные ветвления. В дольках отчетливо различаются наружное более темное корковое вещество и центральное более светлое мозговое вещество. В зависимости от соотношения эпителиальных и лимфоидных клеток и их функционального состояния тимоцитов в дольке тимуса выделяют 4 зоны. Первая зона — это наружный подкапсулярный слой. В ней в 1—3 слоя располагаются большие лимфоциты и бластные клетки, для которых характерны высокая митоти-ческая активность. Эпителиальные клетки имеют типичную звездчатую или веретенообразную форму, образуя широко петлистая сеть, вокруг кровеносных сосудов, где обнаруживаются и макрофаги. В этой зоне происходит образование Т-лимфоцитов из светлых клеток.
Вторая зона — внутренний кортикальный слой, или собственно корковое вещество тимуса. Здесь накапливаются образовавшиеся Т-лимфоциты, формируя специфические антигенные детерминанты.
Корковое вещество тимуса представлено несколькими слоями средних и малых лимфоцитов, содержание которых колеблется от 60 до 85%. Лимфоидные клетки наружной части корковой зоны (обычно это лимфобласты) расположены в 3—4 слоя, диаметр клеток — около 7 мкм. В более глубоких отделах этой зоны встречаются макрофаги. Если суб-капсулярно можно видеть делящиеся клетки, а также лим-фобласты, то внутри коркового вещества находятся главным образом потомки лимфобластов — неделящиеся малые ти-мусные лимфоциты, расположенные вблизи дендритных корковых эпителиальных клеток. Корковые эпителиальные клетки имеют звездчатую форму за счет длинных и тонких цитоплазматических отростков. Последние соединяются друг с другом с помощью десмосом и образуют «сеточку», где располагаются тимоциты коркового вещества. Ядро ти-моцитов овальное, площадь ядра в среднем у молодых крыс составляет 930±0,86 мкм2, у половозрелых -770±1,22 мкм2, у старых животных 550±1,01 мкм2.
Третья зона — мозговое вещество, которое постепенно расширяется после рождения крысы. У группы молодых
крыс площадь мозгового слоя преобладает над площадью коркового. Мозговое вещество является местом выхода Т-лимфоцитов из органа через венулы в кровоток. Здесь обильно представлены эпителиально-ретикулярные клетки (5—20%). Количество лимфоидных клеток в мозговом слое меньше, чем в корковом веществе, и в основном это лимфоциты среднего диаметра. Эпителиальные клетки этого слоя могут формировать эпителиальные тяжи, фолликулопо-доб-ные структуры, расположенные вокруг шарообразных ти-мических телец. Эпителиальная сеть в отличие от таковой в корковом веществе становится широкоячеистой. Наблюдаются гипертрофированные клетки. Многочисленные лимфоциты имеют средние размеры.
Тимические тельца представлены концентрическими скоплениями продолговатых и веретенообразных клеток с большим ядром. Размер телец колеблется: у молодых крыс он составляет в среднем около 60 мкм, у половозрелых 300320 мкм. У старых животных, на фоне возрастной ин-волю-ции тимуса, тельца отличаются большой вариабельностью размера от 80 до 250 мкм. Соединительнотканная строма тимуса у молодых крыс представлена как соединительнотканными, так и эпителиальными элементами. При этом удельная длина коллагеновых и ретикулярных волокон в паренхиме и ширина междольковых прослоек относительно стабильна. На этом этапе онтогенеза дольки тимуса имеют вид многоугольников.
У половозрелых животных плотность стромы увеличивается. Этот процесс происходит на фоне увеличения ширины междольковых перегородок и удельной длины коллагено-вых волокон в паренхиме, что объясняется расширением междольковых соединительнотканных структур и нача-лом интенсивного жирового перерождения органа.
Отдельные участки коркового вещества оказываются заключенными внутри мозгового вещества в виде мелких округлых долек, называемыми корковыми узелками.
Эпителиоретикулоциты соединяются между собой с помощью десмосом, в результате чего формируется сеть, в которой находятся лимфоцитам различной степени зрелости. Гипертрофированные эпителиальные клетки с обширной цитоплазмой имеют вытянутое, часто неправильной формы ядро, по периферии которого сконцентрирован хроматин в виде небольших глыбок. Именно эти клетки образуют свободную сеть, густо заполненную лимфоцитами.
Корковый слой инволюирующего тимуса заселен редкими лимфоцитами и содержит наполненные жировыми вакуолями многочисленные макрофаги. Отмечается инфильтрация мозгового и коркового вещества плазматическими клетками. Наблюдается нарушение тесных соприкосновений между тимоцитами и эпителиальными клетками.
Четвертая зона тимуса образована периваскулярной соединительной тканью, окружающей сосуды мозгового вещества. Это конечный путь для Т-лимфоцитов и, возможно, первое место встречи с чужеродными антиге-нами.
Эпителиальные клетки стромы тимуса примыкают к кровеносным капиллярам, окружая их с помощью своих отростков, формируя тем самым узкие канальцы для прохождения капилляров. При этом между эпителиальной мембраной и капиллярами находится периваскулярное пространство, заполненное тканевой жидкостью и содержащее лимфоциты, макрофаги, плазматические и жировые клетки, фибробла-сты, форменные элементы крови. В результате формируется гематотимусный барьер, между тканевыми структурами ти-
муса и кровеносным руслом органа.
Так как тимус является открытой системой, максимальные возрастные изменения происходят именно в субкапсу-лярной зоне и мозговом веществе. Степень изменения параметров тимуса, а также изменение его клеточного состава коррелируют с возрастом животных.
Уровень свободнорадикального окисления в тканях тимуса свидетельствует о возрастных особенностях функционирования иммунной системы в различные периоды онтогенеза.
Хроническое действие серосодержащего газа проявляется увеличением количества продуктов свободно-радикального окисления и снижением уровня антиокислительной защиты тимуса. Развитие стресс - реакции свидетельствует повышение интенсивности ПОЛ, показателей ОМБ.
Установлено, что количество апоптозных клеток в контроле неодинаково: у молодых животных их число в 2-3 раза ниже, чем у старых крыс. В условиях хронической интоксикации более чувствительными к развитию апоптоза оказались клетки ткани тимуса молодых и старых жи-вотных. Апоптотические изменения тимоцитов протекают на фоне возрастания количества жировых клеток у всех возрастных групп не только в субкапсулярных участках, но и в междоль-ковых прослойках соединительной ткани. Таким образом, при хроническом воздействии серосодержащего природного газа у экспериментальных животных происходит активация апоптотических изменений клеточного звена иммунной защиты.
Выводы и предложения. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при хроническом воздействии серосодержащего природного газа АГКМ интенсивность свободно-радикальных процессов и уровень антиоксидантной защиты в тканях тимуса характеризуются возрастными особенностями функционирования иммунной системы в ответ на действие токсиканта.
Последствия, вызываемые развитием окислительного стресса, позволяют поставить задачу использования корректирующих антиоксидантов [16, с. 1713-1726].
Предварительное введение витамина Е до начала опыта и введение тималина стрессированным животным привело к снижению уровня свободно-радикальных процессов во всех возрастных группах, но с более выраженным эффектом у старых животных.
Введение сочетанного комплекса антиоксидантов при хроническом воздействии серосодержащего природного газа так же оказало выраженное антиапоптотическое действие, как у молодых, так и у старых животных. Это говорит о своевременности и целесообразности антиоксидантной коррекции на фоне хронической интоксикации.
Литература
1. Дубинина, Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях стресса / Е.Е. Дубинина // Вопр. Мед. химии. -2001. - Т. 47. - Вып. 6. - С. 561 - 581.
2. Кольтовер В.К. Свободно-радикальная теория старения: современное состояние и перспективы // Успехи геронтологии. - 1998. - Вып. 2. - с. 37 - 42.
3. Кондратенко Е.И. Функциональные взаимосвязи эндокринных и свободнорадикальных процессов у крыс разного пола при изменении освещенности : моногр. / Е.И. Кондратенко. - Астрахань : Астраханский ун-т, 2003. - 195с.
4. Мажитова, М.В. Свободнорадикальные процессы и антиоксидантная защита разных отделов центральной нервной системы на этапах постнатального онтогенеза белых крыс в норме и при действии промышленных серосодержащих поллютантов : автореф. дис. ... д-ра биол. наук / М.В. Мажитова. - Астрахань. - 2012. -44 с.
5. Новиков В.С. Программированная клеточная гибель / В.С. Новиков - СПб.: Наука, 1996. - 276с.
6. Полунин, И.Н. Токсический отек легких при остром отравлении сероводородсодержащим газом / И.Н. Полунин, Р.И. Асфандияров, Н.Н. Тризно. - Астрахань. - 1999. - 219с.
7. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. - 2002. - №4. -С. 237-243.
8. Рожкова И.С. Показатели свободнорадикальных процессов в иммунной системе крыс на различных этапах онтогенеза / И.С. Рожкова, Д.Л. Теплый, Б.В. Фельдман // Астраханский мед. Журнал. - 2012. - т. 7. - № 4. - с. 223 -225.
9. Саноцкий И.В. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм / И.В. Саноцкий, В.Н. Фоменко. - Москва : Медици-на, 1979. - 232с.
10. Стальная, И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Т. Гаришвили // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина - 1977. - С. 66-68.
11. Стефани Д.В., Зернов И.И. Клеточные мембраны при иммунном ответе /Д.В.Стефани, И.И.Зернов // Проблемы мембранной патологии в педиатрии. - М: 1984. С.151-161.
12. Суханов Г.А. Апоптоз / Г. А. Суханов, О. Е. Акба-шева. - Томск.: Изд-во ТПУ, 2006. - 172с.
13. Теплый Д.Л., Аюпова Н.А. Особенности морфологической картины сыворотки крови мышей разных возрастных групп при экспериментальном стрессе / Д.Л. Теплый, Н. А. Аюпова // Естественные науки: Жур-нал фундаментальных и прикладных исследований. - 2005. - №.10.-С.47-50.
14. Adachi H., Ishii N. Effects of tocotrienols on life span and protein carbonylation in Caenorhabditis elegans // J. Gerontol. Biol. Sci. Med. Sci. - 2000. - Vol. 55, № 6. - P. 280285.
15. Arivazhagan P., Ramanathan K., Panneerselvam C. Effect of DL-alha-lipoic acid on mitochondrial enzymes in aged rats // Chem. Biol. Interact. - 2001. - Vol. 36, № 2. - P. 189-198.
16. Arockia-Rani P.J., Panneerselvam C. Carnitine as a free radical scavenger in aging // Exp. Gerontol. - 2001. - Vol. 36, № 10. - P. 1713-1726.
17. Нarman D. The aging process major risk factor for disease and death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 5360-5363.
18. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 1979, 95(2), P.351-358.
19. Shinohara R., Mano T., Nagasaka A. et al. Lipid peroxidation levels in rat cardiac muscle are affected by age and thyroid flatus // J. Endocrinol. - 2000. - Vol. 164, № 1. - P. 97102.
20. Sodergren E., Cederberg J., Vessby B., Basu S. Vitamin E reduces lipid peroxidation in experimental hepatotoxicity in rats // Europ. J. Nutr. - 2001. - Vol. 40, № 1. - P. 10-16.
21. Yan L.J., Levine R.L., Sohal R.S. Oxidative damage
during aging targets mitochondrial aconitase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 11168.
