CC BY
69
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ФТОРХИНОЛОНОВ С ИОНАМИ МЕДИ (II)
ПОТАПОВ И.В. 1, СУХИХ А.С. 2
*ЗАО «Эдельвейс», г. Кемерово, Россия.
2ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Кемерово, Россия
ORIGINAL ARTICLE
THE REDOX PROPERTIES OF FLUOROQUINOLONE-Cu2+ COMPLEX COMPOUNDS
ILYA V. POTAPOV1, ANDREY S. SUKHIKH2
1Closed Joint-Stock Company "Edelveis" (6, Prospekt Lenina, Kemerovo, 650025), Kemerovo, Russian Federation
2Kemerovo State Medical University (22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056), Kemerovo, Russian Federation
Резюме
Цель. Изучение структуры и окислительно-восстановительных свойств комплексных соединений с ионами меди (II) офлоксацина и левофлоксацина.
Материалы и методы. Синтез координационных соединений. Физико-химический анализ (ИК-спектроскопия, обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием) комплексных соединений офлоксацина (ОФЦ) и левофлоксацина (ЛФЦ) с ионами меди (II). Антиоксидантная и прооксидантная активность по показателю образования малонового диальдегида.
Основные результаты. Получены и охарактеризованы по спектральным характеристикам в ИК-области координационных соединений офлоксацина и левофлоксацина с ионами меди (II). Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ с амперометрическим детектированием позволил выявить отличительные характеристики рассматриваемых комплексов. По данным ВЭЖХ с амперометрическим детектированием, в процессе образования комплекса параллельно происходят реакции, сопровождающиеся окислительным изменением молекулы и добавлением в ее структуру гидрок-
сильного радикала. Комплексное соединение левофлоксацина несёт в 2 раза больше гидрок-сипроизводных, чем офлоксацин. Использование модели перекисного окисления определило отличающуюся антиоксидантную активность. Хроматографически подтверждено, что в процессе комплексообразования происходят структурные изменения молекулы фторхино-лонов, обусловленные присоединением ги-дроксильной группы к ароматическому фрагменту.
Заключение. Процесс образования комплексных соединений между молекулами ОФЦ и его стереоизомера ЛФЦ с ионами меди (II) характеризуется окислительными изменениями молекулы через образование производных, несущих гидроксильную группу. Данные соединения проявляют свойства ингибиторов перекисного окисления липидов и их структурных элементов - жирных кислот. Это свойство необходимо учитывать при определении биологических свойств и токсичности производных офлоксацина или ле-вофлоксацина. Применение обращенно-фа-зовой ВЭЖХ с амперометрическим детектором позволило оценить степень окислительного изменения фторхинолонов и рассчитать количественное содержание комплексных соединений фторхинолонов с ионами Си (II).
Способность к комплексообразованию препаратов ОФЦ и ЛФЦ с ионами Си (II) может быть использована в качестве дезактивации антибактериальных свойств, тем самым способствуя снижению отрицательного влияния на биосферу.
Область применения. Фармацевтическая химия, защита окружающей среды, зелёная химия, общая токсикология.
Ключевые слова: фторхинолоны, ВЭЖХ с амперометрическим детектированием, пере-кисное окисление липидов, реакция Фентон.
English ► Abstract
Aim: To investigate the structure and redox properties of ofloxacin- and levofloxacin-Cu2+ complex compounds.
Materials and Methods: We synthesized coordination compounds and further performed Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and high performance liquid chromatography (HPLC) of ofloxacin- and levofloxacin-Cu2+ complex compounds. We then carried out a lipid peroxidation assay and evaluated antioxidant and pro-oxidant activity of the mentioned compounds by measuring malondialdehyde.
Results: We obtained the specific FTIR spectra for ofloxacin- and levofloxacin-Cu2+ complex compounds. HPLC confirmed that complexation
causes structural changes in fluoroquinolone molecules due to the addition of hydroxyl groups to the aromatic fragment. Lipid peroxidation assay identified distinct antioxidant activity.
Conclusions: Formation of ofloxacin-and levofloxacin-Cu2+ complex compounds is characterized by the oxidative changes in fluoroquinolone molecules via formation of the derivatives with a hydroxyl group. These compounds inhibit lipid peroxidation. This property should be considered when determining the toxicity or any other biological properties of ofloxacin or levofloxacin.
Keywords: fluoroquinolones, high performance liquid chromatography, lipid peroxidation, Fenton reaction
Введение
Антибиотики обнаружены в различных слоях гидросферы по всему миру [1,2]. Это свидетельствует о неэффективности в настоящее время наиболее часто применяемых традиционных процессов биологической очистки для адекватного удаления таких соединений, в том числе из сточных вод [3]. Наблюдения за изменением структуры антибиотиков в окружающей среде крайне важны для понимания судьбы и прогнозирования поведения этих соединений. Наличие антибиотиков и продуктов их трансформации в низких концентрациях обусловливают хроническую токсичность и распространение устойчивых к антибиотикам бактериальных видов [4]. Особого внимания заслуживают продукты, которые в суб-ингибиру-ющих концентрациях способны воздействовать на несколько поколений микроорганизмов водной среды, способствуя формированию бактериальной устойчивости [5,6]. Присутствуя в водных растворах, вещества, проявляющие антибактериальную активность, способны образовывать комплексные соединения с ионами металлов.
Офлоксацин (ОФЦ) (9-Фтор-2,3-ди-гидро-3-метил-10-(4-метил-1-пиперази-
нил)-7-оксо-7Н-пиридо/1,2,3^е/1,4-бензокса-зинкарбоновая кислота) является фторированным аналогом налидиксовой кислоты с широким спектром антибактериальной активности. Являясь представителем антибиотиков группы фторхинолонов, проявляет специфичность при ингибировании бактериальной ДНК-гира-зы. ОФЦ представляет собой рацемическую смесь лево- и правовращающих изомеров. Ле-вофлоксацин (ЛФЦ) является (-)-^)-энанти-омером. ЛФЦ обладает в 12 раз более высоким сродством к комплексу ДНК-ДНК-гираза, а также несколько большей активностью, по сравнению с ОФЦ, в отношении грамположи-тельных бактерий [7].
Исследования комплексов ОФЦ с ионами металлов определены двумя тенденциями
- изучением координационных соединений (КС) с катионами некоторых лекарственных препаратов и образованием КС с микроэлементами биосферы. У полученных КС изучают биологические эффекты. Синтез и свойства КС ОФЦ с катионами щелочноземельных элементов, используемых в качестве антаци-тов, рассмотрены в работе [8]. С другой стороны, изучается образование комплекса ОФЦ
- Си(П) с ДНК [9, 10].
Практически неизученными оказались свойства комплексных соединений ЛФЦ. Полифункциональность структуры фторхинолонов приводит к изменению окислительно-восстановительных свойств в процессе комплексо-образования, что является значимым при прогнозировании влияния комплексных соединений фторхинолонов на свойства биосистем.
Цель исследования
- анализ структуры и окислительно-восстановительных свойств комплексных соединений ОФЦ и ЛФЦ.
Методы исследования
В работе использовали реактивы: сульфата меди (II) пентагидрата, н-бутанол, 2-тиобарби-туровая, линолевая и 10-метилундециленовая кислоты (Aldгich-Sigma, Германия). Калия бромид для ИК-спектроскопии ^1ика, Германия). Ацетонитрил сорт 0 для ВЭЖХ (ЗАО «Кри-охром», Россия), Лецитин раствор (Фармстан-дарт - Биолек, Россия). Изопропиловый спирт (ЗАО «Химмед», Россия). Подвижная фаза и растворы реактивов изготавливались на биди-стиллированной воде, полученной накануне анализа.
Синтез комплекса. Комплексные соединения ОФЦ и ЛФЦ получены при взаимодействии анализируемых фторхинолонов с ионами Си(П) в водной среде при рН=6,3. Методология сводилась к следующему: 0,32 ммоль меди (II) сульфата пентагидрата растворяли в 5 мл воды и при постоянном перемешивании вносили в водный раствор, содержащий 0,01 ммоль соответствующего фторхинолона. Комплексные соединения выделяли из реакционной смеси добавлением десятикратного объема изопро-пилового спирта. Образовавшуюся взвесь комплексного соединения отделяли центрифугированием при 5 тыс. об./мин. Полученный осадок был высушен в вакуум-сушильном шкафу при 60°С. Полученные комплексные соединения фторхинолонов представляли собой мелкий кристаллический порошок изумрудно-зеленого цвета, хорошо растворимый в воде.
Анализ соединений в ИК-области спектра осуществляли на ИК Фурье-спектрометре ФСМ-1202 («Инфраспек», Россия). Параметры записи спектров: диапазон длин волн 4000-400 см-1, разрешение 4 см-1, циклическая запись с количеством сканов 25. Данные образца сравнения (воздух) получали непосредственно пе-
ред записью каждого спектра. Управление прибором и обработку спектров осуществляли с использованием программы Fspec (версия 4.0.0.2). Образец комплексного соединения (массой 0,02 г) перетирали в агатовой ступке с навеской калия бромида (0,2 г) и изготавливали диск методом прессования с усилением 21091,5мПа.
ВЭЖХ анализ выполнен на приборе ВЭЖХ хроматограф Цвет Яуза-04 с амперометриче-ским детектором. Управление прибором и обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программного обеспечения МультиХром, версия 3.1.1550 (ЗАО Амперсенд, Россия). В работе использована хроматографи-ческая колонка Gemini 5 мкм C18, 110A, 250x4,6 мм (Phenomenex, США). Предколонка Security Guard - с картриджем Gemini C18 4x3 мм. Объем петли 20 мкл. Скорость потока 1мл/мин., давление 45,5±0,1 bar. Компоненты подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и бидистилли-рованной воды, смешивались в объёмном соотношении (70:30), после этого проводилась дегазация. Точная навеска комплекса растворялась в подвижной фазе.
Исследование антибактериальной активности проведено на штаммах S. aureus и E. coli согласно методике, предложенной авторами [11].
Влияние на перекисное окисление липидов и жирных кислот проводили по следующей методике. Навеска 10 мг (точная навеска) комплексов ОФЦ или ЛФЦ с медью растворяли в 500 мкл свежеприготовленной бидистиллиро-ванной воды. Полученный раствор в объеме 50 мкл распределили по трём пробиркам. В качестве окисляемых субстратов использованы раствор лецитина (1^10-3 г/см3), линолевая и 10-метилундециленовая кислоты внесённые в реакционную смесь по 50 мкл. Перекисное окисление инициировали добавлением 2^10-:см3 раствора аскорбиновой кислоты 8^10-3 моль/л и 2^10-1см3 раствора железа (II) сульфата 36 •Ю-3 моль/л с последующим инкубированием при 37°С в течение 30 мин. Количество образованных продуктов перекисного окисления в пересчете на малоновый диальдегид определяли по образованию окрашенного три-метинового комплекса с 2-тиобарбитуровой кислоты в условиях анализа, приведённых в работе [12]. Оценивали оптическую плотность окрашенного продукта реакции после предварительной экстракции н-бутанолом с детекцией при 532 нм.
Рисунок 1. ИК-спектр в диапазоне 1700-400 см-1 образцов комплексных соединений офлоксацина и левофлоксацина с медью (II)
Figure 1. FTIR-spectrum of ofloxacin and levofloxacin-Cu2+ complex compounds
100 -
Результаты и обсуждение
Образованные в результате реакции взаимодействия комплексы ОФЦ и ЛФЦ с ионами Си (II) характеризуются наличием нескольких общих полос поглощения (рисунок 1).
Полоса валентных колебаний карбонильной группы - 1626 см-1. Широкие полосы с высокой и средней интенсивностью, с максимум поглощения 1107 и 608(7) см-1 следует рассматривать как результат валентных колебаний Ме2+-0. Некоторое смещение максимума поглощения в область низких частот обнаружено у комплекса ОФЦ 600 см-1, тогда как для ЛФЦ характерной является полоса 615 см-1. В свою очередь, ИК-спектр меди (II) сульфата пентагидрата характеризуется наличием подобных полос поглощения, в том числе полосой 615 см-1. Некоторые смещения данной полосы, видимо, объясняются степенью ассоциации полученного комплекса посредством образованных дипольных связей. Интересно отметить, что в результате образования рассматриваемого комплексного соединения в структуре ИК-спектра исчезает широкая полоса поглощения с максимумом
1712 см-1, характерная для нативных молекул фторхинолонов. Наличие полосы поглощения
1713 см-1 соответствует валентным колебаниям карбонильной группы димеризованных молекул. Однако полоса 1584 см-1 обусловлена обра-
зованием карбоксилат аниона. В свою очередь, полосу поглощения 1344 см-1, обнаруживаемую только на ИК-спектрах комплексных соединений, следует рассматривать как плоско ст-ные деформационные колебания О-Н. Особого внимания заслуживает диапазон низких частот 900-675 см-1, информативный для ароматических структур. Так, в полученных комплексах, в отличие от спектра исходных фторхинолонов, обнаруживается появление полос слабой интенсивности 698 см-1.
Установлено отсутствие антибактериальной активности рассматриваемых комплексных соединений к используемым штаммам микроорганизмов.
При окислении молекулы офлоксацина в условиях реакции Фентон возможно образование производных, содержащих фенольный гидроксил в положении 8 или 9 [13]. С другой стороны, ампе-рометрическое детектирование позволяет селективно визуализировать наличие соединений, проявляющие восстановительные свойства, в том числе содержащих фенольный гидроксил [14,15]. Таким образом, в рассматриваемых нами условиях, образование комплексных соединений между молекулами ОФЦ или ЛФЦ с ионами меди (II) проходит одновременно с окислительным изменением молекулы с образованием ароматических гидрок-сипроизводных. В качестве внешнего стандарта нами был использован 8-гидроксихинолин.
нА 400
300 -
200
100
Ток
—Г 10
11
12
—Г 13
—г 14
—г 15
Рисунок 2. Хромато-грамма ВЭЖХ комплекса офлоксацина с медью (II)
Figure 2. HPLC of ofloxacin-Cu2+ complex compound
нА 1000
800 ■
600 ■
400 ■
200 ■
Ток
01
-1-r
2 3
—I
10
11
—I
12
—I
13
14
—I
15
Рисунок 3. Хромато-грамма ВЭЖХ комплекса левофлокса-цина с медью (II)
Figure 3. HPLC of levofloxacin-Cu2+ complex compounds.
В условиях ВЭЖХ анализируемый комплекс ОФЦ элюировался на 2,362 мин, содержание фенольного гидроксила в пересчете на стандарт составило 2,0^10-5г/мл. Для данного образца также характерно наличие наездника с максимумом выхода на 4 минуте (рисунок 2).
В свою очередь, комплекс ЛФЦ с ионами меди (II) характеризуется несколько отсроченным временем элюирования - 2,56 мин. и более высокой восстановительной активностью, проявляющейся в отклике детектора в пересчёте на стандарт соответствующего 3,9^10-5г/мл фе-ноксильных групп (рисунок 3).
Таким образом, по данным ВЭЖХ, образец комплекса ЛФЦ с ионами меди (II) характеризуется более высокой однородностью компонентного состава и относительно большей
(около 2 раз) восстановительной способностью. Указанные хроматографические особенности комплекса ЛФЦ, по нашему мнению, связаны со стерическими особенностями исходной молекулы.
Наличие фенольного гидроксила у полученных комплексных соединений хорошо согласуется с влиянием на показатели перекисно-го окисления липидов. Известно, что антиок-сидантная активность фенольных соединений связана с их способностью обрывать цепной процесс окисления [16]. В качестве показателя влияния на перекисное окисление липидов нами использован вариант определения малонового диальдегида как одного из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов. Малоновый диальдегид образу-
0
2
3
4
5
6
7
9
7
Таблица 1. Содержание продуктов пере-кисного окисления в пересчёте на малоновый диальде-гид (ммоль/мл), при совместном присутствии окисляемого субстрата и комплексного соединения фторхинолона
Table 1. The content of peroxidation products in terms of malonic dialdehyde (mmol/ ml), in the joint presence of oxidizable substrate and a complex compound of fluoroquinolone
ОФЦ ЛФЦ
Ундециленовая 0,0888 0,0034
Линолевая 0,3997 0,1767
Лецитин 0,0069 0,0098
Примечание: ЛФЦ - Левофлоксацин,
ОФЦ - Офлоксацин
Note: LFC - Levofloxacin OFC - Ofloxacin
ется при перекисном окислении свободными радикалами при разрыве молекул ненасыщенных жирных кислот. На модели ингибирования перекисного окисления липидов нами установлено, что все исследуемые комплексы, в сравнении с контролем ингибировали образование малонового диальдегида (таблица 1).
Однако при использовании комплекса с ЛФЦ происходило снижение образования малонового диальдегида. При воздействии на окисляемые субстраты эффективность антиоксидант-ных свойств комплексного соединения ЛФЦ в 2,1 раза выше, чем у ОФЦ.
Эти данные хорошо согласуются с результатами ВЭЖХ, где показано более высокое образование продуктов ароматического гидрокси-лирования комплекса ЛФЦ. Стерические особенности молекул рассматриваемых фтор-
хинолонов играют существенную роль при инициировании и/или ингибировании окислительно-восстановительных процессов, и в частности процессов перекисного окисления липидов или ненасыщенных жирных кислот различных гомологических рядов.
Заключение
Процесс образования комплексного соединения между молекулой ОФЦ и его стерео-изомера ЛФЦ с ионами меди (II) характеризуется окислительными изменениями молекулы через образование производных, несущих гидроксильную группу. Данные соединения проявляют свойства ингибиторов перекис-ного окисления липидов и их структурных элементов - жирных кислот. Данное свойство необходимо учитывать при определении токсичности и иных биологических свойств офлоксацина или левофлоксацина. Применение обращенно-фазовой ВЭЖХ с амперо-метрическим детектором позволило оценить степень окислительного изменения фторхи-нолонов и рассчитать количественное содержание комплексных соединений фторхиноло-нов с ионами Си (II). Эффект образование КС ОФЦ и ЛФЦ с ионами Си(П) может использоваться для дезактивации антибактериальных препаратов.®
Литература / References:
1. Fatta-Kassinos D, Meric S, Nikolaou A. Pharmaceutical residues in environmental waters and wastewater: current state of knowledge and future research. Anal. Bioanal. Chem. 2011; 399 (1): 251-275.
2. Jeong J, Song W, Cooper WJ, Jung J, Greaves J. Degradation of tetracycline antibiotics: Mechanisms and kinetic studies for advanced oxidation/reduction processes. Chemosphere. 2010; 78 (5): 533-540.
3. Michael I, Rizzo L, McArdell CS, Manaia CM, Merlin C, Schwartz T et al. Urban wastewater treatment plants as hotspots for the release of antibiotics in the environment: A review. Water Res. 2013; 47 (3): 957-995.
4. Le-Minh N, Khan SJ, Drewes JE, Stuetz RM. Fate of antibiotics during municipal water recycling treatment processes. Review. Water Res. 2010; 44 (15): 4295-4323.
5. Rosal R, Rodríguez A, Perdigón-Melón JA, Petre A, García-Calvo E, Gómez MJ et al. Occurrence of emerging pollutants in urban wastewater and their removal through biological treatment followed by ozonation. Water Res. 2010; 44 (1): 578-588.
6. Castiglioni S, Pomati F, Miller K, Burns BP, Zuccato E, Calamari D et al. Novel homologs of the multiple resistance regulator marA in antibiotic-contaminated environments. Water Res. 2008; 42 (16): 4271-4280.
7. Davis R, Bryson HM. Levofloxacin. Drugs. 1994; 47 (4): 677-700.
8. Macias B, Martinez M, Sanchez A, Dominguez-Gil A. A physico-chemical study of the interaction of ciprofloxacin and ofloxacin with polivaient cations. Int. J. Pharm. 1994; 106 (3): 229-232.
9. Zhang N, Zhang X. Voltammetric study of the interaction of the ofloxacin-copper complex with DNA, and its analytical application. Microchimica Acta. 2007; 159: 65-70.
10. Chen C-Y, Chen Q-Z, Wang X-F, Liu M-S, Chen Y-F. Synthesis, characterization, DNA binding properties, and biological activities of a mixed ligand copper(II) complex of ofloxacin. Transition Metal Chem. 2009; 34: 757-763.
11. Methodical instructions for studying of antimicrobic activity of pharmacological substances. Management on experimental (preclinical) studying of new pharmacological substances. M.: Medicine, 2005. Page 513-532. Russian (Методические указания по изучению противомикробной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М. : Медицина, 2005. С. 513-532).
12. Guzmán-Chozas M, Vicario-Romero IM, Guillén-Sans R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. J. Americ. Oil Chem. Soc. 1998; 75: 1711-1715.
13. Michael I, Hapeshi E, Aceña J, Perez S, Petrovic M, Zapata A et al. Light-induced catalytic transformation of ofloxacin by solar
Fenton in various water matrices at a pilot plant: Mineralization and characterization of major intermediate products. Sci. Total Environ.
-•-•-
2013; 461-462: P.39-48.
14. Nishio K, Horie M, Akazawa Y, Shichiri M, Iwahashi H, Hagihara Y. Attenuation of lipopolysaccharide (LPS)-induced cytotoxicity by tocopherols and tocotrienols. Redox Biology. 2013; 1: 97-103.
15. Vanbeneden N, Delvaux F, Delvaux FR. Determination of hydroxycinnamic acids and volatile phenols in wort and beer by isocratic high-performance liquid chromatography using electrochemical detection. J. Chromatography A. 2006; 1136: 237-242.
16. Emmanuel NM, Karpukhina GV. Classification of synergetic mixtures of antioxidants and mechanisms of sinerizm. Dokl. Academy of Sciences USSR. 1984; 276 (5): 1163-1167. Russian (Эммануэль Н.М., Карпухина Г.В. Классификация синергических смесей антиоксидантов и механизмов синергизма. // Докл. АН СССР. 1984. Т. 276. №5. С.1163-1167).
Authors:
Dr. Ilya V. Potapov, MD, Pharmacist, Closed Joint-Stock Company "Edelveis", Kemerovo, Russian Federation
Contribution: collected the antimicrobials, performed Fourier transform infrared spectroscopy and experiments on antibacterial and antioxidant activity.
Dr. Andrey S. Sukhikh, MD, PhD, Postdoctoral Researcher, Central Research Laboratory, Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation
Contribution: conceived and designed the study, performed high performance liquid chromatography analysis, wrote the manuscript.
Корреспонденцию адресовать:
Сухих Андрей Сергеевич,
22а, ул. Ворошилова, г. Кемерово, 650056,
Тел.: +7(384)252-10-18
E-mail: [email protected]
Corresponding author:
Dr. Andrey S. Sukhikh,
22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650029, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Acknowledgements: There was no funding for this project.
