Окислительная модификация белков - ранний критерий развития хронической обструктивной болезни лёгких Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

2014

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 11

Вып. 2

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ

УДК 616.24:577.112.4

М. Н. Палей1, А. В. Вьюшина2, А. В. Притворова2, Н. Э. Ордян2, Е. В. Евсюкова1

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ — РАННИЙ КРИТЕРИЙ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЁГКИХ

1 Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

2 Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одной из ведущих проблем здравоохранения, поскольку ведет к потере трудоспособности. Большую роль в развитии ХОБЛ играет окислительный стресс, при котором образующиеся в избытке реактивные радикалы кислорода вызывают повреждение белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот. Главным фактором риска развития ХОБЛ и причиной оксидативного стресса является курение. Одним из ранних и надежных индикаторов окислительного стресса и поражения тканей при развитии свободно-радикальной патологии является окислительная модификация белков. В статье представлены результаты изучения окислительной модификации белков у здоровых курящих лиц с индексом курящего человека до 10 пачка/лет и у больных I степенью ХОБЛ. Показано снижение количества восстановленных тиолов и повышение спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков на стадии инициации процесса по сравнению со здоровыми некурящими людьми и больными ХОБЛ легкого течения, что является ранним признаком окислительного стресса и может служить диагностическим критерием начавшегося повреждения дыхательных путей еще до развития клинической картины хронической обструктивной болезни легких. Библиогр. 16 назв. Табл. 3.

Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь лёгких, индекс курящего человека, окислительная модификация белков, антиоксидантная система, тиолы, окислительный стресс.

OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IS THE EARLY CRITERION OF DEVELOPMENT OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

M. N. Paley1, A. V. Vjushina2, A. V. Pritvorova2, N. E. Ordyan2, H. V. Evsyukova1

1 St. Petersburg State University, 7/9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation

2 I. P. Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences, 6, Makarova nab., St. Petersburg,199034, Russian Federation

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is one of the leading health problems because it leads to disability. Important role in the development of COPD belongs to oxidative stress, which is accompanied by production of excessive amounts of reactive oxygen radicals that cause damage to proteins, carbohydrates, lipids and nucleic acids. Smoking is the main risk factor for COPD and cause of oxidative stress. Oxidative modification of proteins is one of the earliest and most reliable indicators of oxidative stress and destruction of tissues. The article presents the results of a study of oxidative modification of proteins in healthy smokers and patients with COPD I degree. The study showed decreased levels of recovered thiols and increased values of spontaneous and induced oxidative modification of proteins at

the initiation stage in healthy smokers, compared with healthy nonsmoking people and mild COPD patients. That is an early sign of oxidative stress and it can serve as a diagnostic criterion for damage of the respiratory tract before the development of the clinical presentation of chronic obstructive pulmonary disease. Refs 16. Tables 3.

Keywords: chronic obstructive pulmonary disease, index of smoking, oxidative modification of proteins, antioxidant system, thiols, oxidative stress.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является одной из ведущих проблем здравоохранения, поскольку ведет к потере трудоспособности, высокой смертности и, по прогнозам ВОЗ, может к 2020 г. занять третье место среди других заболеваний в мире [1-3]. Большую роль в развитии ХОБЛ играет окислительный стресс, при котором образующиеся в избытке реактивные радикалы кислорода вызывают повреждение белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот [4, 5]. Причинами развития окислительного стресса при ХОБЛ являются воздействие поллютантов из окружающей среды, образование большого количества реактивных радикалов кислорода и азота в результате воспалительного процесса в дыхательных путях и, в большей степени, влияние сигаретного дыма [6]. Известно, что последний содержит более 4000 различных химических веществ и генерирует более 1015 активных форм кислорода за одну затяжку [7]. Одним из ранних и надежных индикаторов окислительного стресса и поражения тканей при развитии свободно-радикальной патологии является окислительная модификация белков (ОМБ) [4]. Наши предыдущие исследования показали ее значительное возрастание у больных ХОБЛ как в фазе обострения, так и на стадии ремиссии заболевания [8, 9]. Поскольку курение является фактором риска развития ХОБЛ, целью настоящего исследования явилось изучение окислительной модификации белков у курящих здоровых людей и у больных ХОБЛ, имеющих первую степень заболевания.

Материал и методы. Обследовано 19 больных ХОБЛ (8 женщин и 11 мужчин) легкой степени тяжести в фазе ремиссии заболевания. Средний возраст больных составил 59,11±1,40 лет, индекс курящего человека (ИКЧ) — 32,66±1,34 пачка/лет. Диагноз выставляли на основании оценки клинической картины и результатов исследования функции внешнего дыхания в соответствии с классификацией ХОБЛ по степени тяжести заболевания (GOLD 2003). В период исследования пациенты не получали бронхолитическую и противовоспалительную терапию.

В группу сравнения вошли 12 здоровых курящих лиц (7 женщин и 5 мужчин), средний возраст которых — 46,75±3,63 лет, а ИКЧ — 8,37±0,49 пачка/лет.

Контрольную группу составили 58 здоровых некурящих человек, среди которых было 35 женщин и 23 мужчины. Средний возраст здоровых людей составил 30,62±2,15 года. Все они не имели хронической бронхолёгочной патологии и аллергических заболеваний.

Перед началом исследования наряду с оценкой клинического состояния у больных ХОБЛ исследовали показатели функции внешнего дыхания до и после проведении бронхолитической пробы (ЖЕЛ — жизненная емкость лёгких, ФЖЕЛ — форсированная жизненная емкость лёгких, ОФВ1 — объем форсированного выдоха за первую секунду, ОФВ1/ФЖЕЛ — тест Тиффно, ПОСвыд. — пиковая объемная скорость выдоха, МОС50% и МОС75% — максимальная объёмная скорость выдоха при 50% и 75% форсированной ЖЕЛ) с помощью спирометра «Диамант».

Для количественного определения продуктов окислительной модификации белков применяли метод, основанный на реакции взаимодействия карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилги-дразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически [10].

Перед исследованием сыворотку разводили физиологическим раствором в соотношении 1:10. Содержание белка в сыворотке крови измеряли по методу Лоури. Для исследования уровня спонтанной ОМБ к 50 мкл разведенной сыворотки приливали 0,95 мл 0,01М Ш-К-фосфатного буфера. Для определения стимулированной ОМБ количество буфера уменьшали до 0,75 мл. В качестве стимулирующей системы Фентона в пробу добавляли 0,1 мл смеси 10мМ Fe2+ и ЭДТА 10Мм (1:1) и 0,1 мл 0,1М H2O2. Ставили две параллельные пробы, одна из которых служила контролем. Конечный объем проб составлял 1 мл. Контрольные и опытные пробы инкубировали в течение 15 минут при 37°С. После инкубации в пробы добавляли 1 мл холодной 20% ТХУ для осаждения белка, затем в опытные пробы добавляли 1 мл 0,1М 2,4-ди-нитрофенилгидразина для окрашивания продуктов ОМБ, а в контрольные добавляли 1 мл 2М HCL. Окрашивание проводили в течение одного часа при комнатной температуре. Затем пробы центрифугировали при 200g в течение 10 мин в центрифуге К-26. Осадок дважды промывали 2-3 мл смеси этанол: этилацетат (1:1), высушивали и растворяли в 3 мл 8М мочевины с добавлением 1 капли 2М HCL.

Продукты реакции — карбонильные производные белков, образовавшиеся на стадии инициации процесса, регистрировали при длине волны 270 нм, а на стадии элонгации — при 363 нм и 370 нм. Количество продуктов ОМБ выражали в единицах оптической плотности, рассчитанной на 1 мг белка (Е/мг белка). Для оценки стимулированной ОМБ использовали величину приращения ОМБ, вычитая из значений, полученных в пробе после индукции реактивом Фентона, значения спонтанной ОМБ. Измерения проводили на спектрофотометре СФ 26.

Спонтанная (СП) ОМБ является показателем, характеризующим базальный уровень окисленных белков. Индуцированная (ИНД) ОМБ указывает на наличие субстрата для свободно-радикальных процессов, т. е. служит как показатель устойчивости системы к переокислению.

Количество восстановленных тиолов определяли по методу В. В. Соколовского (1997). Результаты выражали в мкМ в расчете на 1 мл. Уровень восстановленных тиолов является показателем, характеризующим работу многих компонентов АОС. Во-первых, они сами являются низкомолекулярными антиоксидантами, так называемыми «тушителями» АФК. Во-вторых, от их концентрации зависит активность ферментов глютатионпероксидазы и глютатионредуктазы, участвующих в антиок-сидантной защите организма.

Статистическую обработку материала проводили с помощью стандартного приложения прикладных программ «Statistica» v.6. для персонального компьютера IP 166 MMX. Достоверность различий между средними величинами параметров определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни для независимых выборок. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты исследований и обсуждение. Результаты исследований показали, что у курящих пациентов с небольшим стажем курения (до 10 пачек/лет) наблю-

дается усиление окислительной модификации белков, причем существенно увеличена как спонтанная, так и индуцированная ОМБ на стадии инициации (табл. 1). При этом наблюдается снижение количества восстановленных тиолов по сравнению со здоровыми некурящими людьми.

Таблица 1. Показатели ОМБ и уровень восстановленных тиолов у курящих и некурящих лиц

Группы Показатели ОМБ Восстановленные тиолы, мкМ/л

270 нм 363 нм

спонтанная (Е/мг) индуцированная (Е/мг) спонтанная (Е/мг) индуцированная (Е/мг)

Курящие, до 10 пачка/лет (12 чел.) 0,030±0,008 0,175±0,008 0,027±0,009 0,177±0,011 0,384±0,021

Здоровые некурящие (58 чел.) 0,013±0,002 0,133±0,006 0,017±0,002 0,151±0,006 0,470±0,011

Р <0,05 <0,01 >0,05 >0,05 <0,01

Данные результаты указывают на усиление свободно-радикального окисления белков на фоне снижения активности антиоксидантной системы организма. Кроме того, увеличение у курящих лиц ОМБ после индукции реактивом Фентона свидетельствует о наличии дополнительных резервов для окисления.

При сопоставлении показателей ОМБ у здоровых курящих лиц и больных I степенью ХОБЛ оказалось, что у последних снижается индуцированная окислительная модификация белков в модели металл-катализируемого окисления in vitro как на стадии инициации, так и на стадии элонгации процесса (табл. 2). При этом так же, как и у здоровых курящих людей, наблюдается низкий уровень восстановленных тиолов.

Таблица 2. Показатели ОМБ и уровень восстановленных тиолов у курящих лиц и больных ХОБЛ

I степени

Группы Показатели ОМБ Восстановленные тиолы, мкМ/л

270 нм 363 нм

спонтанная (Е/мг) индуцированная (Е/мг) спонтанная (Е/мг) индуцированная (Е/мг)

Курящие, до 10 пачка/лет (12 чел.) 0,030±0,008 0,175±0,008 0,027±0,009 0,177±0,011 0,384±0,021

Больные ХОБЛ I степени (19 чел.) 0,016±0,004 0,132±0,014 0,012±0,002 0,123±0,013 0,399±0,020

Р >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05

Следует отметить тот факт, что у больных ХОБЛ легкого течения заболевания (I степень) наблюдается лишь тенденция к повышению спонтанной окислительной модификации белков на стадии инициации по сравнению со здоровыми некурящими людьми (0,016±0,004 против 0,013±0,002 Е/мг у здоровых некурящих лиц, Р > 0,05) и тенденция к снижению спонтанной и индуцированной ОМБ на стадии элонгации (0,012±0,002 и 0,123±0,013 Е/мг против 0,017±0,002 и 0,151±0,006 Е/мг у здоровых некурящих лиц, Р > 0,05).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у курящих здоровых людей с индексом курящего человека до 10 пачка/лет уже наблюдаются признаки окислительного стресса, что ведет к большому потреблению антиоксидантов. При этом у организма сохраняются компенсаторные возможности, позволяющие обеспечить окисление белков при дополнительной стимуляции. Однако продолжающееся курение вызывает необратимые изменения в митохондриях эпителиальных клеток бронхиального дерева (увеличенную фрагментацию, разветвление, изменение плотности матрикса и уменьшение количества крист), что сопровождается большим потреблением энергии и усилением провоспалительной активности [11, 12]. Это, в свою очередь, усиливает окислительный стресс с выработкой реактивных радикалов кислорода и провоспалительных факторов (ОТ-кВ, ^-1^, ^-6, ^-8) и способствует развитию хронического воспаления дыхательных путей [7, 13]. Воспаление дыхательных путей и продолжающееся влияние сигаретного дыма обусловливает истощение антиоксидантных резервов и модификацию белков при ХОБЛ, что выражается, по нашим данным, в снижении резерва для дополнительного окисления при стимуляции. При этом индивидуальный анализ показал, что значения индуцированной ОМБ на стации инициации процесса тем меньше, чем больше индекс курящего человека (£ = -0,58, Р < 0,05). Интересен тот факт, что ранние и более существенные изменения происходят именно с индуцированной реактивом Фентона окислительной модификацией белков в ответ на усиление свободно-радикального окисления. В эксперименте показано, что ферменты, имеющие в составе металл, особенно чувствительны к металл-катализируемому окислению, т. е. окислительная модификация ферментов ингибирует их активность [14, 15]. В связи с этим, ранней мишенью окислительного стресса являются гем-содержащие белки, в первую очередь эритроциты [4]. Это приводит к гипоксии, приводящей к нарушению энергетического обмена на клеточном уровне в результате подавления функции элементов митохондриальной дыхательной цепи. Последнее сопровождается нарушением тканевого дыхания и является причиной поражения не только дыхательной, но и других функциональных систем организма больных ХОБЛ. Кроме того, деструкция белков и митохондриального аппарата эпителия бронхов, по-видимому, служит причиной развития необратимых обструктивных нарушений вентиляционной способности легких при ХОБЛ. Об этом свидетельствуют полученные данные функции внешнего дыхания, характерные для первой степени ХОБЛ (ОФВ1 > 80% от должных величин и ОФВ1/ФЖЕЛ <70%). Показатели функции внешнего дыхания у обследованных больных легкого течения ХОБЛ представлены в таблице 3.

Из таблицы видно, что уже при легком течении ХОБЛ происходят изменения вентиляции на уровне дистальных отделов бронхиального дерева. Об этом свидетельствует снижение таких показателей, как МОС50 ^ > 61%Д) и МОС75 ^ > 55%Д). Следует отметить, что обструкция на всем протяжении бронхиального дерева не-

Таблица 3. Показатели функции внешнего дыхания до и после ингаляции бронхолитика у больных ХОБЛ первой степени тяжести

Показатели ФВД (% долж.) ЖЕЛ ФЖЕЛ ОФВ1 ОФВ1/ ФЖЕЛ ПОС выд. МОС50 МОС75

Исходные показатели 101,7±1,8 98,2±1,7 88,1±1,7 69,4±1,4 90,5±2,1 55,3±4,3 32,6±3,8

После бронхолитика 102,5±1,9 100,3±1,6 91,5±1,5 69,5±1,0 94,6±1,9 62,1±4,5 40,1±5,0

Обратимость обструкции 0,8±0,7 2,6±1,0 3,4±1,1 1,2±0,8 4,2±1,4 6,8±2,0 7,5±2,4

обратима (обратимость обструкции <12-15%), что может указывать на потерю чувствительности рецепторов бронхиального дерева к р2-адреномиметикам вследствие окисления протеинов клетки. В пользу этого свидетельствуют данные литературы о снижении чувствительности глюкокортикоидных рецепторов у больных ХОБЛ в результате окислительного стресса [16].

Таким образом, наличие снижения уровня восстановленных тиолов и повышения спонтанной и индуцированной окислительной модификации белков — ранних признаков окислительного стресса — у курящих людей с небольшим стажем курения (до 10 пачка/лет) может служить диагностическим критерием начавшегося повреждения верхних дыхательных путей еще до развития клинической картины хронической обструктивной болезни легких.

Литература

1. Rycroft C. E., Heyes A., Lanza L., Becker K. Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease: a literature review // International Journal of COPD. 2012. Vol. 7. P. 457-494.

2. Devereux G. ABC of chronic obstructive pulmonary disease: definition, epidemiology, and risk factors // British Medical Journal. 2006. Vol. 332, N 7550. P. 1142-1144.

3. Глобальная инициатива по хронической обструктивной болезни лёгких (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease — GOLD), пересмотр 2008 г. / пер. с англ. М.: Издательский холдинг «Атмосфера», 2009. 100 с.

4. Дубинина Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и биохимические аспекты. СПб.: Медицинская пресса, 2006. 400 с.

5. Birben E., Sahiner U. M., Sackesen C., Erzurum S., Kalayci O. Oxidative Stress and Antioxidant Defense // World Allergy Organ J. 2012. Vol. 5, N 1. P. 9-19.

6. Van Eeden S. F., Sin D. D. Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease: A lung and systemic process // Can Respir J. 2013. Vol. 20, N 1. P. 27-29.

7. Church D. F., Pryor W. A. Free radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications // Environ Health Perspect. 1985. Vol. 64. P. 111-126.

8. Евсюкова Е. В., Вьюшина А. В., Рудиков В. Б. Окислительная модификация белков у пожилых больных хронической обструктивной болезнью легких // Материалы конференции «Инновационные технологии управления здоровьем и долголетием человека». СПб., 2010. С. 97-102.

9. Евсюкова Е. В., Палей М. Н., Вьюшина А. В., Притворова А. В. Эффективность применения антиоксидантов в комплексной терапии хронической обструктивной болезни лёгких // Вестн. С.-Петерб. гос. ун-та. Сер. 11. 2012. Вып. 4. С. 15-22.

10. Levine R. L., Carland D., Oliver C. N. et al. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Methods Enzymol. 1990. Vol. 186. P. 464-478.

11. Hoffmann R. F., Zarrintan S., Brandenburg S. M. et al. Prolonged cigarette smoke exposure alters mitochondrial structure and function in airway epithelial cells // Respiratory Res. 2013. Vol. 14, N 1. P. 97-108.

12. Van der Toom M., Rezayat D., Kauffman H. F. et al. Lipid-soluble components in cigarette smoke induce mitochondrial production of reactive oxygen species in lung epithelial cells // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2009. Vol. 297. P. 109-114.

13. Rahman I., Adcock I. M. Oxidative stress and redox regulation of lung inflammation in COPD // Eur. Respir. J. 2006. Vol. 28. P. 219-242.

14. Stadtman E. R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Radic Biol. Med. 1990. Vol. 9. P. 315-325.

15. Fucci L., Oliver C. N., Coon M. J., Stadtman E. R. Inactivation of key metabolic enzymes by mixed-function oxidation reactions: possible implication in protein turnover and ageing // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1983. Vol. 80. P. 1521-1525.

16. Zeng M., Li Y., Jiang Y., Lu G., Huang X., Guan K. Local and systemic oxidative stress and glucocorticoid receptor levels in chronic obstructive pulmonary disease patients // Can. Resp. J. 2013.Vol. 20, N 1. P. 35-41.

Статья поступила в редакцию 25 марта 2014 г.

Контактная информация

Палей Марина Николаевна — аспирант; mnpaley@mail.ru

Вьюшина Анна Вадимовна — кандидат биологических наук, научный сотрудник; sts@infran.ru Притворова Анастасия Вадимовна — старший лаборант; sts@infran.ru Ордян Наталья Эдуардовна — доктор биологических наук, заведующая лабораторией; neo@infran.ru

Евсюкова Елена Владимировна — доктор медицинских наук, профессор; eevs@yandex.ru

Paley Marina N. — post-graduate student; mnpaley@mail.ru

Vjushina Anna V. — Candidate of Biology, researcher; sts@infran.ru

Pritvorova Anastasija V. — senior assistant; sts@infran.ru

Ordyan Natalia E. — Doctor of Biology, Head of the Laboratory; neo@infran.ru

Evsyukova Helen V. — Doctor of Medicine, Professor; eevs@yandex.ru