CC BY
14УДК 616-001.17
Халдун Обад1, Лакал Абдулла1, К.С. Бекшоков2, Н.К. Кличханов 2
Окислительная модификация белков плазмы крови ожоговых больных
1 Аденский университет Республики Йемен
2 Дагестанский государственный университет; klich-khan@,maü. ru
Исследовано содержание карбонильных групп белков плазмы крови и среднемолекулярных пептидов крови у больных с ожоговой болезнью. Содержание карбонильных групп в исследованных компонентах существенно возрастает при ожоговой болезни.
Ключевые слова: карбонильные группы белков, среднемолекулярные пептиды, ожоговая болезнь, окислительная модификация белков.
The content of carbonyl groups in blood plasma proteins and middlemolecular peptides in burn patients was studied. The amount of carbonyls significantly rises at burn disease.
Keywords: carbonyl groups of protein, middlemolecular peptides, a burn disease, oxidative modification of protein.
Ожоговая болезнь - специфический симптомокомплекс, развивающийся после термической травмы и сопровождающийся как местными, так и дистантными эффектами, приводящими к интенсивному воспалению, повреждению тканей и инфекции. Как правило, ожоговая болезнь развивается, если площадь поверхностного ожога превышает 10-12 %, а глубокого 5-6 % [1].
Общими особенностями метаболической реакции, наблюдаемой после термической травмы, являются: метаболический ацидоз, гипервентиляция, дыхательный алкалоз. Повышение уровня токсичных медиаторов воспаления, оксидантов и активация протеаз может еще больше повреждать кожу и капиллярные эндотелиальные клетки и усиливать ишемический некроз тканей [2].
На молекулярном уровне активация комплемента и внутрисосудистая стимуляция нейтро-филов приводят к образованию цитотоксических активных форм кислорода. Считают, что токсические побочные продукты, образующиеся при функционировании ксантиноксидазы - перекись водорода и гидроксильный радикал - непосредственно повреждают структуры кожи [3]. Усиленная генерация активных форм кислорода при этом способствует окислительной модификации важнейших биомолекул тканей. Исследования показали, что в динамике ожоговой болезни наблюдается интенсификация процессов перекисного окисления липидов [4]. Установлено, что в условиях окислительного стресса белки подвергаются окислительной модификации в большей степени, чем липиды [5]. Однако неизвестно как изменяется степень окислительной модификации белков в динамике ожоговой болезни.
Одним из наиболее тяжелых и прогностически значимых проявлений ожоговой болезни является эндогенная интоксикация. Среди причин интоксикации у обожженных важную роль играют эндотоксины пептидной природы с мол. массой 300-5000 Д, «среднемолекулярные пептиды» (СМП), которые в значительном количестве появляются в плазме крови [6]. Избыточное накопление СМП в средах организма связано, прежде всего, с активацией протеолитических процессов, а также с нарушением выведения СМП из организма вследствие дисфункции органов детоксикации. Определение концентрации СМП в биологических средах организма является одним из наиболее информативных и доступных способов оценки выраженности эндогенной интоксикации.
Целью настоящей работы явилось исследование интенсивности окислительной модификации белков в плазме крови в динамике ожоговой болезни ША-ШВ степени на фоне токсемии и проводимого лечения.
Материалы и методы
Проведено исследование 10 больных с ожоговой болезнью, находившихся на лечении в ожоговом центре республиканской клинической больницы № 1 г. Махачкалы. Все обследуемые
были мужского пола, возраст пациентов составлял от 30 до 50 лет. Все пациенты имели ожоги ША-ШВ степени, получали стандартное комплексное лечение.
Кровь для исследования брали из локтевой вены в динамике ожоговой болезни в следующие сроки: 1, 5, 7, 10-й дни после ожога. Контролем служили здоровые доноры.
О степени окислительной модификации белков плазмы крови судили по количеству карбонильных групп, реагирующих с 2.4-динитрофенилгидразином [6]. При этом определяли исходный уровень карбонильных групп, а также их накопление в модельной системе в течение 15 мин при 37 °С в присутствии 10-3 М Fe2+, 10-3 М ЭДТА и 3Х10-4 М Н2О2. Уровень карбонильных групп, измеренный при длине волны 370 нм, рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции алифатических динитрофенилгидразонов (22 000 л/М на 1 см), и выражали в нмолях на 1 мг белка. Количественное содержание белка в плазме крови определяли биуретовым методом [7]. Содержание СМП в безбелковом супернатанте плазмы крови проводили по измерению оптической плотности окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуре-товой реакцией на пептидные связи [8]. Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакетов программ «Excel» и «Statistica» для Windows.
Полученные результаты и их обсуждение Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что у больных в первые сутки после ожоговой травмы наблюдается достоверное снижение содержания общего белка в плазме крови на 18 % относительно данных у доноров. В последующем вплоть до 10-х суток наблюдения содержание белка в плазме крови больных постепенно возрастает. Снижение содержания белка в плазме крови обожженных в начальный период болезни, видимо, связано с повышенной активностью протеолитических ферментов, а последующее повышение их содержания - с эффективностью проводимой терапии, регенерацией поврежденных тканей и улучшением синтетической функции печени [6].
Таблица 1. Содержание белка (г/л) и среднемолекулярных пептидов (г/л) в плазме крови больных с ожоговой болезнью (M±m, n = 10)
№ Состояние больного Белок СМП
1 Доноры 80,0±1,3 0,591±0,051
2 Больные:1 сутки 65,9±0,8 P < 0,001 0,948±0,062 P < 0,01
3 5 сутки 69,2±1,3 P < 0,001 2,618±0,160 P12 < 0,001
4 7 сутки 74,9±1,9 P < 0,01 2,745±0,190 P12 < 0,001
5 10 сутки 75,9±2,0 P < 0,01 2,886±0,086 Р < 0,001
Об ускорении протеолиза белков у больных с ожогами, в том числе белков плазмы крови, свидетельствуют данные, полученные при исследовании содержания СМП в плазме крови. Как видно из табл. 1, содержание СМП в плазме крови через сутки после термической травмы возрастает на 60 % по сравнению с контролем, что свидетельствует о развитии эндогенной интоксикации. По нашим данным степень интоксикации увеличивается с развитием ожоговой болезни. Так, содержание СМП в плазме крови на 5 сутки наблюдения возрастает в 4,4 раза, на 7-е сутки - в 4,6 раза, на 10 сутки - в 4,9 раза. Следует отметить, что с 7-го по 10-й день после ожога бывают наиболее выражены клинические признаки интоксикации (лихорадка, тахикардия, вялость, бессонница, отсутствие аппетита и др.). Полученные нами результаты по изменению содержания СМП в динамике ожоговой болезни согласуются с данными Филипповой и др. [9], которые также обнаружили рост содержания СМП в крови больных в течение двух недель после термической травмы.
Таким образом, у больных, перенесших ожог, наблюдается снижение общего белка плазмы крови на фоне резкого увеличения содержания СМП, причем наиболее интенсивный рост со-
держания СМП начинается с 5-х суток наблюдения. Поскольку параллельно с ростом СМП в крови увеличивается и содержание белка, можно предположить, что источником СМП являются не только белки крови, но и тканей, подвергшихся действию высокой температуры. Действительно, данные литературы указывают на то, что основная часть токсических продуктов возникает в результате распада белков, обусловленного разрушением тканей при воздействии высокой температуры, повышенной активностью протеолитических ферментов окружающих тканей и лейкоцитов при выраженной лейкоцитарной инфильтрации [6]. При этом усиленный распад белков интактных органов (печень, почки, поджелудочная железа, скелетные мышцы) развивается постепенно и становится выраженным на 7-8-е сутки после ожога. Как видно из табл. 1, именно в эти сроки болезни наблюдается наибольший рост СМП в крови.
Установлено, что СМП обладают высокой биологической активностью, и их эффекты зависят от молекулярной массы. Они обладают вазо-, кардио-, нейро- и иммунодепрессивными свойствами [10], оказывают ингибирующее действие на метаболические процессы [11; 12]. Показано, что некоторые фракции СМП, образующиеся в результате ожоговой травмы, оказывают прооксидантную роль, стимулируя процессы перекисного окисления липидов [13]. Возможно, что СМП участвуют также в стимуляции процессов окислительной модификации белков. С другой стороны, сами СМП могут образоваться при распаде белков, подвергшихся окислительному повреждению. Установлено, что окислительно модифицированные белки в 50 раз быстрее подвергаются протеолизу, чем нативные [14].
Исследование уровня одного из маркеров окислительного повреждения белков - карбонильных групп - позволило установить, что в крови обожженных наблюдается усиление окислительной модификации белков. Однако рост уровня окислительно модифицированных белков в плазме крови происходит на 5-е сутки болезни. Исходное содержание карбонильных групп в белках плазмы крови на 5-е сутки термической травмы возрастает на 34,5 %, а на 7-е сутки - на 52,6 % (табл. 2). В эти сроки ожоговой болезни чувствительность белков плазмы к окислительной модификации продуктами реакции Фентона in vitro также возрастает. Повышение количества карбонильных групп в белках при этом составляет 44,8 и 65,4 % на 5 и 7-е сутки соответственно.
Установлено, что металлкатализируемое окисление белков - это сайт специфический процесс, в который вовлекаются Н2О2 и Fe2+ в области металлсвязывающей поверхности белка [15]. Ионы железа фиксируются на металлсвязывающей поверхности белка. Комплекс Fe2-белок реагирует с Н2О2 и генерирует in situ радикал OH', который вызывает окислительную модификацию аминокислотного остатка в области металлсвязывающего участка белка. Это приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков белков, превращению их в карбонилпроизводные, потере белком функциональной активности. Из этого следует, что повышение степени окислительного повреждения белков, обнаруженное нами как в условиях in vivo, так in vitro у обожженных, связано с изменением аминокислотного состава или кон-формации циркулирующих в плазме крови белков, в результате чего на их поверхности увеличиваются места связывания для ионов железа.
Таблица 2. Интенсивность окислительной модификации белков (нмоль/мг белка) плазмы крови людей в динамике ожоговой болезни (M±m, n = 3-6)
№ Группа обследованных Исходное содержание карбонильных групп Накопление карбонильных групп в белках в присутствии Fe2+-H2O2
1 Доноры 1,71±0,10 34,4±0,9
2 Больные на 1-е сутки 1,50±0,10 38,7±1,9
3 5-е сутки 2,30±0,28 P1,3<0,001 49,8±2,5 P1,3<0,001
4 7-е сутки 2,61±0,28 P1,4<0,001 56,9±1,4 P1,4<0,001
5 10-е сутки 1,29±0,26 P1,5<0,001 30,6±3,1
Следует отметить, что на 10-е сутки ожоговой болезни содержание карбонильных групп в белках плазмы крови и скорость их накопления в модельной системе существенно снижаются.
Уменьшение степени окислительной деструкции плазменных белков в этот период, видимо, связано с их селективной протеолитической деградацией, а также синтезом новых белков.
Таким образом, на 7-е сутки после термической травмы существенно возрастает уровень окислительно-поврежденных белков в плазме крови.
Взаимосвязь окислительной модификации белков плазмы крови с интенсивностью генерации супероксиданиона в печени крыс при стрессовом состоянии, развивающемся вследствие ожоговой травмы, была изучена Артемьевой и др. [16]. Ими установлено, что к усилению окислительного повреждения белков при ожоговом стрессе приводит повышенная генерация активных форм кислорода нейтрофилами и макрофагами не только в крови и очаге воспаления, но и в микросомальной электронтранспортной цепи клеток печени.
Активация процессов окислительного повреждения белков плазмы крови при ожоговой болезни может быть результатом не только усиленного образования кислородных радикалов, но и следствием нарушения функционирования механизмов антирадикальной защиты тканей, в том числе и крови, с участием супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы, уменьшения содержания церулоплазмина [11].
Заключение
Результаты нашего исследования показывают, что значительный вклад в патобиохимиче-скую картину крови больных с ожогами ША-ШВ степени вносят процессы повреждения белков, выражающиеся в увеличении содержания СМП и усилении окислительной модификации в сроки наибольшей тяжести ожоговой болезни. Поскольку эти процессы взаимосвязаны между собой и, в свою очередь, со свободно-радикальными процессами, при разработке стратегии лечения ожоговой болезни следует учитывать положительный эффект антиоксидантной терапии.
Работа выполнена при поддержке ЦКП «Аналитическая спектроскопия», ГК № 16.552.11.7051 по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы».
Литература
1. Козинец Г.П., Слесаренко С.В., Шейман Б.С. Ожоговая интоксикация. Дифференцированные подходы к детоксикационной терапии // Электр. журнал. - 2003. - № 16-17, url: ttp://www.burn.ru/all/.
2. Kao C.C., Garner W.L. Acute burns // Plast. Reconstr. Saurg. - 2000. - Vol. 101. - P. 24822493.
3. Ward P.A., Till G.O. Pathophysiologic events related to thermal injury of skin // J. Trauma. -1990. - Vol. 30. - P. 75-79.
4. Parihar A., Parihar M.S., Milner S., Bhat S. Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury // Buvs. - 2008. - Vol. 34. - P. 6-17.
5. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. - СПб, 2006. - 400 с.
6. Алексеев А.А., Лавров В.А. Острая ожоговая токсемия // Российский медицинский журнал. - 1998. - № 2. - С. 41-43.
7. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. - 358 с.
8. Осипович В.С., Тупикова З.А. Сравнительная оценка экспресс-методов определения средних молекул // Лаб. дело. - 1987. - № 3. - С. 221-223.
9. Филиппова О.В., Шлык И.В., Полозова Е.В., Бурякова Л.В., Крылов П.К. Влияние пер-фторана на динамику эндогенной интоксикации у пострадавших с тяжёлой термической травмой // Анестезиология и реаниматология. - 2007. - № 3. - С. 55-57.
10. Волчегорский И.А., Тишевская Н.В., Кузнецов Д.А. Влияние «средних молекул», выделенных из плазмы крови интактных и обожженных животных, на клеточный состав культур эритробластических островков костного мозга // Вестник РАМН. - 2002. - № 2. - С. 30-36.
11. Рябинин В.Е., Лифшиц Р.И. Состояние и возможные механизмы нарушений кислород-зависимых процессов при ожоговой болезни // Вопросы медицинской химии. - 1990. - Т. 36, № 1. - С. 23-27.
12. Галактионов С.Г., Николайчик В.В., Юрин В.М., Михнеева Л.М., Бригер П.С., Козлов-
ская Е.В., Мазур Л.И., Цейтин В.М. Исследование протекторов, моделирующих повреждающее действие пептидов группы «средних молекул» на клетки крови // Хим. фарм. журнал. - 1991. -Т. 25, № 11. - С. 8-10.
13. Волчегорский И.А., Вальдман Б.М., Скобелева Н.А., Яровинский В.Г., Лифшиц Р.И., Зурочка А.В. О патогенетическом значении антиоксидантных свойств среднемолекулярных пептидов при термических ожогах // Вопр. мед. хим. - 1994. - № 2. - С. 28-32.
14. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262, № 20. - P. 9895-9901.
15. Stadtman E.E. Metal-ion catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Rad. Biol. and Med. - 1990. - Vol. 9. - P. 315-325.
16. Артемьева С.С., Близнецова Г.Н., Мухаммед З.Д. Окислительная модификация белков и генерация супероксиданиона при ожоговом стрессе у крыс // 9-я Межд. Пущинская школа-конф. молод. ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино-на-Оке, 2002. - С. 56.
Поступила в редакцию 30 августа 2011 г.
