CC BY
28
УДК 663.18; 573.6.086.835
ОГЛЯДИ
ОДНОРАЗОВА ФЕРМЕНТАЦ1ЙНА АПАРАТУРА
Ю. I. СИДОРОВ Нац!ональний ун!верситет «Львiвська пол!техн!ка» E-mail: sydorowy@rambler.ru
Наведено вщомост1 про шновацшний тип ферментацшно! апаратури — одноразов! пластиков! ферментери, як використовують у б1офармацевтичнш промисловост!, об'емом вщ дек1лькох см3 до дек1лькох м3. Пластиков! м!шки-ферментери постачають централ1зовано у стерильному вигляд!, що усувае проблеми багаторазового миття i стерил1зацИ апарамв на м1сщ (CIP/SIP). Незважаючи на шдвищення поточних витрат, пов'язаних i3 застосуванням достатньо дорогих пластикових фермен-терiв, каттальш вкладення в новi виробництва з новою апаратурою значно зменшуються, а отже, зменшуються й амортизацiйнi витрати та собiвартiсть продукци, що дае значний економiчний ефект. Розглянуто основш конструкци одноразово1 ферментацшно! апаратури — вщ пластикових пробiрок 24-Micro i Micro-Flask до промислових бiореакторiв з перем!шуванням «хвилею» або за до-помогою внутрiшнього iмпелера, який приводить у д!ю зовнiшне магнiтне поле.
Ключовi слова: одноразова ферментацшна апаратура, одноразовi пластиковi ферментери.
У 2007 р. один з1 св1тових л1дер1в у галуз! виробництва традицшно! i одноразово! ферментацшно! апаратури (ОФА) н!мецька ф1рма Sartorius AG п!сля об'еднання з фран-цузькою ф1рмою Stedim, яка спец!ал!зува-лась на виробництв1 1нших вироб1в одноразового використання (disposable, single-use), утворили альянс п!д назвою Sartorius-Stedim Biotech. Нова ф1рма з докризовим р1чним оборотом 660-680 млн. евро з1 штатом понад 2 300 прац!вник!в стала л1дером у виробництв1 ОФА для використання в б!офармацевтичн!й промисловост1 [1]. Це поставило крапку в суперечц! м1ж прихиль-никами нових i традиц1йних вид1в фермен-тац1йно! апаратури, що !х застосовують у ви-робництв1 л1карських засоб1в.
На початку впровадження технолог1й 1з застосуванням ОФА виникав певний сумшв. З одного боку, використання пластикових м1шк1в, як1 надходять на тдприемство з1 спец1ально! фабрики у гарантовано стерильному вигляд1, виключае процеси миття i сте-рил1зацИ (Cleaning in Place and Sterilizing in Place — CIP/SIP), що спричинюють до 80% виробничих проблем, пов'язаних 1з прове-денням ферментацшних процейв у стериль-них умовах у раз1 використання тра-
диц1йних культиватор1в. З 1ншого боку, м1шки, як витратний матер1ал, не е дешеви-ми, тому економ1чна доц1льн1сть не була очевидною.
Однак досвщ показав, що побоювання були марними. До цього висновку дшшли, зокрема, у британськш ф1рм1 Celliance Ltd., яка тривалий час працюе на ринку виробни-цтва моноклональних антит1л для д1агнос-тики з використанням 85 р1зних культур тваринних кл1тин [2]. Ф1рма досягла значно! економп за рахунок скорочення часу тдготовки ферментер1в (у 4 рази), що дозволило зб1льшити к1льк1сть виробничих цикл1в на 25-40% (залежно в1д масштабу); повного виключення браку; можливоста проведення ферментацш у звичайних, а не в чистих прим1щеннях; скорочення часу проведення валщацшних роб1т, не кажучи вже про економ1ю мийних розчин1в, чисто! води тощо.
Нав!ть зовн!шн!й вигляд фермен-тацшних в!дд!лень св!дчить про !х спрощен-ня завдяки використанню ОФА (рис. 1, 2).
Г. Сендстром, провщний шженер багато-проф!льно! транснац!онально! компанГ! Fluor, наводить так! м!ркування з! власного досв!ду: «Р!чн! витрати на використання
Бюреактор 1000 л, 1982 р.
Бюреактор 1000 л, 1994 р.
ОФА Xcellerex XDR-1000, сьогодш
Рис. 1. Зовшшнш вигляд ферментацiйних вiддiлень у pi3Hi роки [3]
Рис. 2. Вщдшення з виробництва вакцин за технолоиею FlexFactory компани Xcellerex [3]
одноразових м1шк1в об'емом 20 л становлять близько 20 тис. дол., у той час як для моб1ль-них i фшсованих емностей (традиц1йного типу — Авт.) вони дорiвнюють близько 40 тис. дол. У разi використання 200-л^ро-вих мшшв цi витрати майже не змшюються i становлять 21 тис. дол., тимчасом як для моб^ьних i фiксованих емностей ( вщповщ-но 62 тис. дол. i 80 тис. дол.». Вiн вважае, що ОФА е найоптимальнiшим ршенням у виробництвi лiкарськоi субстанцii у не-значних кiлькостях [3, 4].
Велике значення для формування су-спiльноi думки щодо ефективностi викорис-тання ОФА i одноразового обладнання мала публшащя [5]. У цiй статт на прикладi си-муляцiйних модельних процейв одержання моноклональних антитiл у 2000-л^ровому ферментерi традицiйного типу i в одноразовому пластиковому ферментерi було проде-монстровано, що використання ОФА зумов-люе зниження кашталоемност на 20%, що, у свою чергу, приводить до 8%-го зниження вартост товару.
Сьогодш мало хто мае сумшв щодо дощль-ност використання ОФА, але iнодi впрова-дження нових технологiй на конкретних
пщприемствах затримуеться внаслiдок того, що каттали вже ранiше були швестоваш в традицiйне обладнання через побоювання залежностi виробника вiд одного постачаль-ника витратних матерiалiв для ОФА, або через суто психолопчш мотиви (If it isn't broken, why fix it? — Навщо склеювати те, що не розбилось?).
На рис. 3 наочно показано переваги ОФА перед традицшними ферментерами з нержа-втчо! сталi.
Ще одна перевага ОФА — процес можна спостер^ати вiзуально, контролюючи рь вень пiни, змшу кольору культуральноi рщи-ни, ii каламутнiсть тощо. Такий контроль не можна порiвняти з вiзуалiзацiею процесу через оглядовi вiкна у стальних бiореакторах.
ОФА випускае не тальки фiрма Sartorius-Stedim Biotech (об'ем вщ 1 до 1 000 л), але й iншi компани, зокрема ATMI (вiд 50 до 1 000 л), GE Healthcare/Wave (вщ 1 до 1 000 л), Fisher HyClone (до 1000 л), Xcellerex (вщ 10 до 2 000 л) [6], а також Alfa-Laval (стльно з Fisher Scientific International Inc., HyNetics Corp. i HyClone), Applikon та ш. Деяку актившсть спостернають i в Росii.
-30% Electricity
Рис. 3. Переваги ОФА у використанш електроенергп, виробничого об'ему, стальних конструкцш, витрати води i мийних засобiв [Sartorius-stedim.com, 2009]
Так, Московський державний ун!верситет у 2008 р. запросив взяти участь у розм!щен-н! замовлень на постачання одноразових комплект!в обладнання для культивування кл!тин тварин ! м!кроорган!зм!в, причому емн!сний ряд ферментер!в становить в!д 2 до 50 л.
Проте ОФА мають ! деяк! недол!ки. Так, зокрема встановлено, що швидк!сть росту деяких вид!в холестеролзалежних кл!тин (cholesterol-dependent cells), як! !ммоб!л!зу-ються на пластику, знижуеться [7]. Окр!м того, внасл!док проблем з перем!шуванням ! в!дведенням тепла максимально можли-вий об'ем ОФА на сьогодн! — 2 000 л!тр!в; мае бути заплановано складське прим!щен-ня для збер!гання одноразових м!шк!в; недостатньо вивчена проблема вилугову-вання низькомолекулярних речовин з пластику.
Загалом ця практика довела придатн!сть ОФА для б!льшост! процес!в ферментац!!, ! високвал!ф!кованим роб!тникам б!льше не доводиться займатися прибиранням прим!-щень та очищенням обладнання.
Загальн! в!домост! про ОФА наведено в статт! А. Ю. Попова, представника компа-н!! Sartorius-Stedim Biotech (ТОВ «Эй Пи Интернэйшнл») [8]. Ще ран!ше була публ!-кац!я пров!дних фах!вц!в Sartorius, в як!й окреслено перспективи розвитку ОФА [9]. У пропонован!й читачев! статт! подано нов!шу, докладн!шу ! б!льш !люстровану !нформа-ц!ю, взяту з ориг!нальних каталог!в компа-н!й, з матер!ал!в конференц!! «Достижения науки и производственной практики», яку було орган!зовано Рос!йсько-Швейцарським учбово-науковим центром трансферу фарма-цевтичних ! б!отехнолог!й РХТУ !м. Менделеева, що проходила 2-3 березня 2010 р. у Москв!, та !нших джерел. Мова йтиме т!льки про власне ферментац!йну апарату-ру; !нфраструктурна апаратура (одноразов! р!динн! ! пов!трян! ф!льтри тощо) буде описана в наступн!й публ!кац!!.
Сьогодн! найб!льш м!н!атюрн! ОФА 24-Micro i Micro-Flask об'емом в!д 0,1 до 10 мл випус-кае ф!рма Applikon (рис. 4). Ц! б!ореактори призначен! для скрин!нгу ! тестування м!кроорган!зм!в ! кл!тин.
Дещо б!льшими за об'емом е одноразов! м!кроб!ореактори CultiFlask 50 ф!рми Sartorius-Stedim Biotech (рис. 5).
М!кроб!ореактор CultiFlask 50 призначе-ний для культивування р!зноман!тних м!к-роорган!зм!в, а також кл!тин рослин, тва-рин, у тому числ! ссавц!в. Кожен CultiFlask 50 мае кришку, що закручуеться. Газообм!н
Рис. 4. Мжробшреактори компанп Applikon
Рис. 5. Мжробшреактор CultiFlask 50
в!дбуваеться через 5 отвор!в р!зного д!амет-ра. Фторопластова мембрана, яка закривае ц! отвори, слугуе стерил!зуючим бар'ером, запоб!гаючи потраплянню всередину сто-ронньо'! м!крофлори, ! перешкоджае втрат води з живильного середовища, що може зм!нити концентрац!ю окремих компонен-т!в. Робочий об'ем б!ореактора становить 10-35 мл, тобто близько 40% в!д загального об'ему. CultiFlask 50 постачають стерильни-ми ! в!дразу ж готовими до роботи.
Ф!рма випускае також одноразовий, повн!стю з!браний ! готовий до використан-ня пол!карбонатний б!ореактор для ефек-тивного лабораторного культивування кл!тин тварин, моноклональних антит!л, б!омаси як пос!вного матер!алу модел! SuperSpinner D1000 об'емом в!д 200 мл до 8 л (рис. 6).
Головна особлив!сть ферментера SuperSpinner D1000 — наявн!сть мембран-но! м!шалки, яка дозволяе проводити керо-ване й ретельне перем!шування, а також без-пухирцеву аерац!ю, що виключае утворення п!ни. Принцип роботи мембранно! м!шалки полягае в тому, що на основу м!шалки намо-туеться низка пол!проп!ленових порожнис-тих волокон з нанопорами, кр!зь як! просо-чуеться аерац!йне пов!тря (рис. 7).
Рис. 6. Одноразовий ферментер SuperSpinner D1000
Типовий порт
Вих!д газу -
Живильно-транспортний
Вх!д газу
■ Банка культиватора
Мембранний перем!шувач
■ Трубка
Рис. 7. Принципова схема SuperSpinner D1000
Схожу продукц!ю об'емом 5 ! 14 л п!д назвою CelliGen™ BLU виробляе компан!я New Brunswick Scientific's. Н!мецька ком-пан!я DASGIP AG та Г! американська ф!л!я DASGIP BioTools LLC випускають лабора-торн! ОФА об'емом в!д 0,4 до 5 л, при цьому одночасно можна проводити досл!дження у восьми б!ореакторах (Parallel Bioreactor System the Mobius CellReady).
Швейцарська компан!я INTEGRA Biosciences AG випускае одноразов! двокамерн! б!ореактори типу CELLine об'емом 350 ! 1 000 мл для лабораторного б!осинтезу мо-ноклональних т!л у г!бридом!, рекомб!нант-них протеТшв, в!рус!в, культур кл!тин висо-ко! густини (CELLine CL 350, CELLine CL 1 000, CELline AD 1000) (рис. 8).
Особлив!стю цих ОФА е те, що б!ореак-тор складаеться з двох камер. У верхн!й м!с-титься розчин з живильним середовищем, а в нижн!й — культуральна р!дина. Камери розд!ляе нап!впроникна ацетатцелюлозна мембрана, кр!зь яку безперервно дифунду-ють поживн! речовини ! виводяться продук-ти метабол!зму. Передача газу зд!йснюеться
Рис. 8. Одноразовий бшреактор типу CELLine
через сил!конову мембрану, яка розташова-на внизу робочо! камери (рис. 9).
Зауважимо, що CELLine AD призначена для культивування кл!тин, яким необх!дна !ммоб!л!зац!я на поверхнях (anchorage-dependent cells).
П!онером у технолог!! ОФА, зг!дно з якою як емн!сть використовують одноразову плас-тикову м!стк!сть у вигляд! м!шка, е ф!рма Wave Biotech AG, що була заснована в 1999 р. в Тагельсванген! поблизу Цюр!ха. Матер!ал м!шка е багатошаровим. Наприклад, ма-тер!ал м!шк!в BIOEAZE® Bags ф!рми SAFT, яка входить в корпорац!ю Sigma-Aldrich Corp., складаеться з шар!в пол!етилену низь-ко! густини (ПЕНГ), пол!етиленв!н!лового спирту, знову ПЕНГу !, нарешт!, з шару пол!в!н!лацетату. Можлив! р!зн! вар!анти.
Виробник постачае м!шок гарантовано чистим ! стерильним з в!дпов!дним сертиф!ка-том якост!. В!н споряджений ф!льтрами вх!д-ного ! в!дпрацьованого пов!тря або газу, а та-кож пристроями для асептичного пос!ву, в!дбирання проб, збирання врожаю культури, датчиками контролю. М!шок розташовують на спец!альн!й платформ! з нержав!ючоТ стал!. Платформа, що розгойдуеться !з заданою частотою ексцентриком у вертикальн!й площин!, створюе хвилепод!бний рух живильного сере-довища усередин! пластикового м!шка. У результат! забезпечуеться ефективне перем!шу-вання за дуже м'яко! динам!чноТ д!! на культуру м!кроорган!зм!в або кл!тин (рис. 10).
Камера живильного Продукти середовища
метабол!зму
Нашвпрониклива мембрана
О Кжтини
Протеши
Сил!конова мембрана
О,^- ^ СО,
Рис. 9. Схема роботи двокамерного бшреактора
Клапан регулювання
тиску В1дпрацьо- t ване повiтря
Одноразовий мiшок
Ф1льтр вхiдного повiтря
Вхiд повiтря
Коливальний рух
Культуральна рiдина
Опорний штифт
Основа
Рис. 10. Схема перемшування культурально*1 рщини в ОФА компанп Wave Biotech [10]
Компашя Wave Biotech AG сама e вироб-ником низки ОФА з об'емом мiшкiв вщ 2 до 1000 л (рис. 11), але з 2007 р. вона вже дie як дочiрня компашя фiрми GE Healthcare.
System 2/10
ä ш
System 20/50 System 500/1000
Рис. 11. Pi3Hi об'еми ОФА компанп Wave Biotech AG
Найб^ьш вiдомими i досконалими ОФА е ферментери Biostat CultiBag RM компанй Sartorius-Stedim Biotech, однак слщ заува-жити, що принцип дп ОФА шмецько-фран-цузсько'' фiрми заснований на технологи швейцарсько'' компанп Wave Biotech AG.
Платформу Biostat CultiBag RM обладна-но системою управлшня кутом i швидкiстю коливальних рухiв, системою термостату-вання, а також вбудованим компресором для аерацп культури. Вона пщключаеться до блоку управлшня i3 сучасною цифровою системою управлшня DCU-3. Останню спецiально розроблено для керування рiзно-манiтними процесами ферментацп i вона вважаеться св^овим еталоном.
ОФА Biostat CultiBag RM може бути в трьох модифшащях: Basic, Optical, Perfusion. Модифшащя Basic включае одноразовi мiшки, спорядженi ф^ьтрами вхiдного i вiдпрацьованого повiтря, шлангами для асептичного внесення добавок i вщбору проб, а також датчиками температури й тиску. В модифiкацii Optical мшки додатково за-безпеченi одноразовими датчиками рН i кон-центрацп розчиненого кисню. У модифiкацii Perfusion мшки мiстять вбудований фiльтр,
що обертаеться, з розмiрами пор 1-2 мкм для утримання культури всередиш мшка i вщ-ведення продуктiв метаболiзму.
Ферментери Biostat Cultibag RM випус-кають трьох типорозмiрiв: лабораторний, шлотний i промисловий. На рис. 12 показано лабораторний варiант Biostat Cultibag RM 2 з одноразовими емностями загальним об'емом 2 л.
Рис. 12. Лабораторний BapiaHT Biostat Cultibag RM
На рис. 13 зображено варiант ферментера Biostat Cultibag RM для роботи з кл^ина-ми тварин, рослин i комах.
Рис. 13. BapiaHT ферментера Biostat Cultibag RM для роботи з кл^инами тварин, рослин i комах
Шлотний BapiaHT Biostat Cultibag RM 20/50 застосовують як для наукових досль джень, так i для виробництва в невеликому масштабь Мiшки для ще1 серп ОФА мають об'ем вщ 10 до 50 л (рис. 14, 15). Пpомисловi вapiaнти ферментера Biostat Cultibag RM 100/200 мають загальний об'ем 100 або 200 л.
Рис. 14. Шлотний ферментер Biostat Cultibag RM 20/50 (20 л)
Рис. 15. Шлотний ферментер Biostat Cultibag RM 20/50 (50 л)
Лабораторну i тлотну ОФА (до 50 л) на платформах Appliflex, що гойдаються, ви-пускае також компашя Applicon (рис. 16).
На рис. 17 показано одноразовий мшок Flexboy. Мшки створено для одержання, зберпання i транспортування бюфармацев-тичних pозчинiв, пpомiжних продуктав i великих пapтiй готових продукйв. Об'ем мiшкiв — вщ 50 мл до 50 л.
Бiльшi партп pозчинiв (100-1 000 л) го-тують у мшках Flexel 3D (рис. 18), яш встановлюють у каркаси типу Palettank (рис. 19).
На рис. 20 наведено зовшшнш вигляд стерильного мшка з пiд'еднaними портами.
Рис. 16. Лабораторна ОФА компанп Applicon
Рис. 17. Одноразовий мшок Flexboy
Рис. 18. Одноразовий мшок Flexel 3D
Рис. 19. Каркас Palletank для мпшшв
Рис. 20. Мшок з шд'еднаними портами
Конектори male i female luer («хлоп-чик-дiвчинка») з портом вщбору проб не по-требують використання голок, дають змогу легко i зручно працювати з конектором, виключають помилку при з'еднаннi. Mrni-три-клампи (санiтарнi фланцi), якi часто використовують у промисловостi для без-печного з'еднання, дають можливiсть максимально широко застосовувати там мшки у бюфармацевтичнш промисловостi.
Cпецiальним конектором, який постача-ють у комплекта з виробами Sartorius Stedim Biotech, а також як самостшний пристрш для з'еднання двох окремих компонентав, що були попередньо простерилiзованi, е од-норазовий конектор OPTA SFT-I. Його мож-на використовувати у вйх операцiях i на стадiях одержання й видiлення цiльового продукту, в яких застосовуеться одноразове обладнання.
На рис. 21 показано конектор OPTA SFT-I i порядок його застосування.
Для стерильного зварювання i роз'еднан-ня пластикових трубок дiаметром вiд У'' до %," використовують спещальш пристро'1 BioWelder™ i BioSealer™ (рис. 22). Зварювання вщбуваеться в автоматичному режим1 навiть за умови, якщо трубки заповнеш рщиною.
Рис. 21. Конектор OPTA SFT-I
Рис. 22. Пристро'1 BioWelder™ i BioSealer™
У процесi виробництва лшарських суб-станцiй та iнших бютехнолопчно важливих продуктiв зберiгаються сировина i натвпро-дукти в технологiчних емностях.
Традицшно 'х виготовляють з високо-яшсно! полiрованоi нержавтчо! сталi з1 складною обв'язкою для миття i стерилiза-цii, а також забезпечення асептики процейв наповнення, спорожнення i вiдбору проб. Ц1 емностi мають високу вартасть i потребують складно'' валщацп процесiв ''х миття i сте-рилiзацii. Cьогоднi такi емност можна замiнювати одноразовими пластиковими контейнерами, ям встановлюють у жорстш несучi конструкцii. Розмiрний ряд таких контейнерiв — вiд 1 до 3 000 л.
Для ще'1 мети компашя Sartorius Stedim Biotech випускае одноразовi змшувач^ у виготовленнi яких застосовують найнови-нiшу патентовану технолопю LevTech. Ц1 змiшувачi одержали назву Single Use Mixing LevTech Disposable Mixing System. Установки призначеш для змшування рiзноманiт-них стерильних компонентав у виробництв1 лiкарських засобiв, зокрема компонентiв живильного середовища для ферментерiв. Вони можуть застосовуватись для змшуван-ня як рiдких, так i сипких компонентiв. Пе-ремшування здiйснюеться одноразовим iмпелером (рис. 23).
2
1 — магнгтний левггатор;
2 — одноразовий пластиковий Гмпелер (шар м1шка не показано)
1 — одноразовий м1шок;
2 — пластина, що пов'язуе Гмпелер i магнггний лев1татор, з вир1внювальним штифтом
3 — тепловий розд1лювач
4 — надпровгдник
Рис. 23. Перемшувальний пpистpiй LevTech для приготування живильних середовищ для ОФА (одноразовий мшок встановлено в корпус з нержав^чо!" стaлi)
Раму, на якш розташовують одноразовий контейнер у каркай, встановлюють на промисловГ ваги, споряджеш принтером. Це дозволяе швидко i з великою точшстю дода-вати компоненти, що змГшуються, а також документувати процес приготування сумшь Останшм часом компанiя Sartorius Stedim Biotech розпочала випуск ново! серп великогабаритних ОФА BIOSTAT CultiBag STR 200 та BIOSTAT CultiBag STR 200 Plus, як вГдрГзняються системами контролю. КрГм того, BIOSTAT CultiBag STR 200 Plus може бути в подвшнш версп (рис. 24). Обид-ва типи призначено передуйм для культиву-вання клГтин ссавщв i комах, але у спеща-льнш версiï !х можна використовувати для культивування будь-яких мiкроорганiзмiв.
МшГмальний об'ем BIOSTAT CultiBag STR 200 — 50 л, максимальний — 280 л. Найближчим часом плануеться довести об'ем до 1 000 л. 1ншГ техшчш показники цих ОФА поки що не опублшоваш, а тому е комерцшною i техшчною таемницею.
Бiореактори HyClone розробленi також спецiально для культивування клГтин ссав-щв (у тому числГ на мшронойях та у вигляд1 суспензiй) i е незамшними у виробництвГ ль карських препаратав (наприклад, вакцин, антибютишв), тд час проведення досль джень у галузГ бiохiмiï, iмунологiï тощо (рис. 25).
Уй поверхш, що контактують з культу-ральною рщиною (КР), наприклад внутрГш-ня поверхня емноста, барботер, трубки тдве-
Рис. 24. BIOSTAT CultiBag STR 200
1
дення/в!дведення р!дин ! газ!в, покривають одноразовими м!шками. Важливим елемен-том тако! одноразово! конструкц!! е пласти-ковий (пол!етиленовий) !мпелер, з'еднаний !з зовн!шн!м мотором.
Рис. 25. Вертикальний бшреактор 3i вкладеними одноразовими мишками типу HyClone
Сьогодн! Hydone випускае ОФА об'емом 50, 100, 250, 500, 1 000 ! 2 000 л (плануеть-ся довести об'ем до 10 000 л), причому м!н!-мальний робочий об'ем дор!внюе половин! загального. Ус! емност! мають подв!йн! ст!нки (оболонки) для управл!ння темпера-турним режимом шляхом подач! охолоджу-вально!води.
На рис. 26 ! 27 подано зовн!шн!й вигляд найб!льшого ОФА (2 000 л) ! одноразов! м!шки, як! випускае компан!я Xcellerex (США).
ОФА використовують не т!льки в пер!о-дичних системах ферментацп, але й для без-перервних процес!в. На рис. 28 показано об-ладнання для проведення безперервних процес!в з рециркуляц!ею 20% одержано! б!омаси.
Безперервний процес залежно в!д масштабу виробництва тривае 19-28 д!б з в!дби-ранням врожаю протягом 12-22 д!б, п!сля чого проводять зам!ну м!шк!в. У процес! ви-користовують пневматичну центрифугу си-стеми CentriTech® з одноразовими стериль-ними вкладками [10-11].
Рис. 26. Бшреактор XDR2000
Рис. 27. Одноразовi мишки для бiореакторiв Xcellerex
Корпорац!я Centocor R&D, Inc. також застосовуе безперервний процес вирощуван-ня кл!тин з рециркуляц!ею б!омаси за так званим процесом ATF System (Alternating Tangential Flow) [12]. Зг!дно з технолог!ею в ОФА (в!д компанп Hydone) пост!йно пода-ють живильне середовище, пер!одично КР уводять в камеру пневматичного д!афрагмо-вого насосу, який згодом прокачуе п у зво-ротному напрям!, але при цьому КР тангенц!ально контактуе з поверхнею одноразового перфуз!йного ф!льтра, внасл!док чого частина нативного розчину проходить ф!льтр ! виводиться з установки як продукт, що м!стить ц!льов! протеши. Процес припи-няють п!сля досягнення вм!сту кл!тин в КР 40-150 г/л.
вмтсть для охолодження i зберiгання врожаю культури
ОФА XDR-1 000 (робочий об'ем 1 000 л)
Система приготування живильного середовища
Центрифуга безперервно! дп Система контролю ТТТяфи з одноразовими
Centritech Cell I завантаження рециркуляту м!шками нЯ 1 000 л
i живильного середовища
Рис. 28. Обладнання компанп Xcellerex для проведення безперервного процесу ферментацп
з використанням ОФА
Ус!м великогабаритним ОФА притаман-ний недол!к — проблемне перем!шування !мпелером, який встановлений внизу ! тому не весь об'ем культурально! р!дини ефектив-но перем!шуеться. Прив!д !мпелера — маг-н!тний з використанням надпров!дник!в. Отже, перем!шування е техн!чно складним, з низьким коеф!ц!ентом масопередач! за киснем Коб. Цим недол!ком можна знехтува-ти, якщо йдеться про культивування кл!тин з малою питомою швидк!стю росту (рос-линн!, тваринн! кл!тини), але п!д час куль-тивування м!кроорган!зм!в цей недол!к стае вже досить пом!тним. Можливо, тому в ОФА компанп Hydone або Xcellerex засто-совують звичайний перем!шувальний при-стр!й з уведенням штоку м!шалки зверху по д!агонал!, але при цьому виникають пробле-ми з !золяц!ею м!шалки в!д довк!лля.
Сьогодн! компан!! АТМ1 LifeSciences (у частин! розроблення багатошарово! пл!вки ТК8, яку стерил!зують у-опромшю-ванням, ! системи перем!шування), PIERRE GUERIN-BIOLAFITTE (розроблення б!оре-актора в ц!лому ! системи контролю) ! ARTELIS (оптим!зац!я процес!в фермен-тац!!) анонсують, не розкриваючи техн!чних подробиць, нов! ОФА тип!в Nucleo-50 (об'ем в!д 25 до 600 л) ! Nucleo-1000 (в!д 250 до 1 200 л), а також новий спос!б перем!шуван-ня за технолог!ею Pad-Drive™. Цей спос!б передбачае комб!нац!ю лопатево! м!шалки ! ерл!фта, який дозволяе зб!льшити Коб, а в!дтак ! продуктивн!сть б!ореактор!в [13]. За цим способом аерац!йний газ, що надхо-дить у м!шок, одночасно обертае лопатеву м!шалку.
На рис. 29 ! 30 показано загальний ви-гляд Nucleo™-50 ! схематичну будову б!оре-актора.
Проблему перем!шування компан!я Cellexus Ltd (Кембридж, Велика Британ!я, www.cellexusbiosystems.com) вир!шуе просто: ОФА ц!е! компан!! взагал! не мають меха-н!чних пристро!в для перем!шування, зам!сть них використовують просту ! дешеву ерл!фтну систему (рис. 31). Проте, як ! будь-яким ферментерам з ерл!фтом, !м прита-манн! недол!ки — низький коеф!ц!ент масопередач! за киснем та !нтенсивне п!но-утворення.
Рис. 29. Зовшшнш вигляд Nucleo™-50
Рис. 30. Схематична будова Nucleo™-50:
1-4 — мультипорти (можуть бути використаш для завантаження живильного середовища, вхо-ду/виходу газiв, посiвного матерiалу, кислоти тощо); 5-8 — резервн порти; 9 — одноразовий мшок; 10 — порт для ввдбору проб; 11-14 — ко-нектори; 15 — аератор з мшроотвором (20 мкм) або макроотвором (2 мм); 16 — веслоподiбний пе-ремшувальний пристрiй у рукавнiй оболонц1 (2-110 об/хв); 17 — вхвд аерацшного газу
Рис. 31. ОФА CellMaker Regular компанп Cellexus Ltd
У 2006 р. в США запатентовано новий цшавий i простий спойб перемiшування в ОФА, який заявлено фiрмою Hoffman, Warnick & D'Alessandro LLC [14]. Суть способу, який названо Twistaferm, полягае в тому, що каркас з одноразовим пластиковим мшком встановлюють на платформу, яка приводиться в дт ексцентриком i може здiйснювати обертовий рух за i проти ходу
годинниково'' стрiлки без рiзкоi змiни ходу. Внаслщок цього вмiст мiшка м'яко пе-ремiшуеться. Один двигун може приводити в дт декiлька платформ (рис. 32).
Назад i вперед
ТГ
Платформа Шпиндель
I
=1 ''
□1
Напрям ходу 1
IF^F1
BioB i точка опори I
Рис. 32. Схема перем1шування культурально'1 р1дини в ОФА за допомогою ексцентрика
Такий тип ОФА дозволяе, по-перше, просто i надiйно iзолювати культуральну рь дину (КР) вщ довкiлля; по-друге, завдяки можливост одночасно'' ферментацii в дешль-кох (до п'яти) ферментерах виршити проблему збiльшення масштабiв виробництва.
Проблему ефективного i м'якого перемь шування в ОФА, ймовiрно, може розв'язати також спойб, який застосовуеться в метале-вих газово-вихрових ферментерах (ЗАТ «Са-яни», Новосибiрськ) [15, 16]. У цих ферментерах перемшування культурально'' рiдини здiйснюеться шляхом створення в рщкому середовищi тривимiрного руху типу «вихро-ве обертальне шльце», при цьому перемь шуеться не рiдина, а газовий простар над КР. Рух генеруеться аерувальним газовим вихо-рем за рахунок перепаду тиску над поверхнею i сили тертя пов^ряного потоку об поверхню суспензп. Такий спосiб перемшування, яко-му не притаманнi недолши механiчного перемiшувального пристрою та ерлiфта,
запатентовано в вврот (№ 112460) i США (№ 6632657) [17]. Перевагою його е й те, що ефектившсть перемшування не залежить вщ в'язкостi культурально'' рiдини. Вважа-ють також, що в технологи виробництва вакцин газово-вихровi ферментери можуть замшити ролерш технологii вирощування особливо чутливих до мехашчного подраз-нення клггин, зокрема ембрiональних тiлець
з культури ембрюнальних клiтин людини лiнii hESМО3, мононуклеарно'' фракцii кль тин шсткового мозку донора, яку вирощено на нойях (як у хайклонiвських ОФА) [18].
Б^ьш докладну iнформацiю про однора-зовi системи для бютехнолопчних процесiв, зокрема приклади 'х застосування, можна знайти в [19-27].
Л1ТЕРАТУРА
1. Lewcock А Sartorius Stedim Biotech born, 2007. — http://www.in-pharmatechnologist.com/ Processing QC/Sartorius-Stedim-Biotech-born.
2. Wilson J. S. A Fully Disposable monoclonal Antibody Manufacturing Train // BioProcess International, June 2006. — http://www.biore-searchonline.com/ download.mvc/Feature-Article-A-Fully-Disposable-Monoclonal-0001.
3. Galliher P. M. Turnkey Modular Disposable Vaccine Production Plants.// IABS: New Cells for New Vaccines III: From Lab Bench to Clinical Trials. ( 28 September — 1 October 2008. Hotel du Pont, Wilmington, Delaware, USA. — https://www.regonline.com/custImages/ 244811/NCNV%20In/Day...07/Parrish%20 Galliher.pdf.
4. D'Aquino R. Disposable equipment: A mainstay in bioprocessing // Chemical Engineering Progress. — 2002. — November. — http://www.allbusiness.com/ business-plan-ning/1030552-1.html.
5. Sinclair A., Monge M. Quantitative economic evaluation of single use disposables in bioprocessing // Pharmaceut. Eng. — 2002. — V. 22. — P. 20-34.
6. Mintz С. Single-Use, Disposable Products: A «State Of The Industry» Update // Life Sci. Leader. — 2009. — N 7. — http://www.life-scienceleader.com/ index. php?option =com_jambozine&layout=article&view=page &aid=3856&Itemid=56.
7. Ultee M. E. Single-Use Components in Bio-pharmaceutical Manufacturing: Opportunities Outweigh Objections // PharmPro. — 2009. — N 2. — http://www. pharmpro. com/ Articles/2009/03/Objections-Overruled!/
8. Попов А Ю. Новый подход к управлению рисками при производстве ЛС. http://www.gmpnews.ru/2009/09/novyj-podx-od-k-upravleniyu-riskami-pri-proizvodstve-ls/.
9. DiBlasi K., Jornitz M. W., Gottschalk U, Priebe P. M. Disposable Biopharmaceutical Processes — Myth or Reality? // Supplement to: Intern. BioPharm. — 2006. — N 11. — Р. 6-16.
10. Vijay Singh. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation // Cytotechno-logy. — 1999. — V. 30. — P. 149-158.
11. Scale-Up to 1000 L Perfusion Cell Culture in a Disposable Stirred-Tank Bioreactor // Appl. Brief. -2008. — April 7. — www.xcellerex.com.
12. ATF Technology. — http://www.refinetech. com/atf-technology.php
13. Nucleo™: The Next Generation Single-Use Bioreactor. — http://www.dci-bio.com/ products/single-use/nucleo50.asp
14. Pat. 20060019376 US C12M1/02. Fermentation chamber and mixing apparatus / Bungay H. R., Bungay J. S., Sigsby J. G. — Filing Date: 07/21/2005; Publication Date: 01/26/2006.
15. Мертвецов Н. П, Рамазанов Ю. А., Репков А П. и др. Газовихревые биореакторы «Биок». Использование в современной биотехнологии. — Новосибирск: Наука, 2002. — 118 с.
16. Кислых В. И., Рамазанов Ю. А., Косюк И. П. и др. Безградиентные газо-вихревые биореакторы в современной биотехнологии // Интеграл. — 2005. — Т. 22, № 2. — С.78-89.
17. Pat. 6632657 US C12M1/04; C12M1/06; C12M3/02; C12M1/04. Apparatus for cultivating tissue cells and microorganisms in suspension / Kislykh V. I., Ramazanov J. A., Repkov A. P. (all RU). — Filing Date: 03/19/2001; Publication Date: 10/14/2003.
18. Сусский Е. В., Ярцев С. Н., Михеев В. М. и др. Замена роллерных технологий при промышленном производстве вакцин и других лекарственных препаратов // Пятый Моск. междунар. конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития», Москва, 16-20 марта, 2009. — http://www.bioreactor.ru/files/0002.doc
19. Terryberry J. W., Thor G. Biodisposables: Utility and Technological Advances // Report 9215, June 2006. — http://www.bio-portfolio. com / cgi-bin / acatalog/ 9215_Disposables.pdf.
20. Pierce L. N., Shabram P. W. Scalability of a Disposable Bioreactor from 25 L-500 L Run in Perfusion Mode with a CHO-Based Cell Line: A Tech Review // BioProcessing J. — 2004. — July/Aug. — Р. 51-56.
21. DeFife K., Leigh Pierce L. Versatility of a Single-Use Bioreactor Platform for Culture of Diverse Cell Types // BioPharm Intern. —
2009. — V. 22, N 2. — www.biopharminter-national.com.
22. Cohee D, Singh V. A Novel Disposable Mixing Technology // Gen. Eng. News. — 2005. — V. 25, N 14. — http://www.paci-ficgmp.com/Resources/Scientific_ Articles.php.
23. Fox S. Disposable BioProcessing: The Impact of Disposable Bioreactors on the CMO Industry // Contract Pharma. — 2005. — V. 7, N 5. — P. 62-74.
24. Ohashi R., Singh V., Hamel J.-F. P. Perfusion Cell Culture in Disposable Bioreactors. — Paper presented at 17th European Society for Animal Cell Technology Meeting, 2001,
June 10(14, Sweden (6 page). — http:// www.pacificgmp.com/Files/Perfusion_Cell_ Cuture.pdf
25. Singh V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation // Cyto-technology. — 1999. — V. 30. — P. 149-158.
26. Ransohoff T. The Use of Disposable and Alternative Purification Technologies for Biopharmaceuticals / / IIR Biopharma-ceutical Production Conference, July 22, 2005. — www.bioprocessconsultants.com.
27. Sinclair A., Monge M. Biomanufacturing for the 21st Century: Designing a concept facility based on single-use systems // BioProcess Intern. — 2004. — N 10. — P. 2-9.
ОДНОРАЗОВАЯ ФЕРМЕНТАЦИОННАЯ АППАРАТУРА
Ю. И. Сидоров
Национальный университет «Львовская политехника»
E-mail: sydorowy@rambler.ru
Приводятся сведения об инновационном типе ферментационной аппаратуры — одноразовых пластиковых ферментерах, которые используют в биофармацевтической промышленности, объемом от нескольких см3 до нескольких м3. Пластиковые мешки-ферментеры поставляются централизованно в стерильном виде, что снимает проблемы многоразовой мойки и стерилизации аппаратов на месте (CIP/SIP). Несмотря на повышение текущих расходов, связанных с применением достаточно дорогих пластиковых ферментеров, капитальные вложения в новые производства с новой аппаратурой значительно уменьшаются; следовательно, уменьшаются амортизационные расходы и себестоимость продукции, что дает значительный экономический эффект. Рассмотрены основные конструкции одноразовой ферментационной аппаратуры — от пластиковой пробирки 24-Micro и Micro-Flask до промышленных биореакторов с перемешиванием «волной» или с помощью внутреннего импеллера, который приводится в действие внешним магнитным полем.
Ключевые слова: одноразовая ферментационная аппаратура, одноразовые пластиковые ферментеры.
DISPOSABLE FERMENTATION FACILITIES
Yu. I. Sidorov
National University «Lviv's polytechnica»
E-mail: sydorowy@rambler.ru
Information on the innovative type of fermentation facilities namely disposable plastic bioreactors used in biopharmaceutical industry in size from a few cubic centimeters to some cubic meters is given. Plastic bag-bioreactors are supplied centrally in sterile packaging that takes off the problems of the multiple washing and sterilization of the apparatus in place. In spite of current costs increasing due to using of the considerably expensive plastic bioreactors, capital investments in new productions with new facilities decrease considerably; therefore, depreciation costs and production price are falling off and results in a considerable positive economic effect. The basic constructions of disposable fermentation facilities (DFF) are considered — from a plastic test tube 24-Micro and Micro-Flask to industrial DFF with wave action or by an internal impeller that is set going under the external magnetic field.
Key words: disposable fermentation facility, disposable plastic fermenter.
