CC BY
27
УДК 577.1:619
Федець О.М., к.с.-г.н., доцент (olehfedets@yahoo.com), Макух С.М., к.б.н.,
доцент, Вигнан Д.С., к.б.н., доцент, Красневич А.Я., к.б.н., доцент © Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та б1отехнологт
iмет С.З.Гжицького
ОХРАТОКСИН ТА ГЛУТАТ1ОН-ЗАЛЕЖН1 ЕНЗИМИ
В оглядi узагальнет дат про мехатзми еплиеу охратоксину на глутатiоноеу систему оргатзму теарин та захисну роль щeï системи.
Ключовi слова: охратоксин, глутатюн, глутатiонтрансфераза, глутатюнпероксидаза, глутатюнредуктаза.
Охратоксин (ОТ) потрапляе в оргашзм тварин при згодовуванш rapMÎB уражених грибами (Penicillium verrucosum Dierckx та Aspergillus ochraceus Berkeley & Curtis [25]), що виробляють цей токсин. Виявлено кшька форм та похщних ОТ [17, 25, 39], найпоширешший з них е ОТА.
Шсля всмоктування у верхшх вщдшах шлунково-кишкового тракту ОТА в плазмi кровi зв'язуеться з альбумшом. У альбумiн-дефiцитних щурiв концентрацiя ОТА в жовчi та сечi i швидюсть його екскреци у цих рщинах була у 20-70 разiв вища, нiж у нормальних щурiв. Тобто, альбумiн затримуе лiквiдацiю ОТА, обмежуючи його поступлення в печiнковi та нирковi клiтини [21].
Спорщнешсть до ОТА бiлкiв плазми кровi у рiзних видiв органiзмiв рiзна. ОТВ легше виводиться з кровi та мае меншу спорiдненiсть до бшюв плазми кровi, що частково може пояснити його меншу токсичшсть [16]. У людини ОТА мае меншу спорщнешсть до a-, ß- та у-глобулмв нiж до сироваткового альбумiну [40].
Бiльшiсть ОТА з током кровi потрапляе у печшку. Тут вiн пiддаеться бiотрансформацiï [44] або в менш токсичнi 4R- та 48-гщроксипохщш, або в форму хшону (ОТР) та гiдрохiнону (OTHQ). Швидюсть формування 4R- та 4S-гiдроксиОТА була лiнiйна протягом 10 хвилин при вщсутност глутатюну (GSH) i залежала вiд концентрацп бiлка та наявностi NADPH. У термiчно денатурованих мiкросомах цi процеси не вiдбуваються. У присутностi GSH (5 мМ) швидкiсть реакцiï була щентична, але реакцiя була лшшна протягом 40 хвилин, що свщчить про захисний ефект GSH. Проте не виявлено утворення кон'югаив GSH, а також формування 10-гщроксиОТА, який утворювався при метаболiзмi ОТА у мжросомах печiнки кроля. При шкубацп мiкросом печiнки з глутатюнтрансферазою (GST), NADPH та GSH (5 мМ) не спостерiгали утворення метаболтв крiм 4R- i 4S-гiдроксиОТА. Пвд дiею пероксидаз також не спостер^али утворення метаболiтiв ОТА. Тобто, припускають, що цi двi ензиматичнi системи мають лише дуже малу потужшсть до бiотрансформацiï ОТА. OTQ може ковалентно зв'язуватись з GSH з утворенням кон' югату OTQGSH, що веде до виснаження кл^инного GSH та збшьшуе токсичнiсть ОТА. Тобто, ОТА реагуе з
© Федець О.М., Макух £.М., Вигнан Д.С., Красневич А.Я., 2011
466
GSH [11]. Також OTHQ i OTQ здатш викликати пошкодження шляхом алюлування/вщновлення, що е одним з шляхiв окисного пошкодження токсином [13]. Може утворюватись i бшьш токсичний лактон вiдкритий ОТА [17]. GSH ввдграе, головним чином, захисну роль проти реактивних метаболтв, якi вiн зв'язуе i, таким чином, поглинае. У свою чергу, багато хiмiчних сполук демонструють тдвищену токсичнiсть, коли рiвень GSH е вичерпаний [10]. Проте е i протилежш даш, якi показують, що в умовах in vitro пониження рiвня GSH незначно збiльшуе цитотоксичшсть iндуковану ОТА, але механiзми залучеш в зниження токсичностi, що наступае при виснаженнi GSH, ще нез'ясоваш [12].
Формування та виведення ендогенних кон'югаив i ксенобiотикiв з GSH мають життево важливе значення в детоксикаци i клiтинному гомеостазi. Широка субстратна специфiчнiсть насосу експорту кон'югаив дозволяе видаляти безлiч сполук, як формуються у I i II фазах метаболiзму ендогенних речовин i ксенобютиюв в гепатоцитах. Ця система експорту в гепатоцитах включае локалiзований в латеральнiй мембраш MRP1 та в апiкальнiй мембраш MRP2. Експресiя останнього зменшена у щурiв при холестазi, що свщчить про регуляцiю цього бiлка при патологи [19]. При холестазi понижений i рiвень GSH печiнки [27].
Як вщомо [38], при охратоксикозi уражуеться печiнка, що, зокрема, проявляеться в пониженш синтезу альбумiну, рiвень якого в сироватцi кровi стае менший, як i загального бшка. Також в сироватцi кровi буде пщвищена активнiсть амiнотрансфераз, що е маркерами руйнування гепатоцитiв.
У морсько! свинки за ди ОТА концентращя загального бiлка сироватки кровi зменшилась iз 53,3 до 50,0 г/л, альбумiну з 29,60 до 28,98 г/л, al-глобулiну з 3,98 до 2,81 г/л, а2-глобул^ з 10,41 до 9,86 г/л, Р-глобул^ з 4,44 до 3,60 г/л, у-глобулiну з 4,90 до 4,75 г/л [29]. Концентращя альбумiну та загального бшка зменшились i у сироватщ кровi курей [2, 5, 22, 30, 33, 42] та свиней [34].
У сироватщ кровi щурiв, яю споживали ОТА-забрудненi продукти, було значне зниження концентраци загального бшка (контроль 72,3±3,2 г/л, ОТА 54,2±2,8) i альбумiну (контроль 34,6±2,9 г/л, ОТА 12,3±0,3). Це зниження може бути пов'язано з гальмуванням тРНК-синтетаз, що супроводжуеться зниженням синтезу бшка [1]. Проте iншi даш вказують на зростання концентраци загального бшка в сироватщ кровi щурiв, якi 10 днiв споживали ОТА в дозi 0,5, 1 i 2 мг/кг [15].
Концентращя бшка в сироватщ кровi юз знизилась з 75 до 75 г/л при згодовуванш ОТА в дозi 1 мг/кг живо! маси та зростала з 64 до 74 г/л i з 70 до 98 г/л при згодовуванш ОТА вщповщно в дозi 2 i 3 мг/кг живо! маси. Актившсть аспартатамшотрансферази зросла у вах випадках i корелюе з гепатоцелюлярними дегенеративними змшами [28]. В сироватцi кровi курей [22, 42] та свиней [34] теж зросла актившсть аспартат- та аланшамшотрансферази. Пщвищення активност у-глутамштрансферази за ди ОТА встановлене у сироватщ кровi щурiв [1] та курей [33, 42].
Внутршньокл^инний статус GSH е чутливим показником загального стану середовища та його здатност протидiяти токсинам. Зниження концентраци GSH може бути пов'язане з безперервним нападом вшьних радикалiв. Зниження в
кл^иш активност неензиматичних антиоксиданив збшьшуе сприйнятливiсть до травми внаслiдок перекисного окиснення [8]. Пероксид-шдуковане зниження GSH пояснюеться споживанням цього антиоксиданту i вiдсутнiстю субстратiв для його синтезу [3].
При згодовуванш мишам ОТА в дозi 1,5 та 3 мг/кг живо'' маси, концентращя GSH в печшщ знизилась iз 74,63 до 34,18 та 42,45 мкг/100 мг тканини [8]. За шшими даними [4] концентращя GSH пщ впливом ОТА знизилась з 38 до 20 нмоль/мг. У печшщ поросят [6] таке зниження вщбуваеться з 1,82 до 0,99 мкмоль/г бшка. Проте така змша е дозозалежна. У первинних гепатоцитах щура пщ впливом ОТА в дозi 1,5 мкМ концентращя GSH зросла на 35%, а вже коли доза ОТА була 3 та 6 мкМ юльюсть GSH знизилась на 20 i 45% [7]. Пщ впливом ОТА знижуеться рiвень GSH в ам'яниках мишей [41], у культурах кл^ин Hep G2 i Vero [14] та нирки свиш [20].
Осюльки GSH е важливий антиоксидант, зменшення його внутрiшньоклiтинноï концентраци значно послаблюе захист клiтини вiд окиснювально'' травми. 1нпбування експресiï iнших ензимiв з захисними властивостями може в подальшому збшьшувати негативний вплив OTA-опосередкованого зменшення GSH [7]. Багато гешв, яю регулюються ОТА, очевидно беруть участь у детоксикаци та транспортних процесах. Вони включають в себе зокрема юлька GST-аз [24]. Наприклад, експреая субодиницi GSTP1 була знижена тсля введення OTA. GSTP1, як вважають, грае роль в детоксикаци продукту перекисного окиснення лшвдв 4-гщроксиноненалу шляхом сполучення з GSH. 4-гщроксиноненал е реактивна хiмiчна сполука, яка зв'язуеться з макромолекулами, зокрема ДНК. Зниження експреси GSTP1 може призвести до зниження детоксикаци та екскреци OTA, або шших ксенобютиюв. Пщвищена концентращя рiзних ксенобютиюв в кл^иш може призвести до синерпстично'' токсичност^ зокрема мiж OTA та iншi мiкотоксинами. У культурi первинних гепатоцитсв щура пiд впливом ОТА ^м змiн iзоформи GSTP1 також знижуеться експреая iзоензимiв GSTM1 i GSTA5. OTA-шдуковане виснаження цього клiтинного мехашзму антиоксидантного захисту може призвести до збшьшення окисних пошкоджень i цитотоксичност [7].
У тварин, якi були шфузоваш пероксидами, була вища вщносна вага печiнки, нiж у контрол^ що свiдчить про патогенетичну роль перекиав або вiльних радикалiв. Iнфузiя пероксидiв iндукуе атаку вiльних радикалiв на мембрани, що може призвести до перекисного окиснення лшвдв в них [9].
1снуе рiзниця у потенцiалi виживання мiж базальною i аткальною частиною клiтин, що зб^аеться з iстотно нижчим рiвнем GSH в базальнш частинi клiтин в порiвняннi з апiкальною. Це дозволило припустити, що базальнi частини можуть бути бiльш уразливi для вшьних радикалiв, нiж апiкальнi [31].
Якщо пероксиди спричиняють внутрiшньоклiтинне окиснення, то можна оч^вати зменшення окисненого глутатюну (GSSG). Для пiдтримки окисно-вщновного стану вiн утилiзуеться глутатiонпероксидазою (GPX) i активно експортуеться з кл^ини [19]. Пероксид-iндуковане зниження GSH пояснюеться споживанням цього антиоксиданту i вщсутшстю субстраив для його синтезу. Н2О2
i терт-бутилгщропероксид е потужними стимуляторами видшення GSSG з жовчю
Se-залежна GPx у печiнцi морсько1 свинки становить приблизно 15% загально1 активностi, а при гель-фшьтраци появляеться як фракцiя бшьшо1 молекулярно1 маси нiж фракцiя GST активности У печiнцi морсько1 свинки велика GPx актившсть належить iзоензиму GSTA2. Ця iзоформа не утилiзуе Н2О2, але печiнка морсько1 свинки мае високу активнiсть каталази (у 5 разiв вища нiж у щура). Таким чином, у печшщ морсько1 свинки функцiя GSTA2 фiзiологiчно "прибирати" органiчнi гiдропероксиди, а каталази та Se-залежно!' GPx — пероксид Гщрогену [26].
При охратоксикозах зниження активной цих ензимiв може бути у зв'язку з низкою факторiв. Перш за все, токсини знижують швидкiсть бiосинтезу бiлка шляхом конкурентного шпбування фенiлаланiн-тРНК-синтетази, що зменшуе виробництво цих ензимiв (про цю дш згадувалось при обговореннi зниження концентрацп бшка в сироватцi кровi). По-друге, токсин виробляе активнi форми кисню (АФК), якi прямо або to6Í4TO взаемодiють з бiлками, ДНК i РНК, та змшюють 1х актившсть, що вщбиваеться на загальному виробництвi ензимiв [8].
ОТА сприяе виробництву вкрай руйшвних гiдроксильних радикалiв. Одним з кшькох можливих наслiдкiв цього процесу е формування перекиав лшвдв. Це породжуе радикали супероксиду анюну i, отже, перекису водню (H2O2). Вiдсутнiсть адекватних кiлькостей NADPH i GSH перешкоджае утилiзацiï H2O2 GSH-залежною GPx i NADPH-залежною глутатiонредуктазою (GR) [18]. У статп Hoehler D. et al., 1997 наведена схема цього процесу [18].
Рiвнi антиоксидантних ензимiв GPx, GR i GST були значно нижчi в мишей оброблених охратоксином, шж в контроле Супероксиднi радикали (О2-) були зареестроваш в рядi патологiчних порушень. GR перетворюе GSSG в GSH. GPx перетворюе Н2О2 в Н2О шляхом окиснення GSH. Зниження в GPx збшьшить концентрацiю Н2О2, що е сигналом збшьшення надалi окисного стресу. АФК збшьшують рiвень GST, що засвоюе токсичнi продукти перекисного окиснення лшвдв. Зменшення активностi GST призведе до збiльшення активностi АФК [8].
При згодовуванш мишам ОТА в дозi 1,5 та 3 мг/кг живоï маси, активнiсть GST знизилась з 51,82 до 41,33 i 24,26 U/г бiлка, GPx з 0,41 до 0,27 i 0,15 U/г бшка, GR з 3,13 до 2,43 i 1,69 U/г бшка [8]. Використання протягом семи тижшв кормiв забруднених низьким рiвнем OTA викликае зниження активностi GPx у гомогенат печiнки свиней з 2,02 до 0,88 U/г бшка [6]. Подiбнi змши виявили i у печшщ щурiв [37]. У морсь^' свинки активнiсть цього ензиму за дiï ОТА зменшуеться з 5,32 до 3,41 U [1]. В первинних гепатоцитах щура пщ впливом ОТА знижуеться експреЫя iзоензимiв GSTP1, GSTM1 та GSTA5 [7]. В Ым'яниках мишей яким згодовували ОТА зменшена активнiсть GST, GPx i GR [41].
Проте згщно окремих даних [32] актившсть GPx у щура за ди ОТА навпаки зростае. Можливо причиною такого стану е низька доза токсину. Подiбний ефект був у первинних гепатоцитах щура з концентращею GSH, яка зростала при малш дозi ОТА та знижувалась при високих дозах [7]. Тобто, при проведенш експерименив [32] доза токсину була настшьки незначна, що вона лише викликала
стимулюючий ефект на глутатюнову систему кл^ин. Це при тому, що щур е моногастричною твариною i у нього ОТА не перетворюеться у нетоксичну а-форму до всмоктування в кров, як у тварин з багатокамерним шлунком [24]. Шсля всмоктування в кров ОТА потрапляе в печшку де проявляеться його токсична дiя [38], та можливе лише часткове його знешкодження [35, 36, 43]. А перетворення у ОТа у щурiв вiдбувaеться за Ail мшрофлори слшо! та ободово! кишок [23]. Схема обм^ ОТА в оргaнiзмi наведена у стaттi Marquardt R.R. & Frohlich A. A., 1992
[25].
Шсля двох тижнiв впливу OTA в печшщ мишей спостерiгaвся апоптоз. При цьому було виявлено зниження концентрацп GSH, який е один з найбшьш поширених aнтиоксидaнтiв в кл^инах. Була висунута гiпотезa, що GSH ввдграе роль у порятунок клiтини вiд апоптозу. Тaкi змши можуть бути в результaтi окиснення GSH в GSSG, або екструзи внутршньокл^инного GSH, яка викликана активащею рiзних GSH-трaнспортерiв. Цi мехaнiзми будуть сприяти виснаженню GSH. Пiсля обробки печшки антиоксидантами проти токсично! ди OTA тканина отримуе опосередкований захист, шляхом активацп печiнкового статусу GSH, але не шляхом iнгiбувaння метaболiзму ОТА. Для ефективного зaпобiгaння апоптозу шпб^ор повинен мати декiлькa якостей i здaтнiсть нейтрaлiзувaти радикали кисню е важливою. Клiтинний окисно-вiдновний стан та (або) рiвновaгa мiж АФК, породженими OTA, та !х детоксикaцiя по антиоксидантному мехaнiзму може вплинути на рaннi стадп апоптозу [4].
Л1тература
1. Abdel-Wahhab M.A. et al. // J.Pineal Res. - 2005. - V.38. - P.130-135.
2. Agawane S.B., Lonkar P.S. // J. Vet. Sci. - 2004. - V.5, N.4. - P.359-367.
3. Akerboom T.P.M. et al. // J.Biol.Chem. - 1984. - V.259, N.9. - P.5838-5843.
4. Atroshi F. et al. // J.Pharm.Pharmaceut.Sci. - 2000. - V.3, N.3. - P.281-291.
5. Bailey C.A. et al. // Poult.Sci. - 1989. - V.68, N.12. - P.1664-1671.
6. Balogh K. et al. // Acta Vet.Hung. - 2007. - V.55, N.4. - P.463-470.
7. Cavin C. et al. // Toxicol.Sc. - 2007. - V.96, N.1. - P.30-39.
8. Chakraborty D., Verma R. // IntJ.Occ.Med.Env.H. - 2010. - V.23, N.1. - P.63-73.
9. Chessex Ph. et al. // J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr. - 2001. - V.32, N.3. - P.316-321.
10. Commandeur J.N.M. et al. // Pharmacol.Rev. - 1995. - V.47, N.2. - P.271-330.
11. Dai. J. et al. // Chem.Res.Toxicol. - 2002. - V.15, N.12. - P.1581-1588.
12. Doorten A.Y.S. et al. // Toxicol.Vitro. - 2004. - V.18. - P.271-277
13. Gillman I.G. // Chem.Res.Toxicol. - 1999. - V.12, N.11. - P.1066-76.
14. Hassen W. et al. // Toxicol. - 2007. - V.242, N.1-3. - P.63-70.
15. Hatey F., Galtier P. // Ann.Rech.Vet. - 1977. - V.8, N.1. - P.7-12.
16. Hedelberg S. et al. // J.Appl.Toxicol. - 1989. - V.9, N.2. - P.91-96.
17. Hoehler D. et al. // J.Biol.Chem. -1996. - V.271, N.44. - P.27388-27394.
18. Hoehler D. et al. // Can.J.Anim. Sci. - 1997. - V.77. - P.287-292.
19. Keppler D., Konig J. // FASEB J. - 1997. - V.11. - P.509-516.
20. Klaric M.S. et al. // Basic Clin.Pharm.Toxicol. - 2007. - V.100, N.3. - P.157-164.
21. Kumagai S. // Food Chem.Toxicol. - 1985. - V.23, N.10. - P.941-943.
22. Kumar A. et al. // Avian Dis. - 2003. - V.47, N.2. - P.415-424.
23. Madhyastha M.S. et al. // Arch.Envir.Cont.Tox. - 1992. - V.23, N.4. - P.468-472.
24. Marln-Kuan M. et al. // Toxicol.Sc. - 2006. - V.89, N.1. - P.120-134.
25. Marquardt R.R., Frohlich A.A. // J.Anim.Sci. - 1992. - V.70. - P.3968-3988.
26. Oshino R. et al. // J.Biochem. - 1990. - V.107. - P.105-110.
27. Panozzo MP. et al. // Clin.Exp.Pharm.Physiol. - 1995. - V.22, N.4. - P.266-271.
28. Ribelin W.E. // Can.J.Comp.Med. - 1978. - V.42, N.4 — P.172-176.
29. Richard J.L. et al. // Appl.Microb. - 1975. - V.29, N.1. - P. 27-29.
30. Sakthivelan S.M., Rao G.V.S. // Vet.Med.Int. - 2010. - P.1-4.
31. Sha S.H. et al. // Hear Res. - 2001. - V.155, N.1-2. - P.1-8.
32. Soyoz M. et al. // Cell.Biol.Toxicol. - 2004. - V.20, N.4. - P.213-219.
33. Sreemannarayana O. et al. // Arch.Envir.Cont.Tox. - 1989. - V.18, N.3. - P.404-410.
34. Stoev S.D. et al. // Exp.Toxicol.Pathol. - 2011 (в друщ).
35. Storen O. et al. // Appl.Environ.Microb. - 1982. - V.44, N.4. - P.785-789.
36. Stormer F.C. et al. // Appl.Environ.Microb. - 1983. - V.45, N.4. - P.1183-1187.
37. Sutken E. et al. // IntJ.Toxicol. - 2007. - V.26, N.1. - P.81-87.
38. Szczech G.M., Hood R.D. // AmerJ.Pathol. - 1978. - V.91, N.3. - P.689-692.
39. Tozlovanu R. et al. // Chem.Res.Toxicol. - 2006. - V.19. - P.1241-1247.
40. Uchiyama S., Saito Yu. // J.Food Hyg.Soc.Jap. - 1987. - V.28, N.6. - P.453-460.
41. Verma R., Chakraborty D. // Acta.Pol.Pharm. - 2008. - V.65, N.2. - P.187-194.
42. Wang G.H. et al. // Poultry Sc. - 2009. - V.88. - P.504-510.
43. Wu Q. et al. // Curr.Drug.Metab. - 2011. - V.12, N.1. - P.1-10.
44. Zepnik H. et al. // Toxicol.Sc. - 2001. - V.59. - P.59-67.
Summary
Fedets О.М., Makukh Ye.M., Vyhnan D.S., Krasnevych A.Ya. S.Z.Gzhytskyj Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies OCHRATOXIN AND GLUTATHIONE-RELATED ENZYMES
The data have been summarized on the mechanisms of action of ochratoxin on glutathione system of animals and the protective role of this system.
Key words: ochratoxin, glutathione, glutathione transferase, glutathione peroxidase, glutathione reductase.
Рецензент - д.б.н., проф. Калачнюк Г.I.
