CC BY
94
ПРЕПАРАТЫ
io Общие принципы разработки программы
£ доклинических испытаний
£ иммунобиологических лекарственных
! препаратов, полученных с использованием
§ методов генной инженерии
те
5 Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Волкова Р.А., Борисевич И.В.
¡* ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ, Москва
§ General Principles of Preclinical Trials
Program Development for Immunobiological Preparations, Derived Using Gene Engineering Methods
Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Volkova R.A., Borisevich I.V.
Federal State Budgetary Institution «Tarasevich State Research Institute of Standardization and Control of Biological Medicines», Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation
В статье изложены общие принципы разработки программы доклинических испытаний новых иммунобиологических препаратов, активным веществом которых являются продукты, изготовленные методами рекомбинантной ДНК. Приведены требования к производству, к продукту на этапе разработки и проведения доклинических испытаний препарата, которые включают оценку физико-химических свойств, специфической иммунобиологической активности, токсичности, иммунологической безопасности, иммуногенности, влияния на репродуктивную функцию и эмбриогенез. Изложенные принципы доклинических испытаний касаются препаратов цитокинов, моноклональных антител, рецепторов клеток, рекомби-нантных факторов плазмы крови, вакцин на основе рекомбинантных белков (HBsAg, белки вируса папилломы и др.).
Ключевые слова: иммунобиологические препараты, генная инженерия, биотехнология, рекомби-нантные белки, доклинические испытания, эффективность, безопасность.
Библиографическое описание: АвдееваЖ.И., Алпатова Н.А., Волкова Р.А., Борисевич И.В. Общие принципы разработки программы доклинических испытаний иммунобиологических лекарственных препаратов, полученных с использованием методов генной инженерии // Биопрепараты. - 2011. -№ 3. - С. 45-48.
The following article describes general principles of preclinical trials program development for new immunobiological preparations, the active substances of which have been produced using recombinant DNA method. The following demands are represented: the manufacture, the product at development and preclinical studies stages, which includes physical and chemical properties evaluation, specific immunobiological activity, toxicity, immunological safety, immunological potency, influence on reproductive function and embryogenesis. The stated principles of preclinical trials are applied to cytokine preparations, monoclonal antibodies, cell receptors, recombinant blood plasma factors, vaccines, based on recombinant proteins (HBsAg, papilloma virus proteins etc.).
Keywords: immunobiologocal preparations, gene engineering, biotechnology, recombinant protein, preclinical trials, efficacy, safety.
Bibliographic description: Avdeeva Zh. I., Alpatova N. A., Volkova R. A., Borisevich I.V. General principles of preclinical trials program development for immunobiological preparations, derived using gene engineering method//Biopreparats (Biopharmaceuticals). - 2011. - № 3 - P. 45-48.
Для корреспонденции:
Авдеева Ж.И. - заведующая лаборатории иммунологии ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ Адрес: ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздравсоцразвития РФ, 119002, Москва, пер. Сивцев Вражек, 41, Avd-cytok@yandex.ru Статья поступила 05.08.2011 г, принята к печати 25.08.2011 г
С45
В клинической практике в настоящее время все более широкое применение находят иммунобиологические лекарственные препараты, разработанные на основе рекомбинантных белков. Действующим веществом указанных препаратов являются активные субстанции, получаемые из культур охарактеризованных клеток, используемых в качестве систем экспрессии, которыми могут быть бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и др. Активные субстанции - белки, пептиды, их производные и вещества, компонентами которых они являются. К таким препаратам, в частности, относятся препараты цитокинов, моноклональных антител, рецепторов клеток, рецепторные антагонисты цитокинов, рекомбинантных факторов плазмы крови, вакцины на основе рекомбинантных белков (НВвДд, белки вируса папилломы и др.)
Указанные препараты предназначены для лечения, профилактики и диагностики различных заболеваний человека, характеризующихся длительным прогрессирующим течением - инфекционных, аутоиммунных, онкологических, аллергических заболеваний.
Основная цель доклинических испытаний - оценка безопасности, специфической активности, предполагаемой эффективности препарата для решения вопроса о проведении клинических испытаний и последующей регистрации препарата. Заключение о возможности испытания препарата на людях должно основываться на оценке соотношения безопасности и эффективности при его доклиническом исследовании [1, 2].
При проведении доклинических испытаний должны быть выполнены следующие исследования
• оценка физико-химических и иммунохимических свойств активной субстанции и готового препарата,
• изучение специфической биологической активности,
• оценка эффективности, т.е. характеристика специфического проявления действия препарата с целью выяснения механизмов его терапевтического эффекта,
• определение безопасных и эффективных доз и схемы введения препарата, рекомендуемых для человека,
• определение потенциальных органов-мишеней побочного действия препарата и исследование обратимости выявленных токсических эффектов,
• определение параметров безопасности, показателей возможного побочного действия препарата, которые следует оценивать при дальнейшем клиническом испытании.
В досье, представляемом для регистрации препарата, в раздел доклинического изучения должны быть включены как результаты оценки специфической иммунобиологической активности, эффективности и безопасности лекарственного препарата, так и сведения, касающиеся источника клеток-продуцентов, характеристика экспрессирующей конструкции, ее генетическая стабильность и продуктивность.
Препарат, используемый для проведения доклинических испытаний, должен быть достаточно полно оха-
рактеризован по химическим, иммунохимическим и физико-химическим параметрам, включая вторичную и третичную структуру белка (активной субстанции).
В доклинических исследованиях должны исследоваться препараты с установленными спецификациями на активную субстанцию и готовый препарат; показатели, выбранные для контроля, должны обеспечивать необходимое качество продукта.
Для получения рекомбинантного белка должна использоваться система банков клеток, включающая Основной (ОБК) и Рабочий (РБК) банки клеток, аттестованные в установленном порядке.
Сведения о банках клеток, включенные в паспорт, должны содержать следующую информацию:
• детальное описание истории создания клеточной линии и получения банков клеток, включая методы и реагенты, использованные в процессе культивирования, возраст клеток in vitro, условия их хранения и стабильность;
• указание фенотипических и генетических маркеров;
• детальное исследование экспрессирующей конструкции в ОБК;
• способ введения вектора в клетку хозяина;
• способы индукции и контроля уровня экспрессии;
• отсутствие в банке онкогенных и посторонних инфекционных агентов: вирусов, бактерий, грибов, микоплазм;
• отсутствие у клеточных линий туморогеннности и онкогенности.
Если ОБК не используется, исследования должны проводиться для каждого РБК.
В клетках ОБК, РБК и послепроизводственного банка клеток (ПБК) должны отсутствовать посторонние агенты (вирусные, бактериальные, грибковые, микоплаз-менные), что должно быть подтверждено соответствующими исследованиями.
Особое внимание следует обращать на вирусы, которые могут контаминировать виды животных, от которых получена линия клеток. Используемые в процессе производства материалы биологического происхождения также должны быть охарактеризованы и должны соответствовать требованиям микробиологической и вирусной безопасности. В частности, сыворотка крупного рогатого скота должна контролироваться и не должна содержать потенциально опасные вирусы (вирус бычьей диареи, инфекционного бычьего рино-трахеита и парагриппа 3 и др.). Кроме того, бычья сыворотка и другие биологические продукты животного происхождения должны быть получены от животных, содержащихся в хозяйствах, благополучных в отношении губчатой энцефалопатии.
Среда, используемая для культивирования клеток, должна иметь регламентированный состав и быть зарегистрирована. Все этапы процесса производства должны быть валидированы с целью предотвращения возможной контаминации инфекционными агентами готового продукта.
С помощью соответствующих тестов, выполняемых на различных стадиях производства, следует доказать отсутствие вирусной контаминации в соответствии с Методическими рекомендациями [3, 4].
ПРЕПАРАТЫ
Определенные линии клеточных культур могут содержать эндогенные вирусы, например, ретровирусы, которые трудно удалить. Если линия клеток содержит вирусы, способные инфицировать клетки человека, она может быть использована для производства продукта только при исключительных обстоятельствах на основе анализа рисков. Вопрос об использовании таких линий клеток должен рассматриваться индивидуально в каждом конкретном случае. При этом необходимо представить доказательства, что вирусная контаминация будет удалена или инактивирована на этапах производственного процесса. Используемые способы инактивации/удаления вирусных контами-нантов не должны влиять на биологическую активность продукта.
При изучении специфической иммунобиологической активности новых генно-инженерных препаратов и последующей разработке требований к ним необходимо основываться на принципах, изложенных в Методических рекомендациях [1, 3], а также международных рекомендаций [5 - 7]. Для определения специфической активности препаратов должны использоваться соответствующие информативные лабораторные методы.
Принципы оценки активности генно-инженерных препаратов, предназначенных для активной иммунизации человека (вакцины), должны быть основаны на определении степени иммунного ответа у экспериментальных животных, иммунизированных данными препаратами, обеспечивающего защиту от специфического патогена.
При оценке специфической иммунобиологической активности лекарственных препаратов, активным компонентом которых являются генно-инженерные продукты, используют методы in vitro и in vivo, которые позволяют оценить эффекты, отражающие механизм действия препаратов при их клиническом использовании.
Целью проведения исследований in vitro является выбор соответствующих видов животных для дальнейших иммунобиологических, а также и токсикологических исследований, проводимых в условиях in vivo. Особую значимость выбор соответствующих видов животных имеет при проведении доклинических испытаний препаратов моноклональных антител.
В тестах in vitro используют перевиваемые клеточные линии и/или первичные клеточные культуры для определения локализации рецепторов на клетках, аффинитета рецепторов с целью выявления и изучения иммунобиологических эффектов, которые в последующем могут выявляться при проведении исследований в условиях in vivo и определять потенциальные аспекты биологической активности препаратов.
При испытании моноклональных антител должны быть детально изучены иммунологические свойства антител, включая антигенную специфичность, способность связывать комплемент, а также реактогенность и/или цитотоксичность в отношении тканевых антигенов человека, не являющихся мишенями для антител заданной специфичности. Исследования перекрёст-
ной реактивности должны проводиться на тканях различных органов человека с использованием соответствующих иммуногистохимических методов.
При исследовании токсичности лекарственных генно-инженерных препаратов традиционные подходы, используемые для других МИБП, не всегда применимы в связи с их уникальностью - особенностью структуры и биологических свойств, включающих иммуноген-ность, плейотропную активность и видовую специфичность.
Это касается в первую очередь выбора животных, поскольку видовая и/или тканевая специфичность затрудняет проведение исследования токсичности по стандартной схеме на традиционно используемых видах животных.
Другие общие принципы испытания токсичности, касающиеся схемы исследования, количества и пола животных, способа и кратности введения препарата, соответствуют принципам исследования других МИБП и максимально приближены к предполагаемой схеме применения препарата в клинике.
В большей степени особенности проведения исследований касаются препаратов моноклональных антител (МкАТ).
Исследования препаратов МкАТ могут быть проведены только на тех видах животных, клетки тканей которых экспрессируют антигены, эпитопы которых распознаются препаратом МкАТ, либо ткани которых проявляют перекрёстную реактивность с тканями человека, т.е. на соответствующих видах животных.
Если соответствующий вид животных отсутствует используют трансгенных животных, клетки тканей которых экспрессируют человеческий рецептор, или используют гомологичные белки соответствующего вида животных.
В случае, когда препарат МкАТ, специфичных к эпито-пу антигена, экспрессированного на клетках человека, имеет перекрестную реактивность с соответствующим эпитопом только на клетках человекообразных обезьян, но не реагирует с эпитопами на клетках грызунов, исследования проводят на обезьянах, либо готовят аналогичный препарат МкАТ, которые реагируют с тканями грызунов и используют их в испытаниях.
Оценка потенциальной иммуногенности и иммуно-токсичности проводится при испытании токсичности (в случае многократного введения препарата), при этом необходимо контролировать уровень специфических антител, оценивать их влияние на параметры фарма-кокинетики/фармакодинамики, частоту и/или тяжесть побочных эффектов, активацию системы комплемента или новые проявления токсичности, необходимо учитывать возможность развития патологических изменений за счет формирования и отложения иммунных комплексов.
Следует отметить, что у человека не всегда формируются антитела к рекомбинантному белку. Однако, даже в случае формирования антител, терапевтический эффект препарата у пациентов может сохраняться. Развитие тяжёлых анафилактических реакций на рекомбинантные белки у человека наблюдается редко.
Необходимо учитывать, что проявление иммуноток-сичности препарата может быть следствием изменения экспрессии антигенов на клетках-мишенях, в част-
С
ности, маркеров активации, что может провоцировать включение аутоиммунных процессов.
Необходимость проведения исследований по изучению влияния на репродуктивную функцию и эмбриогенез зависит от конкретного препарата, клинических показаний и предполагаемой популяции пациентов. Исследование мутагенности должны выполняться в случае сомнений по поводу мутагенных свойств препарата.
Проведение стандартных исследований при изучении канцерогенности, в целом, не являются необходимыми. Необходимость оценки канцерогенного потенциала, специфичного для препарата, находится в зависимости от длительности курса его применения, популяции пациентов и/или биологической активности (препараты факторов роста, вещества с иммуносу-прессивной активностью и др.).
Следует обратить внимание на вопросы, требующие особого рассмотрения. Так, единая схема проведения фармакокинетических исследований медицинских препаратов, полученных методами генной инженерии, не установлена. Рутинные исследования, когда оценивается баланс массы введенного и элиминированного препарата, мало информативны. На фармакокинети-ческий профиль (величину клиренса) могут влиять иммунологически обусловленные механизмы, кроме того может проявляться отсроченный фармакодина-мический эффект (в частности это касается цитоки-
Литература:
1. РД 42 - 28 - 9 - 89 «Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, полученным методами генной инженерии». - 1988.
2. МР 3.3.2.2359-08 «Организация производства и контроль качества моноклональных антител». -2009. - 36 с.
3. МР «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых медицинских иммунобиологических препаратов». - 2010. - 39 с.
4. МР «Аттестация перевиваемых клеточных культур». - 2011. - 65 с.
нов), т.е. может наблюдаться пролонгирование фарма-кодинамических эффектов. Параметры фармакокинетики препаратов МкАТ должны оцениваться только на соответствующих видах животных.
При исследовании фармакокинетических параметров следует учитывать влияние связывающих белков плазмы и/или антител, циркулирующих в сыворотке крови, которые могут ингибировать проявления оцениваемой активности препарата.
Следует учитывать также особенности метаболизма рекомбинантных белков в случае исследования белкового препарата с радиоактивной или любой другой меткой. Так, следствием активного метаболизма меченного белкового препарата является деградация до коротких пептидов и отдельных аминокислот, что приводит к потере радиоактивной метки, либо включению метки в определенные аминокислоты, которые могут участвовать в синтезе белков/пептидов, не имеющих отношения к исследуемому препарату.
Таким образом, результаты доклинических испытаний иммунобиологических препаратов, получаемых с использованием методов генной инженерии, должны включать оценку физико-химических, иммунохимиче-ских свойств, специфической иммунобиологической активности, иммуногенности, токсичности, иммунологической безопасности, и являться основанием для решения вопроса о возможности проведения I фазы клинических испытаний (оценки реактогенности, безопасности, специфической активности (эффективности) препарата на ограниченной группе людей).
5. WHO guidelines for assuring the quality of pharmaceutical and biological products prepared by recombinant DNA technology/ WHO Technical Report Series. № 814. -1991.
6. Production and Quality Control of Medicinal Products Derived by Recombinant DNATechnology. European Commission. Enterprise Directorate-General -Pharmaceuticals. - 1994.
7. WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines/ WHO Technical Report Series. № 927. - 2005.
