CC BY
110
Д • 7universum.com
ikUNIVERSUM:
/YY\ МЕДИЦИНА И ФАРМАКОЛОГИЯ
ОБОСНОВАНИЕ ПОДХОДОВ К ЛЕЧЕНИЮ БЕСПЛОДИЯ У ЖЕНЩИН С ЭНДОМЕТРИОЗОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
Коваль Галина Даниловна
канд. мед. наук,
доцент кафедры клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии Буковинского государственного медицинского университета,
Украина, г. Черновцы E-mail: [email protected]
SUBSTANTIATION OF APPROACHES TO THE TREATMENT OF INFERTILITY IN WOMEN WITH ENDOMETRIOSIS DEPENDING
ON IMMUNOLOGICAL FINDINGS
Halyna Koval
candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Endocrinology, Bukovinian State Medical University,
Ukraine, Chernivtsi
АННОТАЦИЯ
Проведен анализ эффективности консервативного лечения бесплодия и использования экстракорпорального оплодотворения в зависимости от показателей иммунологической реактивности у 65 женщин с бесплодием, обусловленным эндометриозом. Установлено, что у исследуемых женщин с повышением уровней GATA3, снижением соотношения T-bet/GATA3, резким повышением TLR2, TLR4, IL-6 и TNF-a не было беременностей после консервативного лечения и наиболее эффективным методом лечения бесплодия было лечение с использованием экстракорпорального оплодотворения.
Коваль Г.Д. Обоснование подходов к лечению бесплодия у женщин с эндометриозом в зависимости от иммунологических показателей // Universum: Медицина и фармакология : электрон. научн. журн. 2015. № 7-8 (19) . URL: http://7universum.com/ru/med/archive/item/2550
ABSTRACT
The analysis has been performed on the basis of dependence between the efficacy of conservative treatment of infertility and application in vitro fertilization, and the findings of immunological reactivity in 65 women with infertility caused by endometriosis. Results: has been found in the examined women with increasing levels of GATA3, decreased ration of T-bet/GATA3, a sharp increase of TLR2 and TLR4 and a high level of IL-6, TNF-a there were no independent pregnancies and the most effective approaches to treat infertility were the methods with the use of in vitro fertilization.
Ключевые слова: бесплодие, эндометриоз, лечение, цитокины, толл-подобные рецепторы, транскрипционные факторы.
Keywords: infertility, endometriosis, treatment, cytokines, toll-likereceptors, transcription factors.
Введение
Эндометриоз представляет собой важную медицинскую и социальную проблему, характеризуется высокой частотой встречаемости, поражает женщин репродуктивного возраста и ассоциируется с бесплодием. В частности, генитальный эндометриоз ассоциирован с бесплодием у 25—50 % пациентов, а перитонеальная форма сопровождается бесплодием в 60—80 % случаев [2; 7]. Проблема повышения эффективности лечения бесплодия при эндометриозе не уменьшает значимости, несмотря на значительные достижения последних лет. Традиционное лечение эндометриоза включает подходы с использованием хирургического вмешательства и патогенетической гормональной терапии, направленной на уменьшение площади эндометриоидных очагов. Лечение бесплодия при эндометриозе основывается на принципах консервативного лечения или использования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ): инсеминации спермой мужа, экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов в полость матки, донорства ооцитов. Выбор
тактики и подходов к терапии бесплодия при эндометриозе базируется на результатах комплексного клинико-лабораторного исследования. Тем не менее возможности обоснования выбора консервативного лечения или необходимости применения ВРТ у конкретной женщины на основании прогнозирования итогов того или иного вида лечения на данный момент ограничены. Это часто приводит к длительному неэффективному медикаментозному лечению, что влечет за собой необоснованные расходы и потерю времени. И, с другой стороны, к применению ВРТ в тех ситуациях, когда можно получить беременность естественным путем. На наш взгляд, повышения эффективности лечения бесплодия при эндометриозе можно достигнуть, учитывая при выборе метода лечения иммунопатогенетические особенности его развития. Известно, что в патогенезе как эндометриоза, так и бесплодия значительную роль играют механизмы иммунологической регуляции, а важными иммунологическими медиаторами являются цитокины, которые, в частности, задействованы в развитии и прогрессировании эндометриоза и служат определенными индикаторами его течения [9; 15; 18; 20; 22]. В последнее время знания о иммунопатогенезе эндометриоза дополнились сведениями о важной роли толл-подобных рецепторов 2 и 4 типа — toll-like receptors (TLR2, TLR4) в ткани эндометрия [13; 14; 17; 23]. Также стало известно, что факторами, определяющими ход иммунного ответа, являются транскрипционные факторы регуляции дифференцировки Т-клеток: Т-хелперов 1-го типа (Th1) — Т-bet, Т-хелперов 2-го типа (Th2) — GATA-3, Т-регуляторных клеток (Treg) —
Foxp3 [8; 10; 11; 16; 24].
Цель исследования — определить подходы к лечению бесплодия у женщин с эндометриозом на основании анализа влияния иммунологических показателей на результаты лечения.
Материалы и методы
Исследование проводилось с 2009 по 2014 год в Буковинском государственном медицинском университете на базе Центра лечения бесплодия (г. Черновцы, Украина).
Дизайн исследования: ретроспективное рандомизированное
сравнительное. Под наблюдением находились 40 женщин с эндометриозом и бесплодием. Возраст женщин был от 18 до 39 лет, средний возраст составил 31,01 года. Ретроспективно, в зависимости от вида проводимого лечения, пациентки были разделены на 2 группы. В первую группу вошло 23 женщины с медикаментозным лечением бесплодия (у 7 женщин беременность наступила, у 16 — беременность не наступила), во вторую группу вошли 17 пациенток с эффективным лечением бесплодия с помощью ЭКО. Критерием эффективности лечения бесплодия было наступление беременности, заканчивающейся рождением ребенка. Именно такое распределение групп было обусловлено целью определения прогностических факторов риска неэффективного медикаментозного лечения.
Критериями включения в исследование были: наличие верифицированного эндометриоза, бесплодие сроком не менее 2 лет, репродуктивный возраст, проходимость маточных труб.
Критериями исключения были: сопутствующие заболевания
репродуктивной сферы в стадии обострения, эндокринные, иммунные, инфекционные заболевания, выявление патологических возбудителей при микробиологических и вирусологических обследованиях.
Протокол исследования соответствовал требованиям к биомедицинским исследованиям и утверждался комитетом по биоэтике Буковинского государственного медицинского университета, а также локальным этическим комитетом Центра лечения бесплодия, в котором проходили лечение пациентки согласно утвержденному протоколу. Первым этапом лечения пациенток обеих групп было лапароскопическое удаление очагов эндометриоза. После этого женщины первой группы получали препараты прогестагенов («Норколут»)
или агонистов гонадотропин-рилизинг-гормона («Бусерелин»), а пациентки второй группы перед проведением ЭКО получали терапию, направленную на стимуляцию овуляции с использованием препаратов фолликулостимулирующего гормона («Г онал» или «Пурегон») согласно соответствующим инструкциям. Исследование проводилось с информированного согласия пациенток и в условиях конфиденциальности.
На момент поступления в клинику всем пациенткам были проведены лапароскопия и гистероскопия в интервале пролиферативной фазы менструального цикла. Ткань эндометрия отбиралась во время гистероскопии, перитонеальная жидкость — во время проведения лапароскопического вмешательства, а кровь — перед этой процедурой.
Всем женщинам были проведены иммунологические обследования. В частности, были исследованы уровни экспрессии транскрипционных факторов дифференцировки Т-клеток — Т-bet, GATA-3, Foxp3, а также TLR2 и TLR4 в ткани эндометрия и уровень ряда цитокинов в сыворотке крови и перитонеальной жидкости [5; 21]. Определение экспрессии мРНК T-bet, GATA, Foxp3, а также TLR2 и TLR4 в ткани эндометрия проводили с помощью анализа полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для выделения тотальной РНК использовали набор «Trizol RNA Prep 100» (ИзогенLab., LTD, Россия), обратную транскрипцию и получения кДНК проводили, используя набор ОТ-1 фирмы «Синтол» (Россия), для определения уровня экспрессии и исследуемых генов использовали амплификатор CFX96 ™ Real-Time PCR DetectionSystems («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) и набор реактивов Maxima SYBR Green / ROX qPCRMasterMix (2X) (ThermoScientific, США). Специфические пары праймеров для анализа исследуемых и референсного генов были подобраны с помощью программного обеспечения PrimerBlast и изготовленные фирмой Metabion (Германия). Уровни цитокинов (интерлейкин (IL) -2, фактор некроза опухолей а (TNF-а), IL-4, IL-6, IL-10, IL-18) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
с использованием наборов фирмы «Вектор Бест» (Россия) на приборе «STAT FAX 303 PLUS».
Для изучения диагностической информативности комплекса иммунологических показателей, используемых для прогнозирования результатов лечения, был применен алгоритм, основанный на критерии Стьюдента в модификации Н.М. Амосова с соавт. (1975) [1]. Он заключается в сравнении частоты некоторого результата у больных при наличии исследуемого признака (Р1) со средней частотой этого же результата у всех больных, обследованных на данный показатель (Ро). Соответствующее математическое значение имеет вид:
t= Pi - Pq
I 2 2 ’
vm + m0
где: t — «ценность» признака (в баллах);
m1 и m0 — средние ошибки величин Р1 и Р0.
Таким образом, исчислялось значение информативности для всех исследуемых иммунологических показателей. Риск невозможности забеременеть без использования ВРТ оценивали на основании расчета суммы набранных баллов информативности показателей для каждой женщины.
Результаты и обсуждение
Для составления карты риска отбирали только те иммунологические показатели, прогностическая значимость которых превышала 1,65 балла [1]. Для исключения вероятности неправильного увеличения суммы баллов при анализе тесно взаимосвязанных факторов нами была изучена корреляционная связь между избранными иммунологическими показателями, в результате чего их число сократилось до 7 прогностических важных, уровень значимости (информативности) которых для прогнозирования результата лечения бесплодия у женщин с эндометриозом представлен в таблице 1.
Значимость иммунологических показателей для прогнозирования результата лечения бесплодия у женщин с эндометриозом
Коэффициент Показатель Значения Информативность
признака показателя показателя
х1 T-bet/GATA3 0,23-1,42 4,39
х2 GATA3 2-3,96* 3,19
хз IL-10 155,5-271 пг/мл 2,59
х4 Foxp3 0,11-0,34 * 2,39
х5 TLR2 9,23-16,65* 2,16
хб T-bet 0,89-2,99* 2,04
х7 IL-4 0,15-1,51 пг/мл 1,71
Примечание: * — относительное нормализованное количество кДНК
Была установлена четкая зависимость между величиной суммы баллов информативности иммунологических показателей и вероятностью риска неэффективного консервативного лечения бесплодия (табл. 2). Так, при сумме баллов до 4,75 вероятность ненаступления беременности составляла около 0 %; от 4,76 до 9,37 баллов — 30 %; от 9,38 до 13,24 баллов — 50 %; от 13,24 до 15,88 баллов — 70 %; от 15,89 до 18,46 баллов — 90 %; больше 18,47 баллов — более 90 %.
Таблица 2.
Информативность методики расчета иммунологических показателей для прогнозирования результата консервативного лечения бесплодия
у женщин с эндометриозом
Интервал значений иммунологических показателей (сумма баллов) Вероятность ненаступления беременности (%)
< 4,75 0
4,76-9,37 30
9,38-13,24 50
13,25-16,76 70
16,77-18,46 90
>18,47 >90
Как показали дальнейшие результаты клинических испытаний (табл. 3) на экзаменационной выборке (исследуемые женщины, n = 40), была получена относительно высокая точность правильных прогнозов относительно вероятности невозможности забеременеть — более 70 %, балл распределения равен 15,88.
Достоверность методики прогнозирования эффективности медикаментозного лечения бесплодия у женщин с эндометриозом
Варианты прогноза результатов лечения Полученные результаты лечения Всего
Беременность наступила Беременность не наступила
Прогнозирование наступления беременности 21 0 21
Прогнозирование отсутствия беременности 3 16 19
Всего 24 16 40
Это свидетельствует о возможности применения в лечебном процессе разработанной модели прогнозирования результатов лечения (табл. 4).
Таблица 4.
Характеристика чувствительности и специфичности модели расчета иммунологических показателей для прогнозирования результатов лечения
бесплодия у женщин с эндометриозом
Прогностические характеристики модели Результаты
Чувствительность модели (вероятность прогноза возможности забеременеть при отсутствии изменений иммунологических показателей) 0,88
Специфичность модели (вероятность прогноза невозможности забеременеть при наличии изменений иммунологических показателей) 1
Гипердиагностика 0
Гиподиагностика 0,13
Полученные результаты мы интепретировали с точки зрения иммунопатогенеза эндометриоза. Как показано выше (табл. 1), наиболее значимый вклад в прогнозирование результатов лечения имел показатель соотношения транскрипционных факторов дифференцировки Т-хелперов
1 типа — Tbet к транскрипционному фактору дифференцировки Т-хелперов
2 типа — GATA3. Низкие значения T-bet/GATA3 являлись предиктором плохого ответа на консервативную терапию, то есть пациенткам рекомендовано оплодотворение с помощью ЭКО или других методов вспомогательных репродуктивных технологий. Данные результаты можно объяснить тем, что у пациенток с эндометриозом наблюдаются увеличения экспрессии и T-bet и GATA3, но преимущественно GATA3, что изменяет нормальное соотношение
между двумя транскрипционными факторами и соответственно
цитокинами [10; 11; 18; 24].
Низкие значения экспрессии транскрипционного фактора регуляторных клеток Foxp3 указывали на риск отрицательного результата консервативного лечения. В этом случае успех наступления беременности ассоциировался с повышением экспрессии показателя, то есть приближения его к норме. Данная тенденция также согласовывается с данными литературы, так как известна важная роль регуляторных клеток в репродуктивном процессе [8; 20].
Зависимость эффективности лечения бесплодия от экспрессии мРНК TLR2 была обратно пропорциональной к уровню экспрессии и характеризовалась положительной связью в группе с самостоятельной беременностью при низких значениях показателей и при неудачах у пациенток с высокими значениями показателя. При этом важно сказать, что в последнее время к роли TLR2 и TLR4 в проблемах бесплодия приковано пристальное внимание. В частности, российскими учеными показано, что репродуктивные потери ассоциируются с повышением уровней TLR2 и TLR4, что связано с возможными инфекционными антигенами [3], а рядом других ученых поддерживается мысль, что толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs) могут быть одной из причин эндометриоза [17; 23]. Наши исследования подтверждают эти результаты [21]. При этом четко показано, что блокирование TLRs уменьшает размер эндометриоидных эктопий, а активация TLR2 через сигнальный путь посредством белка Myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) приводит к активации транскрипции ядерного фактора каппа-би (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-kB) и синтеза большого количества провоспалительных цитокинов [12; 17—19]. Также бактериальный липополисахарид, который является лигандом TLR4, потенциально стимулирует макрофаги к продукции провоспалительных цитокинов и факторов роста, таких как фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), IL-6 и TNF-a в брюшной полости [12; 18; 19]. При этом роль
провоспалительных цитокинов в патогенезе эндометриоза общепризнана, что подтверждается большим количеством исследований [9; 15; 18; 20; 22]. Интересные результаты получены по взаимосвязям итогов лечения бесплодия и уровнями провоспалительных цитокинов: резко повышенные уровни IL-10 указывают на высокую вероятность отсутствия результата медикаментозного лечения. Таким образом, незначительные изменения экспрессии GATA3, T-bet, соотношения T-bet/GATA3, незначительное снижение экспрессии Foxp3 в ткани эндометрия, невыраженные увеличения TLR2 и IL-10 ассоциируются с прогнозом успешного консервативного лечения бесплодия и, наоборот, значительные изменения этих показателей — с необходимостью использования ВРТ.
Выводы
1. Состояние иммунологической реактивности влияет на эффективность лечения бесплодия у женщин с эндометриозом.
2. При выборе подхода к лечению бесплодия у женщин с эндометриозом важно учитывать изменения уровней цитокинов сыворотки крови, экспрессии транскрипционных факторов Т-клеток и толл-подобных рецепторов в ткани эндометрия.
3. Показателями положительного прогноза консервативного лечения бесплодия являются незначительные изменения экспрессии GATA3, соотношения T-bet/GATA3, незначительное снижение экспрессии Foxp3 в ткани эндометрия, невыраженные увеличения TLR2, IL-4, IL-10 в сыворотке крови. Значительные изменения экспрессии GATA3, соотношения T-bet/GATA3, экспрессии Foxp3, TLR2 в ткани эндометрия, уровней IL-4, IL-10 в сыворотке крови являются показателями необходимости применения лечения с помощью ВРТ.
Благодарности: искренняя благодарность ректору Буковинского
государственного медицинского университета, профессору Тарасу Николаевичу Бойчуку за поддержку и помощь в выполнении данной работы, профессору Александру Михайловичу Юзьку и директору Центра лечения
бесплодия, доценту Тамаре Анатольевне Юзько за помощь в подборе
и исследовании пациентов на базе Центра.
Список литературы:
1. Амосов Н.М., Сидаренко Л.Н., Минцер О.П. и др. Факторы риска протезирования митрального клапана // Грудная хирургия. — 1975. — № 3. — С. 9—16.
2. Баскаков В.П. Эндометриоидная болезнь / В.П. Баскаков, Ю.В. Цвелев, Е.Ф. Кира. — СПб., 2002. — 452 с.
3. Ганковская Л.В. Роль механизмов врожденного иммунитета при невынашивании беременности инфекционного генеза / Л.В. Ганковская, О.В. Макаров, Л.В. Ковальчук, И.В. Бахарева и др. //Аллергология и иммунология. — 2007. — № 1. — Т. 8. — С. 311.
4. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.: Медицина, 1978.
5. Коваль Г.Д. Особенности системной и локальной продукции провоспалительных цитокинов у женщин с эндометриозом ассоциированным с бесплодием / Г.Д. Коваль, Н.В. Пашковская, О.А. Оленович и др. // Сборник материалов Международной научной конференции «Современные исследования медико-биологических наук: совершенствование диагностики, разработка средств профилактики и терапии болезней». Киров, 2013. — С. 67—73.
6. Кульбак С. Теория информации и статистика. — М: Наука, 1967. — 408 с.
7. Савицкий Г.А. Перитонеальный эндометриоз и бесплодие (клиникоморфологические исследования) / Г.А. Савицкий, С.М. Горбушин. — СПб.: ЭЛБИСПб, 2002. — 170 с.
8. Berbic M. The role of Foxp3+ regulatory T-cells in endometriosis: a potential controlling mechanism for a complex, chronic immunological condition / M. Berbic, A.J. Hey-Cunningham, C. Ng, N. Tokushige, S. Ganewatta, R. Markham // Hum Reprod. — 2010. — Vol. 25. — Р. 900—907.
9. Bersinger N.A. Analysis of cytokines in the peritoneal fluid of endometriosis patients as a function of the menstrual cycle stage using the Bio-Plex® platform / N.A. Bersinger, H. Dechaud, B. McKinnon et al.// Arch Physiol Biochem. — 2012. — Vol. 118, — № 4. — Р. 210—218.
10. Chakir H. T-bet/GATA-3 ratio as a measure of the Th1/Th2 cytokine profile in mixed cell populations: predominant role of GATA-3 / H. Chakir, H. Wang, D.E. Lefebvre, J. Webb, F.W. Scott // Immunol Methods. — 2003. — Vol. 278, — № (1-2). — Р. 157—169.
11. Chaouat G. The Th1/Th2 paradigm: still important in pregnancy? / G. Chaouat // Semin Immunopathol. — 2007. — № 29. — Р. 95—113.
12. Guo S.W. Nuclear factor-kappab (NF-kappaB): an unsuspected major culprit in the pathogenesis of endometriosis that is still at large? // Gynecol Obstet Invest. — 2007. — Vol. 63. — P. 71—97.
13. Herath S., Fischer D.P., Werling D. et al. Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus // Endocrinology. — 2006. — Vol. 147. — P. 562—570.
14. Hirata T., Osuga Y., Hirota Y. et al. Evidence for the presence of Toll-like receptor 4 system in the human endometrium // J. Clin Endocrinol Metab. — 2005. — Vol. 90. — P. 548—556.
15. Kalu E. Cytokine profiles in serum and peritoneal fluid from infertile women with and without endometriosis / E. Kalu, N. Sumar, T. Giannopoulos et al. // J Obstet Gynaecol Res. — 2007. — Vol. 33. — № 4. — Р. 490—495.
16. Kemp K.L. Lck Mediates Th2 Differentiation through Effects on T-bet and GATA-3/ K.L. Kemp, S.D. Levin, P.J. Bryce, P.L. Stein // J. Immunol. — 2010. — № 184. — Р. 4178—4184.
17. Khan K.N. Toll-like receptor system and endometriosis. / K.N. Khan, M. Kitajima, A. Fujishita et al. // J. Obstet. Gynaecol. Res. — 2013. — Vol. 39. — № 8. — P. 1281—1292.
18. Khan K.N., Kitajima M., Hiraki H. et al. Immunopathogenesis of pelvic endometriosis: Role of hepatocyte growth factor, macrophages and ovarian steroids // Am J Reprod Immunol. — 2008. — Vol. 60. — P. 383—404.
19. Khan K.N., Kitajima M., Hiraki K. et al. Escherichia coli contamination of menstrual blood and effect of bacterial endotoxin on endometriosis // Fertil Steril. — 2010. — Vol. 94, — № 7. — P. 2860—2863.
20. Khoufache K., Michaud N., Harir N. et al. Anomalies in the inflammatory response in endometriosis and possible consequences: a review // Minerva Endocrinol. — 2012. — Vol. 37, — № 1. — P. 75—92.
21. Koval H. mRNA TLR2 and TLR4 expression in the endometrium tissue in women with endometriosis assosiated with infertility / H. Koval, V. Chopiak, A. Kamyshnyi // Georgian medical News. — 2015. — № 7—8. — P. 7—12.
22. Kyama C.M. Potential involvement of the immune system in the development of endometriosis / C.M. Kyama, S. Debrock, J.M. Mwenda et al // Reprod Biol Endocrinol. — 2003. — № 1. — P. 123—132.
23. Latha M., Vaidya S., Movva S. et al. Molecular pathogenesis of endometriosis; Toll-like receptor-4 A896G (D299G) polymorphism: a novel explanation // Genet Test Mol Biomarkers. — 2011. — Vol. 15, — № 3. — P. 181—184.
24. Wong W.F. Interplay of transcription factors in T-cell differentiation and function: the role of Runx / W.F. Wong, K. Kohu, T. Chiba, T. Sato, M. Satake // Immunology. — 2011. — Vol. 132, — № 2. — Р. 157—164.
