CC BY
20
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Вып. 1 (177), 2019
УДК 633.853.52:631.52
DOI 10.25230/2412-608Х-2019-2-178-128-143
Обоснование критериев селекционного отбора форм сои с повышенной заморозкоустойчивостью на основе явления криогенной седиментации цитоколлоидов (обзор)
С.В. Зеленцов,
доктор сельскохозяйственных наук
Е.В. Мошненко,
кандидат биологических наук
Л.А. Бубнова,
научный сотрудник
ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 E-mail: [email protected]
Для цитирования: Зеленцов С.В., Мошненко Е.В., Бубнова Л.А. Обоснование критериев селекционного отбора форм сои с повышенной заморозкоустойчивостью на основе явления криогенной седиментации цитоколлоидов (обзор) // Масличные культуры. - 2019. - Вып. 1 (177). - С. 128-143.
Ключевые слова: соя, холодоустойчивость, заморозкоустойчивость, клеточный сок, цитозоль, цитоколлоиды, криогенная коагуляция, криогенная седиментация.
Серия экспериментов с промораживанием клеточного сока сои, люпина узколистного и льна обыкновенного при температурах от -3 до -20 °С и определением остаточных концентраций цитозо-лей позволила сформулировать основные положения коллоидной гипотезы заморозкоустойчивос-ти сои на основе явления криогенной седиментации цитоколлоидов. Согласно этой гипотезе цитоплазма сои представляет собой водно-коллоидный раствор (цитозоль). Коллоидные мицеллы цитозо-ля за счёт поверхностного заряда частично связывают молекулы воды, препятствуя её кристаллизации при докритических отрицательных температурах. Длительное воздействие отрицательных температур на переохлаждённый цитозоль ведёт к непрерывному уменьшению поверхностных зарядов коллоидных мицелл, их критическому взаимному сближению и объединению в крупные агрегаты (коагуляты) и гравитационной седиментации. Раствор цитозоля после выпадения коллоидов в нерастворимый осадок, приобретает свойства истинных растворов с близкой к 0 °С
точкой кристаллизации и стремительно кристаллизуется. Скорость коагуляции и седиментации цитоколлоидов соевого цитозоля определяется их структурной устойчивостью к криогенной потере поверхностных зарядов мицелл. Сформулированы основные критерии криоседиментационного метода селекционного отбора сои на повышенную заморозкоустойчивость и уравнение расчёта термодинамической устойчивости цитозоля к отрицательным температурам. Показано, что термодинамическая холодоустойчивость цитозоля сои будет тем выше, чем меньше разница между начальной и седиментировавшей при околокритических отрицательных температурах концентрациями и чем выше разница между околокритической и сверхкритической концентрациями цитозоля. С использованием ранневе-сенних полевых посевов и лабораторного криоседиментационного метода выделена и передана на государственное сортоиспытание серия холодоустойчивых сортов сои с полевой замороз-коустойчивостью в фазе примордиальных листьев до -5,0 °С.
UDC 633.853.52:631.52
Justification of the criteria of soybean selection for increased frost resistance based on the phenomenon of cytocolloids cryogenic sedimentation (review). S.V. Zelentsov, doctor of agriculture E.V. Moshnenko, PhD in biology L.A. Bubnova, researcher
V.S. Pustovoit All-Russian Research Institute of Oil Crops
17 Filatova street, Krasnodar, 350038, Russia E-mail: [email protected]
Keywords: soybean, cold resistance, frost resistance, cell fluid, cytosol, cytocolloids, cryogenic coagulation, cryogenic sedimentation.
A series of experiments with freezing of soybean, lupine and flax cell cytoplasm at temperatures from -3 to -20 °C, and determining residual concentrations of cytosols made it possible to formulate the main provisions of the colloidal hypothesis of soybean frost resistance based on the phenomenon of cryogenic cytocolloid sedimentation. According to this hypothesis, the cytoplasm of soybean is a water-colloidal solution (cytosol). The colloidal cytosol micelles, due to the surface charge, partially bind water molecules, preventing its crystallization at subcritical negative temperatures. The prolonged effect of negative temperatures on overcooled cytosol leads to a continuous decrease in the surface charges of colloidal micelles, their critical mutual approach and unification into coarse aggregates (coagulates) and gravitational sedimentation. The cytosol solution after the precipitation of colloids into an insoluble residue, acquires the properties of true solutions with a crystallization point near to 0 °C, and rapidly crystallizes. The coagulation and sedimentation rates of cytocolloids of soybean cytosol is determined by their
structural resistance to cryogenic loss of the surface charges of micelles. We formulated the main criteria of the cryo-sedimentation method of soybean selection for increased frost resistance and the equation for calculating the thermodynamic stability of the cytosol to negative temperatures. The article shows that the thermodynamic cold resistance of soybean cytosol will be the higher, the smaller the difference between the initial and sedimented concentrations at near-critical negative temperatures, and the higher the difference between the near-critical and above critical concentrations of the cytosol. Using the early spring field sowings and the laboratory cryo-sedimentation method, we selected and sent to the State variety trial a series of cold-resistant soybean varieties with the field frost resistance in the phase of primordial leaves up to - 0 °C.
Введение. Вследствие непрерывно усиливающейся аридизации целого ряда южных регионов России сельхозтоваропроизводители всё чаще отдают предпочтение выбору очень ранних сортов сои, успевающих созреть до наступления позднелетних пиков засух. Однако такие сорта, как правило, формируют пониженный урожай, по сравнению с более поздними сортами [7].
Одним из альтернативных путей решения проблемы повышения рентабельности полевого растениеводства в засушливых климатических зонах является сдвиг сроков посева яровых культур на более ранние и сверхранние сроки (конец зимы - начало весны), а в некоторых случаях (в климатических подзонах с мягкой зимой) даже их перевод на подзимние посевы [11]. Для этого необходимы холодоустойчивые сорта, обеспечивающие быстрые и дружные всходы, а также активное развитие растений в ранневесен-ний период на фоне пониженных положительных температур. Кроме этого, холодоустойчивые сорта должны отличаться повышенной заморозкоустойчиво-стью и выживать в случае наступления ранневесенних заморозков.
Мировой опыт изучения экологических требований растений к температуре окружающей среды показывает, что ранние яровые культуры, способные прорастать при пониженных положительных температурах, также способны выдерживать довольно глубокие заморозки - до
минус 8-12 °С [1]. Поэтому признаки холодоустойчивости и заморозкоустойчиво-сти вполне успешно сочетаются в одном генотипе и, вероятнее всего, являются следствием действия одних и тех же физиологических и биохимических реакций.
В имеющемся мировом генофонде культурной сои практически нет сортов, способных прорастать в условиях пониженных (ниже 6-8 °С) положительных температур. А ранневесенние заморозки ниже минус 2,5-4,0 °С являются причиной необратимого нарушения проницаемости мембран, замерзания клеточного сока в тканях и гибели растений подавляющего большинства образцов сои [5; 8; 10; 15].
До 2019 г. в Государственный реестр селекционных достижений РФ был включён только один холодоустойчивый сорт сои Славия селекции ФБНУ ФНЦ ВНИИМК, способный выдерживать неоднократные ранневесенние заморозки до минус 5 °С [4]. В то же время сорта сои с повышенной заморозкоустойчивостью имеют широкий потенциальный ареал распространения. Однако эффективность селекционных программ в этом направлении существенно ограничивается недостаточным пониманием внутренних механизмов заморозкоустойчивости сои, препятствующим разработке наиболее результативных методов выделения источников повышенной заморозкоустойчи-вости. Только изучение внутренних механизмов сои, обеспечивающих устойчивость к отрицательным температурам, позволит усовершенствовать существующие или разработать новые методы отбора на этот признак и повысить эффективность дальнейшей селекции на заморозкоустойчивость [3; 7].
Для объяснения особенностей отклика тканей сои на отрицательные температуры нами была сформулирована гипотеза криогенной седиментации коллоидов клеточного сока (коллоидная модель), в основе которой лежат физико-химические процессы, происходящие в переохлаждённой цитоплазме [5; 7]. Эта модель ос-
нована на том, что жидкая фаза цитоплазмы с физико-химических позиций представляет собой цитозоль, состоящий из сложного комплекса не только водорастворимых низкомолекулярных неорганических и органических веществ, образующих истинные растворы, но и высокомолекулярных белковых и углеводных соединений, образующих коллоидные растворы [14; 21; 22].
При этом точка замерзания истинного раствора описывается вторым законом Рауля [16]. Согласно этому закону, понижение температуры кристаллизации разбавленных растворов не зависит от природы растворённого вещества и прямо пропорционально молярной концентрации раствора. Эта закономерность описывается следующим уравнением (1):
Т ° г - Тг = Ыг = Кш, (1)
где Т°г - температура кристаллизации растворителя;
Тг - температура начала кристаллизации раствора;
К - криоскопическая постоянная растворителя, имеющая физический смысл температуры кристаллизации раствора с молярной концентрацией 1 моль/кг;
ш - молярность вещества в растворе.
Точки начала замерзания высокомолекулярных коллоидных растворов намного ниже, чем у истинных растворов, поскольку часть молекул воды в коллоидных мицеллах находится в связанном состоянии [14; 18]. Поэтому коллоидная модель вполне может объяснить тот факт, что при температуре тканей растений сои до минус 1 °С клеточный сок может оставаться в жидкой фазе неограниченно долгое время.
Термодинамическая устойчивость коллоидных систем во многом зависит от температуры среды, размеров коллоидных мицелл и их поверхностных зарядов. За счёт взаимного отталкивания частиц с одноимёнными зарядами и диффузионного
эффекта броуновского движения, мицеллы равномерно распределяются в объёме растворителя [2; 18]. На основании обнаруженного Р. Броуном явления броуновского движения, развитого А. Эйнштейном до теории, кинетическая устойчивость золя (жидкой фазы коллоидного раствора), прямо пропорциональна размеру коллоидных частиц [9; 12; 19]. При этом уравнение броуновского движения (2) Эйнштейна выглядит следующим образом:
X2 = Ш, (2)
где Х - расстояние между взвешенными частицами раствора;
Б - коэффициент диффузии частиц, зависящий от концентрации и плотности растворённого вещества;
I - время перемещения частиц в растворе на расстояние Х.
Роберт Броун, в 1827 г. впервые наблюдавший в капле воды хаотическое движение пыльцевых зёрен кларкии хорошенькой (С1аге1а ри1сИе11а РигеЬ.) из рода Кипрей, определил их размеры в 1/4000-1/5000 дюйма [20], что в метрической системе составляет около 5000-6000 нм. В 1908-1909 гг. Ж. Перрен, изучив размеры взвешенных в водном растворе сахарозы микрочастиц, фактически подтвердил визуальные измерения Р. Броуна и показал, что уравнение Эйнштейна описывает равновесно-диффузионные возможности броуновского движения размерами частиц 0,212-5,15 мкм (212-5150 нм) [12]. Таким образом, можно считать, что размеры коллоидных мицелл в равновесных цитозолях растений сои также не должны превышать 5000-6000 нм, или 5-6 мкм.
Материалы и методы. Исследования проводили в 2010-2017 гг. на центральной экспериментальной базе ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, г. Краснодар. В качестве совокупного критерия холодо- и замороз-коустойчивости сортообразцов оценивали их заморозкоустойчивость. Слабозамо-розкоустойчивыми стандартами в экспериментах служили сорта сои Лира и Чара.
В качестве сортообразцов с повышенной заморозкоустойчивостью использовали сорта сои Славия и Парма. В качестве вы-сокозаморозкоустойчивых растительных модельных объектов использовали люпин узколистный (сорт Смена) и лён обыкновенный (зимостойкая линия ФХЛ-М), с устойчивостью к отрицательным температурам до минус 12 и минус 20 °С соответственно.
Концентрацию цитозолей а (%) определяли на рефрактометре PR-10^ с погрешностью ±0,1 абс. % по методике Г.М. Саенко и С.В. Зеленцова [13]. Расчёт температур замерзания водных растворов на основе второго закона Рауля [16] выполняли с использованием on-line калькулятора [17].
В рамках эксперимента по изучению динамики концентрации цитозоля при промораживании у сортов сои Чара и Парма, в рулонах фильтровальной бумаги в термостате проращивали семена обоих сортов в течение 3 -х суток при температуре 25 °С. Затем извлекали из термостата проростки сои, среди них отбирали типичные, нормально развитые растения без признаков угнетения и болезней, опять закладывали в рулоны фильтровальной бумаги и помещали их в термостат, где выращивали в течение 5 суток при температуре 10 °С в условиях естественного освещения для имитации ранневесенних полевых условий с низкими температурами воздуха и почвы. После 5-суточной экспозиции растения измельчали и прессованием получали из них клеточный сок. Остальные рулоны с растениями помещали в криокамеру для промораживания при температуре минус 3 °С. После включения таймера из криокамеры с интервалом 0,5 ч извлекали по три рулона каждого сорта, из них также получали образцы клеточного сока, у которых на рефрактометре определяли концентрацию. Затем все образцы клеточного сока извлекали из криокамеры, закупоривали и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 ч для размораживания и завершения
процесса седиментации всего криоколло-идного комплекса. После этого ёмкости с клеточным соком откупоривали и повторно помещали в криокамеру. Вторичное промораживание образцов осуществляли при температуре минус 4 С. Измерения концентрации клеточного сока проводили в течение 4 ч с интервалом 0,5 ч. Все полученные результаты усредняли по трём повторениям в пределах каждого варианта.
Для оценки применимости выявленных у сои коллоидных факторов повышенной заморозкоустойчивости к другим растительным организмам дополнительно изучали динамику изменения концентрации клеточного сока при отрицательных температурах у люпина узколистного, сорта Смена и масличного льна ФХМ-Л. Для этого ранее описанным способом у этих сортообразцов получали проростки растений и отжимали клеточный сок.
Пробирки с растворами клеточного сока в трёх повторениях по каждому варианту помещали в криокамеру, отдельно при минус 5, при минус 15 и при минус 20 °С. После 24-часовой экспозиции при заданных температурных режимах пробирки извлекали из криокамеры, выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч для размораживания и завершения всех процессов коагуляции и седиментации. После этого у всех образцов определяли концентрацию жидкой фазы цитозолей.
Результаты исследований. Исходя из анализа литературы по физической, коллоидной химии и криохимии [2; 9; 14; 18; 21; 22], в случае реакции цитозоля сои на переохлаждение как коллоидной системы, его концентрация в период начального охлаждения может немного снизиться вследствие понижения электрического заряда на поверхности коллоидных мицелл, сопровождающегося высвобождением из них связанной воды и образования слабоконцентрированных областей цитоплазмы со свойствами истинных растворов. Затем в условиях
продолжающейся низкотемпературном потери заряда коллоидных частиц и сокращения расстояний между ними концентрация цитозоля должна увеличиваться из-за образования ячеистой гелеподобной пространственной структуры коллоидной фракции с вторичным связыванием свободных молекул воды на основе явления термообратимого гелеоб-разования. Дальнейшее снижение поверхностных зарядов и взаимное сближение коллоидных частиц приведут к начальной стадии их агрегации (коагуляции). Если масса коллоидных коагулятов превышает диффузионные возможности броуновского движения частиц по обеспечению равномерного распределения коллоидных мицелл в объёме растворителя (то есть размер частиц превысил установленные Р. Броуном размеры 6000 нм или 6 мкм), то в цитозоле развиваются процессы их гравитационного оседания (рис. 1).
Рисунок 1 - Коллоидная модель динамики
(о/.
концентрации а (%) цитозоля сои при промораживании
В результате седиментации микрокоагулятов в цитозоле возникает расслоение на верхнюю дисперсионную (водорастворимую) и нижнюю дисперсную (коллоидную) фазы. При дальнейшем нарастании массы коагулирующих коллоидных частиц их седиментация приобретёт более массовый характер. Общая концентрация цитозоля при этом должна резко снизиться до уровня ниже исходного, со сдвигом дисперсионно-коллоидной структуры исходного раствора цитозоля в сторону менее концентрированного истинного
раствора. При остаточных концентрациях 2-3 % точка замерзания такого цитозоля, в рамках второго закона Рауля, будет приближаться к нулю, и такой раствор быстро замёрзнет.
Длительное сохранение такого цитозо-ля в замороженном состоянии может приводить к дополнительному повышению его концентрации за счёт сублимационной возгонки молекул воды в соответствии с кристаллизационной моделью.
Для экспериментальной проверки коллоидной модели заморозкоустойчивости было проведено исследование откликов цитоплазмы сои на температуры минус 3 и 4 °С у сортов Чара и Парма, отличающихся по заморозкоустойчивости на начальных этапах онтогенеза. Дополнительно, с целью оценки возможного модифицирующего влияния на замороз-коустойчивость запасных веществ, поступающих в ткани растений из семядолей, у половины проростков каждого сорта заранее удаляли семядольные листья.
Если заморозкоустойчивость сои действительно определяется комплексом ци-токоллоидов, то после промораживания цитозоля этот комплекс должен коагулировать и выпасть в осадок, а концентрация оттаявшего клеточного сока станет меньше. При повторном помещении в среду с отрицательными температурами, при частичном или полном отсутствии в растворе цитоколлоидов, такой клеточный сок должен вести себя как истинный раствор. Для усиления процессов коагуляции и седиментации повторное промораживание осуществляли при более низкой (минус 4 °С) температуре.
Оценка концентрации клеточного сока в динамике показала, что в течение первых 7 ч замораживания этот параметр возрастал у обоих сортов на вариантах с семядолями и с их удалением. При этом образцы клеточного сока, полученные из растений без семядолей, отличались пониженной концентрацией. И только на
конечном этапе промораживания (последние 0,55 ч - для сорта Чара, и 2,5 ч для сорта Парма) разница в концентрациях, цитозоля растений с семядолями и с их удалением практически нивелировалась, (рис;. 2).
О 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 0,5 1,5 2,5 3,5
1=1 после морозный период седиментации КПК ВРемя экспозиции, ч цитозоль растений с семядолями до звмораживания
— О— цитоз оль растений с семядолями после размораживания
—цитоз оль растений без семядолей до замораживания
— •Ж— цитоз оль растений без семядолей после размораживания
Рисунок 2 - Динамика концентрации со (%) клеточного сока сортовЧара и Парма при последовательной
экспозиции приминус 3 иминус 4 °С
После размораживания клеточного сока его концентрация! оказалась ниже по сравнению с исходным уровнем в начале эксперимента. Затем при вторичном промораживании на фоне температуры минус; 4 °С концентрация цитозоля, в соответствии с коллоидной! моделью), начала возрастать. И через 4 ч экспозиции возросла у сорта Чара до 7,1-7,4 %, у сорта Парма - до 77,8-77,9 %.
Как и при первичном промораживании при минус 3 °С, в начале экспозиции при температуре минус 4 °С на вариантах с удалением семядолей у обоих сортов была выявлена пониженная концентрация клеточного сока. Следует отметить., что этот факт указывает на значимый вклад семядолей в формирование цитозоля у сои. Только через 3 ч у сорта Чара и через 4 ч у сорта Парма концентрация клеточного сока на этих вариантах сравнялась. с концентрацией! образцов без удаления; семядолей.
У более заморозкоустойчивого сорта Парма после 7-часового воздействия от-
рицательных температур седиментацион-ное снижение концентрации клеточного сока о)Сг. (%) оказалось больше по сравнению с показателями цитозоля сорта Чара, как в варианте с удалением семядолей!, так и без их удаления), что указывает на выпадение из цитозоля в осадок большего количества коллоидов (табл. 1)).
Таблица 1
Сортовые различия по седиментационному снижению концентрации цитозоля после 7-часовой экспозиции приминус 3 °С
Сорт Исходная конце» трация цитозоля в растениях. ю™(%) Концентрация цитозоля после седиментации коллоидов, (%) Разница концентраций между исходным и седи-ментированным цитозолем, Аа> (%)
с семядолями без семядолей с семядолями без семядолей с семядолями без семядолей
Чара 4,'7 4,2 3,9 3,4 0,8 0,8
Парма 5,(5 4,6 4,5 3,6 1,1 1,0
Таким образом, можно утверждать, что повышенная устойчивость. сорта Парма к отрицательным температурам, определяется как повышенной концентрацией раствора цитозоля в целом, так и повышенной массовой! долей криопротек-торных коллоидов в цитозоле.
В целом, анализ результатов проведённого эксперимента показал, что в условиях отрицательных температур, динамика концентрации клеточного сока у сои вполне адекватно описывается коллоид ной моделью), В рамках этой модели в цитоплазме растений сои можно предположить наличие определённого комплекса обладающих криопротекторными свойствами коллоидов. Выявленные между сортами сои с различной устойчивостью к отрицательным температурам различия в динамике остаточных после седиментации концентраций цитозоля позволяют их использовать в качестве нового критерия при лабораторной оценке сорто-образцов сои на заморозкоустойчивость.
Согласно нашим экспериментальным наблюдениям, при понижении температурь, цитозолей сои до минус 1,0-1,5 °С они
остаются в жидкой фазе, с полным сохранением жизнеспособности органелл клеток. Однако дальнейшее понижение температур ниже критического уровня заморозко-устойчивости сои (до минус 4-5 °С и ниже) приводит к их постепенной кристаллизации. При этом, согласно литературным данным [9; 14; 18], у коллоидных мицелл последовательно снижается величина поверхностного заряда, вплоть до нулевых значений. В результате потери заряда коллоидные частицы сближаются между собой, коагулируют в укрупнённые агрегаты и выпадают в осадок. Модельный эксперимент с промораживанием клеточного сока сои в течение 5 ч до минус 5 и 15 °С подтверждает эти заключения (рис. 3).
б
Рисунок 3 - Развитие седиментационного
процесса при промораживании профильтрованного клеточного сока сои,
сорт Лира: а - исходное состояние цитозоля, концентрация раствора - 4,7 %; б - после промораживания при минус 5 °С, концентрация раствора над осадком - 3,6 %; в - после промораживания при минус 15 °С, концентрация раствора над осадком - 3,4 %
Прозрачность клеточного сока в пробирке на рис. 3а определяется тем, что коллоидные мицеллы равномерно распределены в растворе, а их линейные размеры меньше длин волн видимого спектра света, то есть менее 380-780 нм. Вследствие чего световые волны свобод-
но огибают цитоколлоидные частицы, а не отражаются от них. Исходная концентрация цитозоля у сорта Лира в этом эксперименте составила 4,7 %.
На рис. 3б помутнение клеточного сока в верхней части пробирки вызвано коагу-ляционным укрупнением коллоидных частиц, размеры которых уже превышают длины волн видимого света (> 380780 нм), Но поскольку эти видимые частицы ещё поддерживаются броуновским движением во взвешенном состоянии, их размеры не должны превышать 50006000 нм.
В таком цитозоле уже на начальных стадиях коагуляции часть ранее связанных на поверхности мицелл молекул воды высвобождается. В результате между укрупнёнными коллоидными агрегатами образуются менее концентрированные области со свойствами, приближающимися к истинным растворам, снижающие общую концентрацию цитозоля, в данном случае до 3,6 %. Светлая взвесь в нижней половине пробирки на рис. 3б - более крупные (> 6000 нм) седиментировавшие коллоидные коагуляты, опускающиеся ко дну пробирки под действием гравитации.
На рис. 3е процессы коагуляции и седиментации, в основном, уже завершены и на дне пробирки сформировался непрозрачный осадок. Объём цитозоля над осадком практически прозрачен, в нижней части с небольшими областями помутнения. Большинство ранее связанных коллоидами молекул воды высвобождены, что привело к дальнейшему снижению концентрации жидкой фазы цитозоля. Его компонентный состав в этой фазе, преимущественно, должен состоять из продуктов фотосинтеза и гидролиза крахмала в семядолях - моно- и дисахаридов, а также, возможно, небольшой части более криостабильных коллоидов. В нашем эксперименте остаточная концентрация цитозоля составила 3,4 %. При расчёте точки замерзания по молярной массе глюкозы (180,16 г/моль), этот параметр составляет всего минус
а
в
0,36 °С; по молярной массе сахарозы (342,2965 г/моль) ещё выше - минус 0,19 °С [17].
Можно сделать предположение, что термодинамическая стабильность переохлаждённого цитозоля сои должна определяться как массовой долей коллоидных фракций в исходном растворе, так и устойчивостью электрических зарядов их мицелл, определяющих скорость коагуляции и седиментации при воздействии отрицательных температур.
Тогда сортообразцы сои с повышенной заморозкоустойчивостью в условиях околокритических отрицательных температур, например, при минус 2,5-5,0 °С, должны отличаться пониженной коагуляцией и седиментацией цитоколлоидов. При этом в их клеточном соке массовая доля коллоидной фракции теоретически должна быть выше, чем у обычных образцов. Поэтому в случае длительного охлаждения высокозаморозкоустойчивых образцов до сверхкритических для сои (ниже минус 5 °С) температур, вследствие массовой коагуляции потерявших заряды коллоидных частиц, общий объём выпавших в осадок коагулятов должен быть больше по сравнению со слабозамо-розкоустойчивыми образцами сои.
Для проверки этого предположения перед промораживанием образцов клеточного сока слабозаморозкоустойчивого сорта Лира и высокозаморозкоустойчивого сорта Славия, с целью визуализации дисперсной и дисперсионной фаз, в пробирки с клеточным соком добавляли 1%-ный раствор бисдиметиламинофенотиоцианит хлорида С16Н18СШ^ (метиленовый синий) в пропорции 1 : 10. Использование метиленового синего было обусловлено тем, что ранее нами было экспериментально установлено, что этот краситель длительное время сохраняет свою окраску в истинных растворах, но вступает в реакции с коллоидными мицеллами с образованием неокрашенных соединений.
Визуальный анализ изначально равномерно окрашенных образцов цитозоля,
после их 24-часовой экспозиции при минус 5 °С и завершения всех процессов коагуляции и седиментации, показал заметные различия между сортами (рис. 4).
Как следует из рисунка 4, в исходном состоянии цитозоли обоих сортообразцов сои были непрозрачными и имели равномерно голубую окраску. После 24-часового промораживания цитозоль слабоустойчивого к отрицательным температурам сорта Лира разделился на три фазы (рис. 46).
а б в
Рисунок 4 - Криоседиментационное фракционирование цитозоля двух сорто-образцов сои с различной заморозко-устойчивостью после 24-часовой экспозиции при температуре минус 5 °С: а - исходное состояние цитозоля обоих образцов сои; б - цитозоль слабозаморозкоустойчивого сорта Лира после промораживания; в - цитозоль высокозаморозкоустойчивого сорта Славия после промораживания
В нижней части сформировался коричневатый осадок из седиментировавших коагулятов. Среднюю часть занимает полупрозрачный раствор с очень мелкими светлыми частицами микроагрегатов коллоидов. В самом верхнем слое цитозоля расположен непрозрачный голубой слой, предположительно представляющий собой близкий к истинному раствор из водорастворимых соединений.
Цитозоль высокозаморозкоустойчиво-го сорта Славия расслоился на четыре фазы (рис. 4е). В придонной части также образовался коричневатый осадок коагулятов. Однако его объём несколько меньше аналогичной фракции у цитозоля сорта Лира. Средняя часть столба цитозоля оказалась разделена на две фазы. В нижней половине этой части цитозоль полупрозрачен, с видимыми мелкими частицами микрокоагулятов. Верхняя половина средней части столба цитозоля стала практически прозрачной и не имела видимых включений. Однако на просвет в ней заметны признаки опалесценции (слабого рассеяния света), свойственные коллоидным растворам. Самый верхний, окрашенный метиленовым синим, слой оказался в два раза меньше по сравнению с цитозолем сорта Лира.
В целом этот эксперимент показал, что у более заморозкоустойчивого образца сои при суточном промораживании при минус 5 °С в осадок выпало меньше коагулятов. При этом часть цитоколлоидов при таком режиме промораживания оказалась термодинамически устойчивой без видимых признаков коагуляции.
Для изучения связи степени заморозко-устойчивости с общим количеством коллоидов в цитозоле оценили объёмы выпавших в осадок коллоидных коагулятов при длительной экспозиции клеточного сока при сверхкритических для сои отрицательных температурах в криокаме-ре. В эксперименте использовали полученный ранее описанным способом клеточный сок тех же сортов сои Лира и Славия с различной степенью заморозко-устойчивости.
После 24-часовой экспозиции при минус 15 °С пробирки с клеточным соком извлекали из криокамеры, выдерживали при комнатной температуре в течение 8 ч для размораживания и завершения всех процессов коагуляции и седиментации. После этого пробирки с седиментировав-
шими цитозолями визуально анализировали (рис. 5).
■ ¿я
Ж. '4
Рисунок 5 - Объёмы криоседиментацион-
ных осадков в цитозоле сортообразцов сои с различной заморозкоустойчивостью после 24-часовой экспозиции при температуре минус 15 °С: а - цитозоль слабозаморозкоустойчивого сорта Лира после промораживания; б - цитозоль высокозаморозкоустойчивого сорта Славия после промораживания
Как следует из рисунка 5а, объём выпавших в осадок коагулятов в цитозоле сорта Лира оказался даже несколько меньше по сравнению с его объёмом при седиментации на фоне минус 5 °С. По всей вероятности, в предыдущем эксперименте на момент фотофиксации гравитационное осаждение коагулятов ещё не полностью завершилось. В целом можно предположить, что для термодинамической стабильности цитоколлоидов слабо-замороз-коустойчивого сорта Лира отрицательные температуры на уровне минус 5 °С уже оказались закритически-ми, и большинство коллоидных мицелл, потеряв поверхностный заряд, коагулировали и выпали в осадок. Более низкие температуры практически не оказали зна-
чительного влияния на изменение объёма коагулятов.
Объём седиментировавших коагулятов цитоколлоидов у более заморозкоустой-чивого сорта Славия после 24-часового промораживания при минус 15 °С визуально оказался заметно больше (см. рис. 5б). Следовательно, общий объём цито-коллоидов в цитозоле более устойчивого к заморозкам сорта Славия превышал этот показатель у слабозаморозкоустой-чивого сорта Лира. При промораживании этого же сорта при минус 5 °С количество коагулятов в его цитозоле было меньше, чем у сорта Лира, что указывает на повышенную термодинамическую стабильность поверхностных зарядов коллоидной фракции при минус 5 °С цитозоля сорта Славия.
В целом проведённые эксперименты показали, что повышенная заморозко-устойчивость сои в рамках гипотезы отсроченной криогенной седиментации коллоидов может определяться как их массовой долей в цитозоле, так и повышенной стабильностью поверхностных зарядов мицелл при отрицательных температурах, удерживающих их от взаимного сближения, коагуляции и седиментации.
Исходя из результатов предыдущих экспериментов с образцами сои, более высокая заморозкоустойчивость люпина узколистного и льна обыкновенного гипотетически также может определяться как более высокой, по сравнению с соей, массовой долей коллоидов в цитоплазме, так и повышенной стабильностью заряда поверхности коллоидных мицелл при отрицательных температурах. Если одно из этих предположений подтвердится, то можно будет говорить об определённой универсальности цитоколлоидного механизма заморозкоустойчивости, а возможно, и морозоустойчивости у цветковых растений.
Для проверки этого предположения образцы клеточного сока двух сортов сои Лира и Славия с различной заморозко-
устойчивостью, а также образцы клеточного сока люпина и льна одновременно при одних и тех же условиях в течение 24 ч промораживали в криокамере отдельно при температурах минус 5, при минус 15 и при минус 20 °С.
Анализ концентрации седиментировавших цитозолей изучаемых образцов показал, что при суточной экспозиции в криокамере при температуре минус 5 °С образец цитозоля сорта сои Лира с низкой заморозкоустойчивостью уже отличался значительным (на 1,2 абс. %, или на 28 относит. %) снижением концентрации цитоплазмы за счёт интенсивной седиментации коагулятов. Концентрация цитозоля более заморозкоустойчивого сорта сои Славия при этих условиях снизилась всего на 0,5 абс. %, или на 12 относит. %. Цитозоли люпина узколистного и масличного льна после 24-часового промораживания при минус 5 °С остались в жидкой фазе без видимых признаков коагуляции и седиментации коллоидов. Их концентрация также оставалась на уровне исходных значений (рис. 6).
т
..............£—
I
- .....— —4
----- ........................ т \
Т
исходная -5 -15 -20
Температура промораживания цитозоля, °С
•^^Сорт сои Лира с устойчивостью к заморозкам до минус 2,5 °С
Сорт сои Славия с устойчивостью к заморозкам до минус 5,0 °С -й- Образец люпин а Смена с устойчивостью к морозам до минус 12,0 °С -О- Линия льна ФХЛ-М с устойчивостью к морозам до минус 20,0 "С
Рисунок 6 - Концентрации а (%) цитозо-лей образцов сои, люпина узколистного и масличного льна после суточного промораживания при температурах минус 5, минус 15 и минус 20 °С
При промораживании при минус 15 °С седиментационное снижение концентра-
ции цитозоля слабозаморозкоустойчивого сорта сои Лира уменьшилось всего на 2 относит. % относительно режима промораживания при минус 5 °С - до 3,0 абс. %, и составило 70 относит. % от исходного состояния. В то же время у высокоустойчивого к заморозкам сорта сои Славия снижение концентрации цитозоля от исходного уровня составило 1,6 абс. %, или 38 относит. %. При этом же режиме промораживания отмечена частичная кристаллизация клеточного сока и незначительное (на 0,3 абс. %, или 9 относит. %) уменьшение концентрации цитозоля у люпина. Ци-тозоль линии льна ФХЛ-М оставался в жидкой фазе и сохранил исходный уровень концентрации.
Экспозиция цитозолей обоих образцов сои при минус 20 °С практически не повлияла на изменение их остаточной концентрации по сравнению с их экспозицией при минус 15 °С. При этом концентрация цитозоля люпина снизилась почти в два раза (на 47 относит. %) по сравнению с исходным уровнем. Концентрация цитозоля самого устойчивого к отрицательным температурам в опыте образца льна ФХЛ-М только при снижении температуры до минус 20 °С начала снижаться, составив 2,0 абс. %, или 80 относит. %, от исходного уровня.
В целом, полученные экспериментальные результаты показывают, что наиболее заморозко- и морозоустойчивые в опыте образцы люпина и льна отличаются самой высокой стабильностью концентрации цитозоля при 24-часовой экспозиции на фоне отрицательных температур минус 15 и минус 20 °С. При этом самый морозоустойчивый образец -линия масличного льна ФХЛ-М, характеризовался минимальной в опыте исходной концентрацией цитозоля - 2,5 абс. %. Второй по криоустойчивости образец -цитозоль люпина узколистного с полевой устойчивостью к морозам до минус 12 °С, имел исходную концентрацию клеточно-
го сока 3,4 абс. %, что было на 0,90,8 абс. % ниже, чем у сортов сои Лира и Славия.
При анализе динамики концентраций у образцов сои у высокозаморозкоустойчи-вого сорта Славия при критической для сои температуре минус 5 °С выявлено меньшее, в сравнении сортом Лира, снижение концентрации цитозоля. Это также может свидетельствовать о повышенной устойчивости цитоколлоидов сорта Сла-вия к криокоагуляции. В то же время у этого сорта подтверждено наличие увеличенного количества седиментировавших коллоидов в условиях сверхкритических отрицательных температур (минус 15 °С).
Таким образом, можно считать подтверждённым на образцах цитозолей трёх видов растений (соя культурная, люпин узколистный и лён обыкновенный) двух семейств (сем. Бобовые и Льновые), что признак повышенной заморозкоустойчи-вости преимущественно определяется криостабильностью поверхностных зарядов коллоидных мицелл при критических отрицательных температурах, сдерживающих их сближение и коагуляцию. Для сои дополнительным фактором уровня заморозкоустойчивости также может быть увеличенная доля коллоидной фракции цитозоля.
Серия проведённых экспериментов и всесторонний анализ полученных результатов позволили нам сформулировать основные положения коллоидной гипотезы заморозкоустойчивости сои на основе явления криоседиментации цитоколлоидов:
1. Цитоплазма сои представляет собой водно-коллоидный раствор (цитозоль), включающий, помимо истинных растворов низкомолекулярных неорганических и органических водорастворимых соединений, гидратированные коллоидные фракции с различной молекулярной массой и физико-химическими свойствами.
2. Присутствующие в цитозоле коллоидные мицеллы за счёт поверхностного заряда частично связывают молекулы воды, препятствуя её кристаллизации при докритических (для сои - до минус 1,01,5 °С) отрицательных температурах. Поэтому связанная вода имеет пониженную точку кристаллизации в отличие от несвязанной воды, точка кристаллизации которой определяется только концентрацией водного раствора.
3. На первых этапах понижения температуры цитозоля до отрицательных значений цитоколлоиды некоторое время сохраняют поверхностный заряд мицелл, препятствующий их сближению и коагуляции, обеспечивая сохранение цитозоля в состоянии переохлаждённого коллоидного раствора, также позволяющего сохранять полную жизнеспособность органоидов и мембран клеток сои.
4. Дальнейшая экспозиция цитозоля при отрицательных температурах, за счёт формирования из коллоидных мицелл рыхлых пространственных структур, приводит к его постепенному застудневанию с сохранением части молекул воды в связанном состоянии. Это временное (в зависимости от значений отрицательных температур - от 1 до 5-6 ч) агрегатное состояние цитозоля позволяет сохранять жизнеспособность всех органоидов и мембран клеток сои.
5. Длительное воздействие отрицательных температур на переохлаждённый цитозоль ведёт к непрерывному уменьшению поверхностных зарядов коллоидных мицелл, их критическому взаимному сближению и объединению в крупные агрегаты (коагуляты) и гравитационной седиментации. Раствор цитозоля после выпадения коллоидов в нерастворимый осадок приобретает свойства истинных растворов с близкой к 0 °С точкой кристаллизации и стремительно кристаллизуется.
6. Увеличение массовой доли цитокол-лоидов в цитозоле приводит к увеличению доли связанной воды с пониженной точкой кристаллизации и более интенсивному застудневанию переохлаждённо-
го цитозоля с более длительной отсрочкой его кристаллизации.
7. Скорость коагуляции и скорость седиментации цитоколлоидов соевого цито-золя определяется их структурной устойчивостью к криогенной потере поверхностных зарядов мицелл. Чем стабильнее поверхностный заряд в низкотемпературных условиях, тем более устойчив коллоид к криокоагуляции и седиментации.
Положения коллоидной гипотезы позволяют сформулировать основные элементы и этапы криоседиментационного метода селекционного отбора сои на повышенную заморозкоустойчивость. Эти критерии включают в себя следующие шаги:
1. Определение исходной концентрации клеточного сока (цитозоля) в фазе растений с максимальной вероятностью попадания под заморозки. При очень раннем посеве сои под ранневесенние заморозки вероятнее всего попадут растения в фазе семядольных и приморди-альных листьев.
2. Определение концентрации цитозо-ля в образцах после 5 -7 ч (вероятный период воздействия заморозка) промораживания при заданных околокритических отрицательных температурах (например, при минус 5 °С).
3. Определение концентрации цитозоля в образцах после 5-7 ч промораживания при сверхкритических отрицательных температурах (например, при минус 15 °С), при которых в осадок выпадает основная часть коллоидной фракции цитозоля.
4. Все три значения концентрации ци-тозоля, включая исходную, после промораживания при минус 5 °С и после промораживания при минус 15 °С используются для определения степени холодоустойчивости с применением разработанного нами уравнения термодинамической устойчивости цитозоля к отрицательным температурам (3).
Сг = {Ют. - Юег) = (Шсг. - Юцаг.)
(3)
где Сг - индекс термодинамической устойчив ости цитозоля к отрицательным температурам; - начальная концентрация цитозоля;
асг. - концентрация цитозоля, седи-ментировавшего при околокти -тических отрицательные температурах, приводящих к развитию криоповреждетий растений; - тонцеттрация цитозоля, седи-ментировавшего при сверхкритических отрицательные температурах, приводящих к необратимой криогирйли тистений;
А а> 1 - ттзницт межтду начальной и околокритической концентрациями титозоля;
Аа>2 - разница между околокритической и сверхкритичеекой концентрациями титозоля.
Согласно уравнению (3) термодинами-ческея холодоустойчивость цитозоля будет тем выппе, чем меньше разница межрду начальной и тедиментировавшей при окооо-тритичестих отрицательных темтературах концентрациями и чем выше разница между околокритичеткой и сверхкриточеской йцнцеетряциями цитоз оля.
Проктическую ирименимость криоседи-ментационного метода ощтнки зя]морозко-тстойчивости оценивши при изучении цлееочноео сока кертии линий сои, выделившихся в 2013 г. при очент ранних посе-ттх (2(5 марта) по признаку повышенной холодоустойчив ости (табл. 2).
Как следует из таблицы 2 , слабозамо-розкоустойчивые сортообразцыр пдо про-мораж!Рваоти в условиях околокритических (минус 5 °С) температур отличалик!-повы]шснны1м седиментационным снижением концентрации цитозоля (но 25 относ. %). Снижение концентрации цитозоля при минус 1з °С окозалось незначительно вы1ше -относительно исходного уровня нц 27-р9 орнос. %. Индекс холодоустойчивости Сг у этих образцов составил Сг = 0,08-0,15.
Hткдекзамотозкoцрроотинык утиши №2 28)6 и 2823 рругтзугрв неркрувкр мкевшгм регжкегкм крнпенртзпии ци%-зрур ктт мтоцр 5 °С - на, 20-22 ряорр . %. Но кти минцр )И °(Н крнпенттзпир ии ци-тозоуко конизиузрв oреррирeувер ириод-иргр цтрнор уже та 29-33 ртнрр. %. Кодекс ирурйрцрррочинррри ц эрии уинио ррррaниу Сг = 0,40-0,55.
Ктиoркдимкнрапионнoк цменвшение крнпкнртзпии цирозоур щои миоцр И °Л ктзкриткски ц вскх COTPPoTе)ИЗПOB р ко-вцIшеннoо замoтoзкoyрркИтивoррвю Выуо н 2,0—:а,И рззз медыпе по ртзнпкесию сбо aузДоззмртPзерцрроочивоо гтцккоо оД-Пззп он и роррзнурур нрего рО—из рро:ор. %. Пти миоцр 1И °нс к рнцкнттацир ии цирр-зoукiЗ yмкнвшиуарв знзтиркувнкк - оз З1?— 43 oрнoрие. %о. Иодекры ирурйрцoррочи-нсрри н кекйкузи эроо -туппы натвитонз-уи н ктедкузи Сг = 2^0-2,^.
Одио из рзмыи иоуойоцрроочиныи оД-тазцон - уинин №И 28И9 (Л-2И77 х Aldana) с иоде^ом ирурйрцрррочинррри Сг = 2,80 код кoммкнчкерим тI3Знзникм «ИтДир» в 20)6 г. Дыщ кетейзн оз Гoрyдзеренкннoк coтрсoткыгсзние [6]. Л 20)0 г. ирурдо-yрррочaoцш ротр рои ИтДие нкуючён н Госцй3]вc;рнкннцIiз тккcрт реуекпирнных TTPPиженио РФ и дonцIикн к иркоувзонз-нию н Лквктo-Кавказcкoм и Ценртзувнр-Чке)нрзёмнрм ткгирнзи РФ.
Ещё одта ирурйрцтрр0чисaя уинир №° 2842 (и.о. Пзтмз) р индккcoм ирурдо-TC'зкочинрcри Сг = 2,67 код комметчерким натнзнием «<БзтP»> nттиoдтр гррцйзтрр-кешюе cрттриcпырьник н Ленето-Канoтзркрм, Ценрратвнр-Четнрзëмнрм и Дзувненррррчнрм ркгионаи РФ р 0T°8 г. В ни в 8 г. оз Гррцйзтхрненнре ротроиркыра-оие код комметчерким нззнзнием ««Коико» Дыуз кетедннт ртервр ирурйрцрррочинзр (Сг = 2, 67) уинир № 284И (Беуоготркзр х Фота).
Таблица 2
Сортовые различия некоторых сортов и холодоустойчивых линий сои по седиментационному снижению концентрации цитозоля при промораживании при минус 5 и минус 15 °С
№№ дел. Проис -хождение, гибридная комбинация Исходная концентрация цитозоля, ®и. (%) Концентрация цитозоля птсле промораживания, ®sed.(%) Разница концентраций исходного и седиментировавшего цитозоля Индекс холодоустойчивости, Cr (До с /Дод)
при -5 °С, Дю 1 (ос in._CO cr.) при--5 °С, До 2 ((О cr.-OJscr)
при -5 °С, ®cr.(%) при -15 °С О ccr. (%) абс. % относ. % абс. % отнот. %%
Низкая заморозкоустойчивость, до минус 2,5 °С
- Лира 44,8 3,6 3,5 1,2 25 0,1 22 0,08
- Чара 5,1 3,8 3,6 1,3 25 0,2 29 0,15
Средняя заморозкоустойчивость, до минус 3,5 °С
2816 Вилана х Predator 44,9 3,9 3,5 1,1 20 0,(5 29 0,55
2823 Вилана х Донька 5,1 3 ,4 1,0 22 0,44 33 0,40
Повышенная заморозкоустойчивость, до минус 5,0 °С
- Славия 5,1 4,5 2,9 0,6 12 1,6 44 2,67
2842 и.о. Парма 5,3 3,1 0,6 11 1,6 44 2,67
2845 Белогорская х Фора 5,2 4,6 3,0 0,6 12 1,6 44 2,67
2858 Aldana х Фора 5,1 3,2 0,5 10 1,44 37 2,80
2859 Л-2577 х Aldana 5,0 4,5 3,1 0,5 10 1,44 38 2,80
2863 Славия х Фора 5,2 4,5 3,1 0,7 13 1,44 44 2,00
Выводы. Таким образом, проведённые исследования позволили сформулировать основные положения коллоидной гипотезы заморозкоустойчивости сои на основе явления криоседиментации цитоколлоидов.
Предложенная гипотеза убедительно описывает такое явление, как длительная устойчивость к кристаллизации цитозоля сои при температурах до минус 1,0—1,5 °С. В рамках этой гипотезы показано, что сохранение переохлаждённого цитозоля сои в жидкой фазе определяется массовой долей цитоколлоидов и термодинамической стабильностью их поверхностных зарядов при отрицательных температурах.
Сформулированы основные элементы криоседиментационного метода селекционного отбора сои на повышенную замо-розкоустойчивость и уравнение расчёта термодинамической устойчивости цитозоля к отрицательным температурам.
Показано, что термодинамическая холодоустойчивость цитозоля сои будет тем выше, чем меньше разница между начальной и седиментировавшей при околокритических отрицательных температурах концентрациями и чем выше разница между околокритической и сверхкритической концентрациями цитозоля.
С использованием ранневесенних полевых посевов и лабораторного криоседиментационного метода выделена и передана на государственное сортоиспытание серия холодоустойчивых сортов сои с полевой заморозкоустойчивостью в фазе примордиальных листьев до минус 5,0 °С.
Список литературы
1. Березина H.A., Афанасьева Н.Б. Экология растений. - М.: Изд. центр «Академия», 2009. - С. 181-187.
2. Биохимическая термодинамика / Под ред. М. Джоунса, пер. М.Г. Гольфельда - М.: Мир, 1982. -С. 204-205.
3. Бубнова Л А., Зеленцов C.B. Отбор заморозко-устойчивых генотипов сои на ранних этапах онтогенеза - Современные тенденции в сельском хозяйстве // Сб. тр. I Ме^дунар. интернет-конф. - Казань: ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) Федеральный университет, 15-17 октября 2012 г. - С. 39-43.
4. Зеленцов C.B., Мошненко Е.В. Перспективы использования сверхранних посевов сои в услови-
ях Краснодарского края // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2010. - Вып. 1 (142143). - С. 87-94.
5. Зеленцов C.B., Мошненко Е.В., Рябенко Л.Г., Зеленцов B.C., Будников E.H., Бубнова Л.А., Вайлова A.B. Роль цитоколлоидов в формировании морозо- и заморозкоустойчивости яровых культур на примере сои и льна // Проблемы современной науки и образования. - 2015. - № 12 (42). - С. 102-107.
6. Зеленцов C.B., Мошненко Е.В., Ткачёва А.А, Рамазанова С.А., Трунова М.В., Будников E.H., Бубнова Л.А., Олейник В.И. Высокобелковый холодоустойчивый сорт сои Ирбис // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2017. -Вып. 3 (171). - С. 115-119.
7. Зеленцов C.B., Мошненко Е.В., Бубнова Л.А., Зеленцов B.C. Некоторые аспекты устойчивости растений к отрицательным температурам на примере сои и масличного льна. // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2018. - Вып. 2 (174). - С. 55-70.
8. Кошкин E.H. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. - М.: Дрофа, 2010. - С. 80-121; 123-148.
9. Левченков С. И. Физическая и коллоидная химия. Ч. 4. Коллоидная химия. - Ростов-на-Дону, РГУ, 2004. - С. 26-27.
10. Лукомец В.М., Бочкарёв H.H., Зеленцов C.B., Мошненко Е.В. Создание сортов сои с расширенной адаптацией к изменяющемуся климату Западного Предкавказья // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. -Т. 1. - № 35. - С. 248-254.
11. Оценочный доклад об изменениях климата и их последствиях на территории Российской Федерации. T. I. Изменения климата / Под общ. ред. А.И. Бедрицкого, В.Г. Блинова, Д.А. Гершинковой [и др.]. - М.: Росгидромет, 2008. - 227 с.
12. Перрен Ж. Атомы // Современные проблемы естествознания. Книга 20 / Под ред. А.Д. Архангельского и др. - М.: Госиздат, 1921. - С. 123124, 134-138.
13. Саенко Г.М., Зеленцов C.B. Отбор толерантных к пепельной гнили генотипов сои на основе онтогенетической динамики осмотического давления клеточного сока // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2011. - Вып. 2 (148149). - С. 74-81.
14. Сергеев Г.Б., Батюк Б.А. Криохимия. - М.: Химия, 1978. — 296 с.
15. Степанова В.М. Климат и сорт. Соя. - Л.: Гидрометиздат, 1985. - С. 97-142.
16. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия. - М.: Высшая школа, 2001. - С. 192-199.
17. Температура начала кипения и кристаллизации (замерзания) растворов неэлектролитов [Электронный ресурс]. - URL: http://planet-calc.ru/352/ (дата обращения: 21.03.2019).
18. Хмельницкий P.A. Физическая и коллоидная химия. - М.: Высшая школа, 1988. - С. 174-177.
19. Эйнштейн А. К теории броуновского движения // В сб. : А. Эйнштейн. Собр. соч. - М. : Наука, 1966. - Т. 3. - С. 118-127.
20. Brown R. A brief account of microscopical observations made on the particles made in the months of June, July, and August, 1827, on the particles contained in the pollen of plants; and on the general existence of active molecules in organic and inorganic bodies // In: The miscellaneous botanical works of Robert Brown / Ed. by J.J. Bennett, 1866. - Vol. 1. -P. 466-483 [Репринтное издание] [Электронный ресурс]. - URL: https://en.wikisource.org/wiki/ The_miscellaneous_botanical_works_of_Robert_Bro wn/Volume_1/A_brief_account_of_microscopical_ob serva-
tions_made_on_the_particles_contained_in_the_polle n_of_plants (дата обращения: 20.03.2019).
21. Clegg J.S. Properties and Metabolism of the Aqueous Cytoplasm and its Boundaries // The American Journal of Physiology. - 1984. - Vol. 246. - No.
2 (Pt. 2). - P. 133-151.
22. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area // International review of Cytology. - 2000. - Vol. 192. - P. 189-221.
References
1. Berezina N.A., Afanas'yeva N.B. Ekologiya rasteniy. - M.: Izd. tsentr «Akademiya», 2009. - S. 181-187.
2. Biokhimicheskaya termodinamika / Pod red. M. Dzhounsa, per. M.G. Gol'fel'da - M.: Mir, 1982. - S. 204-205.
3. Bubnova L.A., Zelentsov S.V. Otbor zamorozkoustoychivykh genotipov soi na rannikh etapakh ontogeneza - Sovremennyye tendentsii v sel'skom khozyaystve // Sb. tr. I Mezhdunar. internet-konf. - Kazan': FGAOU VPO Kazanskiy (Privolzhskiy) Federal'nyy universitet, 15-17 oktyab-rya 2012 g. - S. 39-43.
4. Zelentsov S.V., Moshnenko E.V. Perspektivy ispol'zovaniya sverkhrannikh posevov soi v uslovi-yakh Krasnodarskogo kraya // Maslichnyye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2010. - Vyp. 1 (142143). - S. 87-94.
5. Zelentsov S.V., Moshnenko E.V., Ryabenko L.G., Zelentsov V.S., Budnikov E.N., Bubnova L.A., Vaylova A.V. Rol' tsitokolloidov v formirovanii morozo- i zamorozkoustoychivosti yarovykh kul'tur na primere soi i l'na // Problemy sovremennoy nauki i obrazovaniya. - 2015. - № 12 (42). - S. 102-107.
6. Zelentsov S.V., Moshnenko E.V., Tka^va A.A, Ramazanova S.A., Trunova M.V., Budnikov E.N., Bubnova L.A., Oleynik V.I. Vysokobelkovyy kholodoustoychivyy sort soi Irbis // Maslichnyye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2017. - Vyp.
3 (171). - S. 115-119.
7. Zelentsov S.V., Moshnenko E.V., Bubnova L.A., Zelentsov V.S. Nekotoryye aspekty ustoychi-vosti rasteniy k otritsatel'nym temperaturam na primere soi i maslichnogo l'na. // Maslichnyye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2018. - Vyp. 2 (174). - S. 55-70.
8. Koshkin E.I. Fiziologiya ustoychivosti sel'skokhozyaystvennykh kul'tur. - M.: Drofa, 2010. -S. 80-121; 123-148.
9. Levchenkov S.I. Fizicheskaya i kolloidnaya khimiya. CH. 4. Kolloidnaya khimiya. - Rostov-na-Donu, RGU, 2004. - S. 26-27.
10. Lukomets V.M., Bochkarev N.I., Zelentsov S.V., Moshnenko E.V. Sozdaniye sortov soi s rasshirennoy adaptatsiyey k izmenyayushchemusya klimatu Zapadnogo Predkavkaz'ya // Trudy Kuban-skogo gosudarstvennogo agrarnogo univer-siteta. -2012. - T. 1. - № 35. - S. 248-254.
11. Otsenochnyy doklad ob izmeneniyakh klimata i ikh posledstviyakh na territorii Rossiyskoy Federat-sii. T. I. Izmeneniya klimata / Pod obshch. red. A.I. Bedritskogo, V.G. Blinova, D.A. Gershinkovoy [i dr.]. - M.: Rosgidromet, 2008. - 227 s.
12. Perren ZH. Atomy / Sovremennyye problemy estestvoznaniya. Kniga 20 / Pod red. A.D. Ark-hangel'skogo i dr. - M.: Gosizdat, 1921. - S. 123124, 134-138.
13. Sayenko G.M., Zelentsov S.V. Otbor tolerant-nykh k pepel'noy gnili genotipov soi na osnove onto-geneticheskoy dinamiki osmoticheskogo davleniya kletochnogo soka // Maslichnyye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2011. - Vyp. 2 (148-149). -S. 74-81.
14. Sergeyev G.B., Batyuk B.A. Kriokhimiya. -M.: KHimiya, 1978. - 296 s.
15. Stepanova V.M. Klimat i sort. Soya. - L.: Gidrometizdat, 1985. - S. 97-142.
16. Stromberg A.G., Semchenko D.P. Fizicheskaya khimiya. - M.: Vysshaya shkola, 2001. - S. 192-199.
17. Temperatura nachala kipeniya i kristallizatsii (zamerzaniya) rastvorov neelektrolitov. - [Elektron-nyy resurs]. - URL: http://planet-calc.ru/352/ (data obrashcheniya: 21.03.2019).
18. KHmel'nitskiy R.A. Fizicheskaya i kolloidnaya khimiya. - M.: Vysshaya shkola, 1988. - S. 174-177.
19. Eynshteyn A. K teorii brounovskogo dviz-heniya / V sb.: A. Eynshteyn. Sobr. soch. - M.: Nauka, 1966. - T. 3. - S. 118-127.
20. Brown R. A brief account of microscopical observations made on the particles made in the months of June, July, and August, 1827, on the particles contained in the pollen of plants; and on the general existence of active molecules in organic and inorganic bodies. / In: The miscellaneous botanical works of Robert Brown/ Ed. by J.J. Bennett, 1866. - Vol. 1. -P. 466-483. [Репринтное издание] - [Электронный ресурс]. - URL: https://en.wikisource.org/wiki/ The_miscellaneous_botanical_works_of_Robert_Bro wn/Volume_1/A_brief_account_of_microscopical_ob serva-
tions_made_on_the_particles_contained_in_the_polle n_of_plants (дата обращения: 20.03.2019).
21. Clegg J.S. Properties and Metabolism of the Aqueous Cytoplasm and its Boundaries // The American Journal of Physiology, 1984. - Vol. 246. - No. 2 (Pt. 2). - P. 133-151.
22. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area // International review of Cytology, 2000. - Vol. 192. - P. 189-221.
Получено: 28.03.2019 Принято: 30,04.2019 Received: 28.03.2019 Accepted: 30,04.2019
