CC BY-ND
6
/о
Оригинальная исследовательская статья
Н Check for updates
© Коллектив авторов, 2022
УДК 616.91/93
Обнаружение вируса Западного Нила в зимующих комарах на территории Волгоградской области
H.B. Бородай, A.B. Heсговорова, B.K. Фомина, A.K. Meндыгaлиeßa, A.A. Батурин, A.C. Aнmоноß, E.Ф. Aßдюшeßa, E.B. Молчанова, ДМ. Hикиmин, E.B. Путинщва
ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, ул. Голубинская, д. 7, г. Волгоград, 400131, Российская Федерация
Резюме
Bвeдeниe. Лихорадка Западного Нила - зоонозная трансмиссивная вирусная инфекция, вызываемая вирусом Западного Нила. Данные о возможности сохранения вируса Западного Нила в межэпизоотический период в регионах с умеренным климатом у зимующих комаров имеют большое значение для понимания механизмов циркуляции патогена. Цeлью иccлeдовaния является оценка возможности сохранения вируса Западного Нила в комарах в межэпизоотический период в Волгоградской области.
Mameриaлы и мгтоды. Объектами исследования являлись зимующие комары, сбор которых проводился в Волгоградской области в 2013-2021 гг. с помощью аккумуляторного аспиратора и ловушки Кришталя. Выявление РНК вируса Западного Нила проводили методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. Из образца o16/19 (Cx. pipiens, сбор от 02.04.2019 г.), в котором была обнаружена РНК вируса Западного Нила, с использованием культуры клеток VERO был получен изолят (WNV Volgograd^tó/W). После этого из отфильтрованного клеточного супернатанта полученного изолята была выделена тотальная РНК. Метагеномное секвенирование образца проводили на высокопроизводительном секвенаторе Illumina MiSEQ.
Рeзульmamы. В зимовочных убежищах было собрано 4070 комаров. На наличие РНК вируса Западного Нила исследовано 157 пулов комаров. РНК вируса Западного Нила выявлена в 2 пулах комаров вида Culex pipiens и в 1 пуле комплекса Anopheles maculipennis. Филогенетический анализ показал, что изолят WNV Volgograd^^/W, выделенный из пула зимующих комаров, принадлежал ко второму генотипу вируса Западного Нила. Установлена его принадлежность к монофилетической кладе изолятов вируса Западного Нила, выделенных на территории Волгоградской, Астраханской и Ростовской областей в 2007, 2018-2020 годах.
Зaключeниe. В Волгоградской области впервые вирус Западного Нила обнаружен у зимующих комаров. Результаты этих исследований подтверждают гипотезу о персистенции вируса Западного Нила второго генотипа в комарах в течение межэпизоотического периода и возможности передачи вируса Западного Нила от комара к птице в весенний период как один из механизмов формирования местных очагов на эндемичных по лихорадке Западного Нила территориях Российской Федерации без ежегодного заноса вируса.
Ключевые слова: лихорадка Западного Нила, вирус Западного Нила, межэпизоотический период, Culex pipiens, комплекс Anopheles maculipennis, зимующие комары.
Для цитирования: Бородай Н.В., Несговорова А.В., Фомина В.К., Мендыгалиева А.К., Батурин А.А., Антонов А.С., Ав-дюшева Е.Ф., Молчанова Е.В., Никитин Д.Н., Путинцева Е.В. Обнаружение вируса Западного Нила в зимующих комарах на территории Волгоградской области // Здоровье населения и среда обитания. 2022. Т. 30. № 4. С. 70-76. doi: https://doi. org/10.35627/2219-5238/2022-30-4-70-76 Сведения об авторах:
И Бородай Наталья Владимировна - старший научный сотрудник сектора эпизоотологического мониторинга; е-mail: borodai. nat@yandex.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2076-5276.
Несговорова Анна Владимировна - научный сотрудник сектора эпизоотологического мониторинга; е-mail: vari2@sprint-v.com. ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5810-8864.
Фомина Валерия Константиновна - научный сотрудник сектора эпизоотологического мониторинга; е-mail: vari2@sprint-v.com. ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6081-4052.
Мендыгалиева Айна Кеннжевоевна - научный сотрудник сектора эпизоотологического мониторинга; е-mail: vari2@sprint-v.com. ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3862-9133.
Батурин Артем Александрович - научный сотрудник лаборатории генодиагностики; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9510-7246.
Антонов Александр Сергеевич - научный сотрудник лаборатории биоинформационного анализа; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9342-7211.
Авдюшева Елена Федоровна - научный сотрудник лаборатории биоинформационного анализа; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5440-1470.
Молчанова Елена Владимировна - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории арбовирусных инфекций; е-mail: vari2@ sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3722-8159.
Никитин Дмитрий Николаевич - научный сотрудник лаборатории эпидемиологического анализа и противоэпидемического обеспечения; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6940-0350.
Путинцева Елена Викторовна - к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологического анализа и противоэпидемического обеспечения; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9368-6165.
Информация о вкладе авторов: концепция и дизайн исследования: Бородай H.B., H^mmm Д.Н; сбор данных: He^ворова A.B., Фомина B.K., Мтдыгалигва A.K., Батурин A.A., Aнmоноß A.C., Aßдюшeßa E.Ф., Молчанова E.B.; анализ и интерпретация результатов: Бородай H.B., Heaоворова A.B., Фомина B.K., Мендыгалиева A.K., Молчанова E.B., Путинщва E.B.; обзор литературы: Бородай H.B.; подготовка рукописи: Бородай H.B., H^mmm Д.H. Все авторы ознакомились с результатами работы и одобрили окончательный вариант рукописи. Соблюдение этических стандартов: дизайн исследования одобрен Комиссией по биоэтике ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Протокол № 2 от 15.06.2020). Финансирование: исследование проведено без спонсорской поддержки.
Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.
Огатъя получена: 07.10.21 / Принята к публикации: 04.04.22 / Опубликована: 29.04.22
Detection of West Nile Virus in Overwintering Mosquitoes in the Volgograd Region
Natalia V. Borodai, Anna V. Nesgovorova, Valeria K. Fomina, Aina K. Mendygalieva, Artem A. Baturin, Aleksandr S. Antonov, Elena F. Avdiusheva, Elena V. Molchanova,
Dmitrii N. Nikitin, Elena V. Putintseva Volgograd Plague Control Research Institute, 7 Golubinskaya Street, Volgograd, 400131, Russian Federation
том 30 №4 2022
Original Research Article Summary
Introduction: West Nile fever is a zoonotic, vector-borne viral infection caused by West Nile virus. The possibility of persistence of West Nile virus in overwintering mosquitoes in regions with a temperate climate is of great importance for understanding the mechanisms of pathogen circulation.
Objective: To detect West Nile virus in mosquitoes during the inter-epizootic period in the Volgograd Region. Materials and methods: In 2013-2021, we collected overwintering mosquitoes in different locations of the Volgograd Region using a battery-powered aspirator with a Krishtal's trap to detect West Nile virus RNA in them using a real-time reverse transcription polymerase chain reaction. An isolate (WNV Volgograd_o16/19) was obtained from sample o16/19 (Cx. pip-iens, collected on April 2, 2019) with detected West Nile virus RNA using a VERO cell culture. After that, total RNA was isolated from the filtered cell supernatant of that isolate. Metagenomic sequencing of the sample was performed using a high-throughput Illumina MiSeq sequencer, Illumina Inc.
Results: In total, we collected 4,070 mosquitoes in wintering shelters and tested 157 pools of the insects for West Nile virus RNA. The latter was detected in two pools of Culex pipiens and in one pool of Anopheles maculipennis complex. The phyloge-netic analysis showed that the WNV Volgograd_o16/19 strain isolated from the pool of wintering mosquitoes belonged to lineage 2 of West Nile virus. We also established its belonging to the monophyletic clade of West Nile virus strains isolated in the Volgograd, Astrakhan, and Rostov regions in the years 2007 and 2018-2020.
Conclusions: We were first to detect West Nile virus in overwintering mosquitoes in the Volgograd Region. Our findings confirm the hypothesis that lineage 2 strains of encephalitic West Nile virus persist in mosquitoes during the inter-epizootic period and can be transmitted from mosquito to bird in springtime as one of the mechanisms of forming autochthonous foci in WNV endemic areas of the Russian Federation in the absence of the annual import of this infection. Keywords: West Nile fever, West Nile virus, inter-epizootic period, Culex pipiens, Anopheles maculipennis complex, overwintering mosquitoes.
For citation: Borodai NV, Nesgovorova AV, Fomina VK, Mendygalieva AK, Baturin AA, Antonov AS, Avdiusheva EF, Molchanova EV, Nikitin DN, Putintseva EV. Detection of West Nile virus in overwintering mosquitoes in the Volgograd Region. Zdorov'e Naseleniya i Sreda Obitaniya. 2022;30(4):70-76. (In Russ.) doi: https://doi.org/10.35627/2219-5238/2022-30-4-70-76 Author information:
H Natalia V. Borodai, Senior Researcher, Epizootiological Monitoring Sector, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: borodai.nat@yandex.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2076-5276.
Anna V. Nesgovorova, Researcher, Epizootiological Monitoring Sector, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@ sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5810-8864.
Valeria K. Fomina, Researcher, Epizootiological Monitoring Sector, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@sprint-v. com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6081-4052.
Aina K. Mendygalieva, Researcher, Epizootiological Monitoring Sector, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@ sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-3862-9133.
Artem A. Baturin, Researcher, Genetic Testing Laboratory, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9510-7246.
Aleksandr S. Antonov, Researcher, Laboratory of Bioinformatics Analysis, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@ sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9342-7211.
Elena F. Avdiusheva, Researcher, Laboratory of Bioinformatics Analysis, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@ sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5440-1470.
Elena V. Molchanova, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Laboratory of Arbovirus Infections, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3722-8159.
Dmitrii N. Nikitin, Researcher, Laboratory of Epidemiological Analysis and Anti-Epidemic Support, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6940-0350.
Elena V. Putintseva, Cand. Sci. (Med.), Leading Researcher, Laboratory of Epidemiological Analysis and Anti-Epidemic Support, Volgograd Plague Control Research Institute; e-mail: vari2@sprint-v.com.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9368-6165. Author contributions: study conception and design: Borodai N.V., Nikitin D.N.; data collection: Nesgovorova A.V., Fomina V.K., MendygalievaA.K., Baturin A.A., Antonov A.S., Avdiusheva E.F., Molchanova E.V.; analysis and interpretation of results: Borodai N.V., Nesgovorova A.V., Fomina V.K., Mendygalieva A.K., Molchanova E.V., Putintseva E.V.; literature review: Borodai N.V.; draft manuscript preparation: Borodai N.V., Nikitin D.N. All authors reviewed the results and approved the final version of the manuscript. Compliance with ethical standards: The study protocol was approved by the Bioethics Committee of Volgograd Plague Control Research Institute, Minutes No. 2 of June 15, 2020.
Funding: The authors received no financial support for the research, authorship, and/or publication of this article. Conflict of interest: The authors declare that there is no conflict of interest.
Received: October 7, 2021 / Accepted: April 4, 2022 / Published: April 29, 2022
Введение. Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) — зоонозная трансмиссивная вирусная инфекция, вызываемая вирусом Западного Нила (ВЗН). В природе ВЗН поддерживается в энзоотичном цикле между птицами и кровососущими комарами (01р1ега, СиИс1ёае). Случайными (тупиковыми) хозяевами могут быть люди, лошади и другие млекопитающие. У человека ЛЗН протекает в виде острого лихорадочного заболевания с симптомами общей интоксикации, умеренного полиаденита, головными и мышечными болями, в ряде случаев с развитием серозного менингита и менингоэнце-фалита [1]. На эндемичных по ЛЗН территориях с тропическим и субтропическим климатом циркуляция ВЗН может происходить круглогодично. В регионах с умеренным климатом передача вируса горизонтально позвоночным хозяевам происходит только летом и осенью. В настоящее время ВЗН — наиболее распространенный в Северной Америке и Европе патоген, переносчиками которого являются комары. По данным Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихо-
радки Западного Нила в Российской Федерации, за период 1997—2020 гг. зарегистрировано 2964 случая заболевания лихорадкой Западного Нила в 35 субъектах. Механизмы поддержания ВЗН в межэпизоотический период и распространения инфекции весной на эндемичных территориях мало изучены. Особый интерес для исследователей представляют комары, которые переживают зимний период в состоянии диапаузы в различных убежищах. ВЗН в местных популяциях диапаузи-рующих Culex pipiens f. pipiens обнаружен в США в Нью-Йорке, Нью-Джерси и Пенсильвании [2—5]. Результаты исследований в долине Сакраменто в Калифорнии показали, что инфицированные самки рода Culex могут выживать в течение зимы и, возможно, передавать ВЗН по завершении диапаузы в конце зимы или ранней весной как вертикально, так и горизонтально [6]. В Европе РНК ВЗН у зимующих комаров Cx. pipiens обнаружена в Чехии, в регионе Южная Моравия [7]. На территории Российской Федерации подобных исследований не проводилось. Данные
voLume зо, issue 4, 2022
/2
о возможности сохранения ВЗН у зимующих комаров в межэпизоотический период имеют большое значение для понимания циркуляции патогена на эндемичных территориях.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является оценка возможности сохранения вируса Западного Нила в комарах в межэпизоотический период в Волгоградской области. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: проведение скрининга на наличие РНК ВЗН и определение уровня инфицированности зимующих комаров, проведение углубленных молекулярно-генетических исследований генома возбудителя ЛЗН.
Материалы и методы. Сбор комаров проводился в г. Волгограде, Среднеахтубинском и Руднянском районах Волгоградской области в 2013—2021 гг. после осенних заморозков и в феврале — начале апреля (таблица). Диапаузирующих самок комаров собирали со стен и потолков погребов, овощехранилища, омшаника, колодцев с помощью аккумуляторного аспиратора (BioQuip Products) и стеклянной ловушки Кришталя (ООО «Химпром»). Пойманных комаров транспортировали в термоконтейнерах («Термо-Конт МК») с хладоэлементами в лабораторию, обездвиживали в морозильной камере при температуре —20 °С в течение 5—7 минут и определяли до вида по руководству А.В. Гуцевича [8] с помощью стереомикроскопа (Stemi 2000C, Carl Zeiss). Комаров одного вида фасовали на холоде от 2 до 30 особей в микроцентрифужные пробирки (Eppendorf,), которые хранили в морозильной камере при —80 °С. Затем готовили суспензии пулов комаров в физиологическом растворе и проводили выявление РНК вируса Западного Нила методом ОТ-ПЦР с использованием набора реагентов «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Установление генотипа ВЗН в положительных пробах проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием 3 пар праймеров и 3 зондов (патенты РФ: № 2715625 от 02.03.2020; № 2715617 от 02.03.2020; № 2737396 от 30.11.2020). Комаров вида Cx. pipiens не подвергали анализу с целью выявления различий между внутривидовыми формами: f. pipiens и f. molestus.
Выделение вируса из проб пулов комаров, в которых была обнаружена РНК ВЗН, проводили с использованием культуры клеток Vero. Для этого клетки выращивали в среде DMEM (БиолоТ) с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma Aldrich, USA), 1 % L-глутамина (Gibco) и 1 % антибиотика/антимикотика (Sigma Aldrich) при 37 °С, 5,5 % СО2 и 70 % влажности. В качестве поддерживающей среды использовалась та же среда с добавлением 2 % эмбриональной бычьей сыворотки. Подготовленный монослой клеточной культуры Vero заражали пробами надо-садочной жидкости суспензии комаров согласно классическому протоколу [9].
Для получения углубленной молекулярно-ге-нетической характеристики геноварианта ВЗН, выявленного в зимующих комарах, из отфильтрованного клеточного супернатанта полученного вирусного изолята была выделена тотальная РНК, с которой и проводилась последующая работа по секвенированию. Метагеномное секвенирование образца проводили согласно методике Moser
Оригинальная исследовательская статья
et al., 2016 [10], с авторскими изменениями на высокопроизводительном секвенаторе Illumina i— MiSEQ (Illumina Inc.). Анализ полученных данных осуществляли с помощью программных продуктов Cutadapt 2.9 [11], Samtools 1.9, Bcftools 1.9, bwa :3E 0.7.17-r1188 [12] и SPAdes v3.11.1 [13], объеди- ^ ненных в конвейеры при помощи собственных скриптов, реализованных на языке Python 3. Для построения множественных выравниваний последовательностей геномов использовали MAFFT v7.271 [14]. Филогенетический анализ осуществляли с помощью программного пакета Mega X [15], для визуализации результатов использовали web-сервис iTOL [16].
Результаты. За период с 2013 по 2021 г. в Волгоградской области в зимовочных убежищах было собрано 4070 комаров: 3602 — Cx. pipiens, 46S — комплекса An. maculipennis. Места сборов, количество особей и результаты исследований на наличие РНК ВЗН зимующих комаров, собранных в Волгоградской области с 2013 по 2021 г., представлены в таблице. На наличие РНК ВЗН исследовано 136 пулов комаров вида Cx. pipiens и 21 пул — комплекса An. maculipennis. С 2013 по 201S г. и в 2021 г. положительных на наличие РНК ВЗН пулов обнаружено не было. РНК ВЗН выявлена: в 1 пуле комаров вида Cx. pipiens и в 1 пуле комплекса An. maculipennis, собранных 02.04.2019 в погребе дачи СНТ «Колос», и 1 пуле комаров Cx. pipiens, собранных 26.02.2020 в погребе усадьбы на хуторе Сахарный. Оба зимовочных убежища расположены на территории Волго-Ахтубинской поймы в Среднеахтубинском районе области.
В результате вирусологического исследования трех проб пулов комаров, в которых была обнаружена РНК ВЗН, удалось получить вирусный изолят из одной (WNV Volgograd_o16/19).
Филогенетический анализ показал, что полученный изолят ВЗН, выделенный из пула зимующих комаров (Cx. pipiens, 02.04.2019), принадлежал ко второму генотипу вируса Западного Нила. Установлена его принадлежность к монофиле-тической кладе геновариантов ВЗН, выделенных на территории Волгоградской, Астраханской и Ростовской областей в 2007, 2018—2020 гг. (рис. 1).
Обсуждение. При исследовании инфицирован-ности возбудителем ЛЗН позвоночных животных и членистоногих в 2013—2021 гг. на территории Волгоградской области РНК ВЗН выявлена в 13 из 914 проб органов диких птиц (1,42 %), в 1 из 1229 проб органов мелких млекопитающих (0,08 %), в 146 из 6820 проб кровососущих комаров (2,14 %) и 7 из 1996 проб иксодовых клещей (0,35 %). При исследовании сывороток крови домашних птиц и лошадей методом ИФА антитела к ВЗН обнаружены в 25 из 49 (51 %) и в 181 из 300 (60 %) исследованных проб соответственно. Эпизоотии ЛЗН среди птиц — основных резервуаров и лошадей — тупиковых хозяев в этот период не зарегистрировано. Основными резервуарами являются врановые и лимнофильные птицы, эффективными переносчиками — комары видов Culex pipiens и Culex modestus. Вероятно, при высокой дозе заражения второстепенными переносчиками могут являться комары видов Aedes vexans, Aedes caspius, Aedes dorsalis, массовый выплод которых происходит в пойменных водоемах в конце мая — июне.
Комары родов Anopheles и Culex зимуют на стадии имаго, и численность диапаузирующих
том 30 №4 2022
73
Original Research Article
Таблица. Места сборов, количество особей и результаты исследований на наличие РНК ВЗН зимующих комаров,
собранных в Волгоградской области с 2013 по 2021 г.
Table. Collection sites and the number of overwintering mosquitoes collected and tested for West Nile virus (WNV) RNA
in the Volgograd Region in 2013-2021
Дата сбора / Collection date (dd.mm.yyyy) Место сбора / Collection site Координаты места cбора / Collection site coordinates Зимовочное убежище / Overwintering shelter Вид / Species Количество особей / Number of mosquitoes Пулов / Pools Положительные / Detected WNV positive
N E
09.03.2013 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.607387 44.536846 погреб / cellar к. An. maculipennis 20 2 0
Cx. pipiens 18 3 0
10.03.2013 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 41 3 0
погреб / cellar к. An. maculipennis 2 1 0
20.10.2013 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 140 6 0
17.03.2014 Питомник НИПЧИ / VPCRI nursery 48.715131 44.784519 овощехранилище / vegetable warehouse Cx. pipiens 2 1 0
29.03.2014 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 67 6 0
27.10.2014 с. Осички / Osichki Village 50.951625 44.499790 омшаник / bee wintering shed к. An. maculipennis 253 10 0
колодец / well Cx. pipiens 12 1 0
04.04.2015 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 80 4 0
04.04.2015 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.607387 44.536846 погреб / cellar Cx. pipiens 38 2 0
09.11.2016 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 484 16 0
20.10.2017 Питомник НИПЧИ / VPCRI nursery 48.715131 44.784519 овощехранилище / vegetable warehouse Cx. pipiens 100 4 0
к. An. maculipennis 6 1 0
23.10.2018 Питомник НИПЧИ / VPCRI nursery 48.715131 44.784519 овощехранилище / vegetable warehouse Cx. pipiens 270 9 0
к. An. maculipennis 80 3 0
08.11.2018 п. Майский / Maysky Village 48.551588 44.18612 колодец / well Cx. pipiens 7 1 0
26.03.2019 п. Сакко и Ванцетти / Sacco and Vanzetti Village 48.509927 44.504493 погреб / cellar Cx. pipiens 10 1 0
28.03.2019 п. Колхозная Ахтуба / Kolkhoznaya Akhtuba Village 48.714760 44.811811 погреб / cellar Cx. pipiens 6 1 0
02.04.2019 п. Горьковский / Gorkovsky Village 48.689452 44.328706 погреб / cellar Cx. pipiens 5 1 0
02.04.2019 Дачи Бакалда / Bakalda cottages 48.648770 44.552548 погреб / cellar Cx. pipiens 370 13 1
погреб / cellar к. An. maculipennis 5 1 1
48.651515 44.550491 колодец / well Cx. pipiens 71 3 0
06.04.2019 о. Сарпинский / Sarpinsky Island 48.613909 44.526659 погреб / cellar Cx. pipiens 582 20 0
11.11.2019 Питомник НИПЧИ / VPCRI nursery 48.715131 44.784519 овощехранилище / vegetable warehouse Cx. pipiens 330 11 0
к. An. maculipennis 30 1 0
11.11.2019 х. Сахарный / Sakharny Village 48.683818 44.625473 погреб / cellar Cx. pipiens 480 13 0
к. An. maculipennis 72 2 0
26.02.2020 х. Сахарный / Sakharny Village 48.683818 44.625473 погреб / cellar Cx. pipiens 180 6 1
12.04.2020 Дачи Бакалда / Bakalda cottages 48.648770 44.552548 погреб / cellar Cx. pipiens 150 5 0
18.03.2021 х. Сахарный / Sakharny Village 48.683818 44.625473 погреб / cellar Cx. pipiens 5 1 0
22.03.2021 Дачи Бакалда / Bakalda cottages 48.648770 44.552548 погреб / cellar Cx. pipiens 154 5 0
ИТОГО/TOTAL 4070 157 3
Abbreviation: VPCRI, Volgograd Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor), Volgograd, Russian Federation.
voLume 30, issue 4, 2022
74
самок к весне уменьшается более чем на 95 %. Рост популяций комаров этих родов в течение лета происходит постепенно, численность достигает максимума в конце июля — августе, т. е. в сезон передачи ВЗН. Комары рода Anopheles предпочитают питаться на млекопитающих, что ограничивает их роль в передаче ВЗН. Напротив, виды рода Culex, в частности Culex pipiens L. и Culex modestus Fic., распространенные в очагах ЛЗН на юге России, питаются как на птицах, так и на млекопитающих. Кроме того, комары Cx. pipiens и Cx. modestus более восприимчивы к ВЗН и способны к более эффективной передаче вируса, чем комары Aedes vexans, Aedes caspius, Aedes dorsalis. Приведенные данные позволяют считать именно комаров рода Culex основными переносчиками ВЗН на территории России [17]. В Волгоградской области имаго комаров комплекса An. maculipennis, неавтогенной формы Cx. pipiens (f. pipiens) и Cx. modestus зимуют в состоянии диа-паузы в естественных и искусственных убежищах (рис. 2). В урбанизированных биотопах это могут быть погреба, колодцы, омшаники, в природных — пещеры, норы животных, различные укрытия в прикорневой части деревьев, тростника и т. п.
Поскольку большинство самок, которые входят в состояние диапаузы, не питаются кровью, их инфицирование ВЗН должно происходить посредством вертикальной передачи вируса.
Оригинальная исследовательская статья
Неопровержимым доказательством того, что вертикально инфицированные осенью самки Сх. pipiens f. pipiens, пережившие зиму в состоянии диапаузы, способны следующей весной инициировать заражение, являются результаты исследований, проведенные в 2006 г. Anderson J.F. и Main A.J. [18]. Они описали горизонтальную передачу ВЗН инфицированной по вертикали самкой, находившейся в диапаузе более 5 месяцев, и пришли к выводу, что в умеренном климате передача ВЗН у Сх. pipiens f. pipiens от поколения к поколению является важным средством, позволяющим вирусу сохраняться в зимний период и в последующем вызывать эпизоотии в весенне-летний период. Вероятно редко может также осуществляться и альтернативный механизм, при котором самки перед наступлением диапаузы питаются инфицированной кровью, переживают зиму и передают ВЗН весной [19].
При исследовании 157 пулов комаров, собранных в зимовочных убежищах Волгоградской области в период с 2013 по 2021 г., в 3 пулах обнаружена РНК ВЗН. Общий уровень инфици-рованности зимующих в Волгоградской области комаров составил 1,9 %. Аналогичный показатель при исследованиях в Нью-Йорке составил 0,1 % [2], в Южной Моравии — 0,5 % [7]. Выявление РНК ВЗН и получение вирусного изолята (WNV Volgograd^^/^) из зимующих комаров может
s-b
Tree scale: 0.1
NC 001563 2 West Nile vims lineage 2 complete genome M12294 2 West Nile virus RNA complete genome AY532665 1 West Nile virus strain B956 polyprotem gene complete genome JX041631 1 West Nile virus strain LEIV-3266Ukr complete genome DQ318019 1 West Nile virus strain ArD76104 complete genome KT207791 1 West Nile virus isolate 792/14 complete genome
KJ934710 1 West Nile virus strain Hyalomma/Romanla/2013 polyprotein precursor gene complete cds FJ425721 West Nile virus isolate Reb VLG 07 West Nile virus o16/19
West Nile virus isolate Volgograd723/18 polyprotein gene consensus genome complete cds - West Nile virus isolate Volgograd696 18 polyprotein gene consensus genome complete cds West Nile virus isolate Volgograd623/16 complete cds West Nile virus isolate Volgograd592/18 complete cds
West Nile virus isolate Volgograd829/18 polyprotein gene consensus genome complete cds
West Nile virus isolate Volgograd625/18 partitial cds
West Nile virus isolate Volgograd627/18 complete cds
West Nile virus isolate Volgograd594/18 complete cds
West Nile virus isolate Volgograd652/18 complete cds
West Nile virus isolate Volgograd601/18 polyprotein gene consensus genome complete cds
LC318700 1 West Nile virus genomic RNA complete genome strain Zmql6m11
JN393308 1 West Nile virus strain HS101 08 complete genome
KY523178 1 West Nile virus isolate LIG2274/Uganda/2009 complete genome
EF429198 1 West Nile virus SA93/01 complete genome
EU0686671 West Nile virus isolate SPU116-89 polyprotein gene complete cds
EF429197 1 West Nile virus SPU116/89 complete genome
KP780840 1 West Nile virus isolate Tammy complete genome
KF179639 1 West Nile virus strain Greece/2012/Kavala/39 1 complete genome
KJ883343 1 West Nile vims strain Greece/2013/Xanthi 1 complete genome
KJ883349 1 West Nile virus strain Greece/2013/Xantrti 5 complete genome
KJ883345 1 West Nile virus strain Greece/2013/Xanthi 3 complete genome
KJ883348 1 West Nile virus strain Greece/2013/Kavala 2 complete genome
KJ883344 1 West Nile virus strain Greece/2013/Xantm 2 complete genome
MH021189 1 West Nile virus isolate WNV/Belgium/2017/Antwerpen complete genome
KC496015 1 West Nile virus strain 578/10 complete genome
KU206781 1 West Nile virus strain Bulgaria/2015/Sofra complete genome
KT757319 1 West Nile virus isolate Vojvodina 2013 02 polyprotein gene complete cds
KT757318 1 West Nile virus isolate Vojvodina 2013 01 polyprotein gene complete cds
KY594040 1 West Nile virus isolate 341/2010 complete genome
HQ537483 1 West Nile virus isolate Nea Santa-Greece-2010 complete genome
KJ577739 1 West Nile virus strain Greece/2013/C147 polyprotein gene complete cds
KJ883346 1 West Nile vims strain Greece/2013/Thessaloniki 4 complete genome
Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основе выравненных последовательностей геномов ВЗН, кодирующих вирусный полипротеин методом присоединения соседей с бутстрепом = 1000 Fig. 1. A dendrogram built on the basis of aligned West Nile virus genomes' sequences encoding a viral polyprotein by adding
neighbors method with bootstrap = 1,000
ТОМ 30 №4 2022
75
Original Research Article
Рис. 2. Диапаузирующие самки Cx. pipiens в погребе усадьбы на хуторе Сахарный, Среднеахтубинский район Волгоградской области, 2020 г. Fig. 2. Diapausing Culex pipiens females in the cellar of a homestead in the Sakharny village, Sredneakhtubinsky district of the Volgograd Region, 2020
указывать на возможность длительного сохранения вируса в комарах в межэпизоотический период на эндемичных по ЛЗН территориях Российской Федерации. Типирование ВЗН методом ОТ-ПЦР позволило установить наличие второго генотипа в одном из трех положительных пулов зимующих комаров.
Наши исследования подтверждают предположение о том, что циркуляция ВЗН второго генотипа на эндемичных территориях юга европейской части России поддерживается за счет местной популяции вируса, существующей уже довольно продолжительное время. Так, специалистами Референс-центра по мониторингу за возбудителем ЛЗН получены последовательности геномов 11 изолятов ВЗН из образцов полевого и клинического материала в 2019 г. (4 — все из Волгоградской области) и полевого материала в 2020 г. (2 — Астраханская область, 4 — Волгоградская область, 1 — Ростовская область). Филогенетический анализ показал, что все секвенированные изоляты принадлежат ко второму генотипу ВЗН и формируют отдельную кластерную группу, генетически разобщенную со штаммами вируса, выявленными в аналогичный период времени на территориях стран Центральной Европы, Балканского и Средиземноморского регионов. Топология филогенетического дерева указывает на наличие ближайшего единого общего предка у выделенных изолятов ВЗН второго генотипа, существовавшего не позднее 2007 г. Это подтверждают и данные сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей, показавшие у всех изолятов 2018—2020 гг. сходный специ-
фический характер аминокислотных замен, затронувших в основном неструктурные гены. Предположение, что вирусная популяция периодически привносится на данные территории, в настоящее время не находит подтверждения, хотя и не может быть полностью исключено ввиду малого числа исследованных изолятов [20].
Заключение. В Волгоградской области впервые ВЗН обнаружен у зимующих комаров. Результаты этих исследований подтверждают гипотезу о персистенции ВЗН второго генотипа у комаров в течение межэпизоотического периода и возможности передачи ВЗН от комара к птице в весенний период как одного из механизмов формирования местных очагов без ежегодного заноса вируса на эндемичных по ЛЗН территориях Российской Федерации. Однако необходимы дальнейшие исследования резервуаров и переносчиков для углубленного анализа циркуляции ВЗН в Российской Федерации.
Список литературы
1. Викторов Д.В., Смелянский В.П., Липницкий А.В. и др. Лихорадка Западного Нила. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт». Волгоград: Волга-Пресс, 2017. 304 с.
2. Nasci RS, Savage HM, White DJ, et al. West Nile virus in overwintering Culex mosquitoes, New York City, 2000. Emerg Infect Dis. 2001;7(4):742-744. doi: 10.3201/eid0704.010426
volume 30, issue 4, 2022
76
3. Andreadis TG, Armstrong PM, Bajwa WI. Studies on hibernating populations of Culex pipiens from a West Nile virus endemic focus in New York City: parity rates 1. and isolation of West Nile virus. J Am Mosq Control Assoc. 2010;26(3):257-264. doi: 10.2987/10-6004.1 2.
4. Farajollahi A, Crans WJ, Bryant P, et al. Detection of West Nile viral RNA from an overwintering pool of Culex pipiens pipiens (Diptera: Culicidae) in New Jersey, 2003. J Med Entomol. 2005;42(3):490-494. doi: 3. 10.1093/jmedent/42.3.490
5. Bugbee LM, Forte LR. The discovery of West Nile virus in overwintering Culex pipiens (Diptera: Culicidae) mosquitoes in Lehigh County, Pennsylvania. J Am Mosq Control Assoc. 2004;20(3):326-327. 4.
6. Nelms BM, Macedo PA, Kothera L, Savage HM, Reisen WK. Overwintering biology of Culex (Diptera: Culicidae) mosquitoes in the Sacramento Valley of California. J Med Entomol. 2013;50(4):773-790. doi: 10.1603/me12280 5.
7. Rudolf I, Betásová L, Blazejová H, et al. West Nile virus in overwintering mosquitoes, central Europe. Parasit Vectors. 2017;10(1):452. doi: 10.1186/s13071-017-2399-7 6.
8. Гуцевич А.В., Мончадский А.С., Штакельберг А.А. Комары Culicidae. В серии: Фауна СССР. Насекомые двукрылые. Изд. Наука Ленингр. отд. 1970. Т. III. вып. 4. 384 c. 7.
9. Colpitts TM, ed. West Nile Virus: Methods and Protocols. New York, NY: Humana Press; 2016. doi: 10.1007/9781-4939-3670-0 8.
10. Moser LA, Ramirez-Carvajal L, Puri V, et al. A universal next-generation sequencing protocol to generate noninfectious barcoded cDNA libraries from high-con- 9. tainment RNA viruses. mSystems. 2016;1(3):e00039-15.
doi: 10.1128/mSystems.00039-15
11. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from 10. high-throughput sequencing reads. EMBnet. journal. 2011;17(1):10-12. doi: 10.14806/ej.17.1.200
12. Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 11. 2009;25(16):2078-2079. doi: 10.1093/bioinformatics/ btp352
13. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, et al. SPAdes: a 12. new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012;19(5):455-
477. doi: 10.1089/cmb.2012.0021
14. Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence 13. alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013;30(4):772-780.
doi: 10.1093/molbev/mst010
15. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. 14. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 2018;35(6):1547-1549. doi: 10.1093/molbev/msy096
16. Letunic I, Bork P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: 15. recent updates and new developments. Nucleic Acids
Res. 2019;47(W1):W256-W259. doi: 10.1093/nar/gkz239
17. Федорова М.В., Бородай Н.В. О необходимости
и путях совершенствования энтомологического 16. мониторинга при эпидемиологическом надзоре за лихорадкой Западного Нила // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2017. № 2. 17. С. 37-42. EDN YSTICD
18. Anderson JF, Main AJ. Importance of vertical and horizontal transmission of West Nile virus by Culex pipiens in the Northeastern United States. J Infect Dis. 18. 2006;194(11):1577-1579. doi: 10.1086/508754
19. Andreadis TG. The contribution of Culex pipiens complex mosquitoes to transmission and persistence of West Nile virus in North America. J Am 19. Mosq Control Assoc. 2012;28(suppl 4):137-151. doi: 10.2987/8756-971X-28.4s.137
20. Путинцева Е.В., Удовиченко С.К., Бородай Н.В. и
др. Особенности эпидемиологической ситуации по 20. лихорадке Западного Нила в Российской Федерации в 2020 г. и прогноз ее развития в 2021 г. // Проблемы особо опасных инфекций. 2021. № 1. С. 63-72. doi: 10.21055/0370-1069-2021-1-63-72
_ _öö-
ö
Оригинальная исследовательская статья
References ^
Viktorov DV, Smelyanskii VP, Lipnitskii AV, et al. [ West E2 Nile Virus.] Volgograd: Volga-Press Publ.; 2017. (In Russ.) ■—■ Nasci RS, Savage HM, White DJ, et al. West Nile = virus in overwintering Culex mosquitoes, New York City, 2000. Emerg Infect Dis. 2001;7(4):742-744. doi: 10.3201/eid0704.010426 =
Andreadis TG, Armstrong PM, Bajwa WI. Studies on hibernating populations of Culex pipiens from a West Nile virus endemic focus in New York City: parity rates and isolation of West Nile virus. J Am Mosq Control Assoc. 2010;26(3):257-264. doi: 10.2987/10-6004.1 Farajollahi A, Crans WJ, Bryant P, et al. Detection of West Nile viral RNA from an overwintering pool of Culex pipiens pipiens (Diptera: Culicidae) in New Jersey, 2003. J Med Entomol. 2005;42(3):490-494. doi: 10.1093/jmedent/42.3.490
Bugbee LM, Forte LR. The discovery of West Nile virus in overwintering Culex pipiens (Diptera: Culicidae) mosquitoes in Lehigh County, Pennsylvania. J Am Mosq Control Assoc. 2004;20(3):326-327. Nelms BM, Macedo PA, Kothera L, Savage HM, Reisen WK. Overwintering biology of Culex (Diptera: Culicidae) mosquitoes in the Sacramento Valley of California. J Med Entomol. 2013;50(4):773-790. doi: 10.1603/me12280 Rudolf I, Betäsova L, Blazejova H, et al. West Nile virus in overwintering mosquitoes, central Europe. Parasit Vectors. 2017;10(1):452. doi: 10.1186/s13071-017-2399-7 Gutsevich AV, Monchadskii AS, Stackelberg AA. [Culicidae Mosquitoes. Fauna of the USSR. Insecta Diptera.] Leningrad: Nauka Publ.; 1970;3(4). (In Russ.) Colpitts TM, ed. West Nile Virus: Methods and Protocols. New York, NY: Humana Press; 2016. doi: 10.1007/9781-4939-3670-0
Moser LA, Ramirez-Carvajal L, Puri V, et al. A universal next-generation sequencing protocol to generate noninfectious barcoded cDNA libraries from high-containment RNA viruses. mSystems. 2016;1(3):e00039-15. doi: 10.1128/mSystems.00039-15
Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. journal. 2011;17(1):10-12. doi: 10.14806/ej.17.1.200 Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25(16):2078-2079. doi: 10.1093/bioinformatics/btp352 Bankevich A, Nurk S, Antipov D, et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J Comput Biol. 2012;19(5):455-477. doi: 10.1089/cmb.2012.0021
Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013;30(4):772-780. doi: 10.1093/molbev/mst010
Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 2018;35(6):1547-1549. doi: 10.1093/molbev/msy096 Letunic I, Bork P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v4: recent updates and new developments. Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W256-W259. doi: 10.1093/nar/gkz239 Fedorova MV, Borodai NV. On the necessity and ways to improve entomological monitoring in the epidemiological surveillance for West Nile fever. Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni. 2017;(2):37-42. (In Russ.) Anderson JF, Main AJ. Importance of vertical and horizontal transmission of West Nile virus by Culex pipiens in the Northeastern United States. J Infect Dis. 2006;194(11):1577-1579. doi: 10.1086/508754 Andreadis TG. The contribution of Culex pipiens complex mosquitoes to transmission and persistence of West Nile virus in North America. J Am Mosq Control Assoc. 2012;28(suppl 4):137-151. doi: 10.2987/8756-971X-28.4s.137 Putintseva EV, Udovichenko SK, Boroday NV, et al. Peculiarities of epidemiological situation on the West Nile fever in the Russian Federation in 2020 and forecast for its development in 2021. Problemy Osobo Opasnykh Infektsiy. 2021;(1):63-72. (In Russ.) doi: 10.21055/0370-1069-2021-1-63-72
ТОМ 30 №4 2022
