ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОТИВОЭПИЛЕПТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЛАМОТРИДЖИН В КРОВИ КРЫС МЕТОДОМ ТСХ И ВЭЖХ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

НОЯБРЬ

- Д Е К А Б Р Ь 20 1 О

Рейтинговое голосование читателей

проводится на сайтах ФГУЗ РПОХБВ Роспотребнадзора www. rpohv.ru и журнала toxreview.ru.

Лекарственная токсикология

Конкурс «Лучшая работа молодого ученого»

Соболева Л.В.

Пятигорская государственная фармацевтическая академия, г. Пятигорск

УДК 543.544.5.068.7:615.47

Обнаружение противоэпилептического препарата ламотриджин в крови крыс методом ТСХ и ВЭЖХ

Статья представляет исследование по разработке методик изолирования ла-мотриджина из крови лабораторных животных и последующее его обнаружение с помощью методов тонкослойной хроматографии и высоко эффективной жидкостной хроматографии. Разработанные методы реко-

мендуются для включения в схему химико-токсикологического анализа ламотриджина.

Ключевые слова: ламотриджин, химико-токсикологический анализ, кровь, высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматография в тонком слое сорбента, лабораторные животные (крысы).

Введение. В последние 10-15 лет в повседневную клиническую практику введен целый ряд новых противоэпилептических препаратов. Одним из первых в мире и в России в 90-х годах прошлого столетия зарегистрирован ламотриджин. Однако наряду с положительным терапевтическим эффектом ламотриджин при определённых условиях может оказывать токсическое действие на организм человека, в том числе со смертельным исходом.

На сегодняшний день можно с уверенностью сказать, что по применению данного препарата накоплен огромный опыт в клинической практике [1]. Вместе с тем, не был проведен систематический анализ ламотрид-жина в биологических объектах с целью его идентификации и количественного определения при острых и смертельных отравлениях.

Таким образом, целью исследования явилась разработка методик изолирования ламо-триджина из крови лабораторных животных и последующее его обнаружение с помощью методов хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования выполнялись

в соответствии с правилами европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте для научных целей.

Для разработки оптимальной методики изолирования ламотриджина из крови животных предварительно определяли степень его экстракции на модельной биопробе в условиях экспертных исследований. Для этого готовили модельные смеси крови объемом 5 мл с содержанием ламотриджина в пробе 0,7, 4,0, 7,5 мг, что соответствует его максимальной терапевтической (700мг), токсической (4000мг) и смертельной (6000мг) дозам, оставляли на сутки при комнатной температуре (180С). Из литературных источников известно, что ламотриджин на 55% связывается с белками плазмы крови [3], поэтому для его извлечения из биологических объектов необходимо проводить предварительный гидролиз для разрушения комплекса связи белок-лекарственное вещество. Поэтому к модельной пробе крови (в шести повторно-стях) добавляли 30% раствор натрия гидрок-сида до рН 9. Полученную смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут с воздушным холодильником. После прове-

Токсикологический вестник (105)

Таблица 1

Результаты количественного определения ламотриджина в крови (п=6)

Добавлено ламотриджина, мг/ 5 мл крови Метрологические характеристики

0,7 X = 75,38; Бх = 1,73; А X = 4,44; е = 5,89%

4,0 X = 75,9; Бх = 1,68; А X = 4,32; е = 5,7%

7,5 X = 76,44; Бх = 1,63; А X = 4,19; е = 5,48%

денного щелочного гидролиза смесь охлаждали до комнатной температуры и экстрагировали трехкратно хлороформом (по 20 мл) в течение 5 минут. Полученные органические извлечения объединяли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 10 мл спирта этилового.

Степень экстракции ламотриджина в извлечениях из крови определяли с помощью метода ВЭЖХ. Исследования проводились на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ детектором производства ЗАО «ЭкоНова» (Россия). Исследование осуществляли на хроматогра-фической колонке размером 2х75 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом РгопШБП 120-5-С18 АО. В качестве элюен-та применяли 0,1% раствор кислоты триф-торуксусной (А), ацетонитрил (Б) в градиентном режиме от 0 элюента Б до 100% за 25 минут. Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин, аналитическая длина волны - 270 нм (соответствует максимуму поглощения), время измерения - 0,18 секунд, объем пробы 2 мкл температура термостата колонки 35°С. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Результаты и обсуждение. Исходя из данных таблицы, степень экстракции ламотрид-жина из крови составила около 76% с относительной погрешностью анализа не более 5,9%.

Разработанная методика была апробирована на биологической пробе (крови) лабораторных животных. Для этого группу крыс(18) делили на три подгруппы. Первой подгруппе вводилась перорально максимальная терапевтическая, второй токсическая, третьей смертельная доза ламотриджина, в пересчете на массу животного. Также с тремя крысами проводился контрольный опыт (без введения препарата). Через 2,5 часа (время максимальной концентрации в плазме) крысам делался общий наркоз, затем собирали кровь. Далее исследования проводились по

вышеописанной методике изолирования. Полученное после растворения сухого остатка в 10 мл спирта этилового извлечение делили на две аликвоты.

Первую исследовали методом ТСХ. В качестве хроматографических пластин были использованы пластины с закреплённым слоем силикагеля отечественного производства - "Сорбфил" ПТСХ-11 -А-УФ, производимые ЗАО "Сорбполимер", г. Краснодар. На линию старта хроматографической пластины наносили микрошприцем извлечение из крови. Хроматографирование проводили в частных системах растворителей: 1 - толуол-ацетон-этанол -25%-ный раствор аммиака (22,5:22,5:4:1); 2 - хлороформ-н-бутанол-25%-ный раствор аммиака (14:8:5); 3 - диоксан-бензол-25%-ный раствор аммиака (30:17,5:2,5). Детектирование исследуемого лекарственного вещества осуществляли путём просмотра пластин в УФ свете (254 нм) и с помощью 0,01% раствора дифенилкарбо-зона в хлороформе в сочетании с 5% раствором сульфата ртути (II). Значение И! в извлечении из крови лабораторных животных соответствовало значению стандартного образца ламотриджина (в системе 1 значение И! - 0,35; во 2-ой - 0,71; в 3-ей - 0,56) [2]. Можно сделать вывод об обнаружении ламотрид-жина в крови крыс.

Вторую аликвоту исследовали с помощью метода ВЭЖХ. После хроматографирования в вышеуказанных условиях извлечений из крови крыс получен пик со временем удерживания 11,97±0,02 мин, что соответствует времени удерживания его стандартного образца. Эндогенные соединения крови не мешают обнаружению ламотриджина.

Таким образом, разработана методика изолирования ламотриджина из биологической жидкости (крови) лабораторных животных и методики его идентификации с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ. Данные методики могут быть включены в схему химико-токсикологического анализа ламотриджина.

НОЯБРЬ

- Д ЕКАБР Ь 2 О 1 О

Выводы.

Определена степень экстракции ламо-триджина на модельной пробе крови, которая составила около 76%.

Проведена идентификация ламотриджи-на в извлечениях из крови с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ, которые позволяют надежно диагностировать отравления.

Разработанные методики могут быть включены в схему химико-токсикологического анализа ламотриджина.

Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Власов, П.Н. Опыт клинического применения ламотриджина, топирамата и леветирацетама у взрослых за рубежом и в России / П.Н. Власов // Фарматека. - 2004. -№19.- С.52-56.

2. Соболева, Л.В. Идентификация ламотриджина, фенитои-на и фенобарбитала методом тонкослойной хроматографии /Л.В.Соболева // Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. памяти проф. Ю.М. Кубицкого 31 октября - 01 ноября 2007. - М.: РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2007. - С. 274-279.

3. Справочник Видаль: Лекарственные препараты в России. - М.: АстраФармСервис, 2005.-1488 с.

Soboleva L.V.

Revealing of an antiepileptic preparation Lamotrigine in the rat blood using methods of fine- layer chromatography and high-effective liquid chromatography

State Pharmaceutical Academy of Pyatigorsk

The article presents a study on the development of methods for isolating Lamotrigine in the blood of laboratory animals and its follow-up disclosure using methods of fine- layer chromatography and high-effective liquid chromatography. The developed methods are recommended for inclusion into the scheme of chemo-toxicological analysis of Lamotrigine.

Переработанный материал поступил в редакцию 05.04.2010 г.

СЪЕЗДЫ, КОНФЕРЕНЦИИ, СОВЕЩАНИЯ

Азиатско-Тихоокеанская ассоциация медицинской токсикологии (АПАМТ)

VIII Конгресс (г. Пекин, Китай, 20-22 октября 2009 г.); IX Конгресс (г. Ханой, Вьетнам, 17-19 ноября 2010 г.)

Азиатско-Тихоокеанская ассоциация медицинской токсикологии (АПАМТ) каждый год проводит крупнейшие азиатские конференции по вопросам клинической токсикологии. Очередная, 8-ая встреча состоялась 20-22 октября 2009 года в г. Пекин (Китай). В работе конгресса приняли участие более 200 токсикологов медицинских учреждений Азии, Австралии, а также гости из Северной Америки и Западной Европы. Научная программа конгресса включала пленарные лекции, секционные доклады и стендовую сессию, всего более 200 сообщений.

Основные направления конференции затрагивали последние достижения клинической практики в токсикологии и методики оценки загрязнения окружающей среды (Tim Hlaing O.M. et al.). Специальные сессии были посвящены вопросам ликвидации медицинских последствий массовых химических поражений. Акцентировалось внимание на роли взаимодействия национальных токсикологических обществ при чрезвычайных ситуациях в до-

кладе Fei-Lung (Китай). На необходимость дальнейшего поиска маркеров оценки повышение роли эффективности лечения поражений фосфорорганическими соединениями указал в своем докладе Buckly N. (Австралия). Особенности оказания помощи при фито- и зоотоксикозах отражены в докладе Prashanth K.et al. (Индия).

Тематика ряда докладов была обращена к определению современных форм работы токсикологических центров. Так, в докладе Temple W.A. (Новая Зеландия) перспективы развития деятельности токсикологических центров связываются с развитием информационных технологий и дальнейшей гармонизации информации об острых отравлениях.

Наряду с традиционными аспектами, представлены вопросы, использования информационной поддержки принятия решения при оказании экстренной медицинской помощи (Liang Chen). Кроме того, в рамках конгресса была организована выставка новинок медицинской, учебной и научной литературы.