CC BY
18
УДК 504.3.054
Ключевые слова: креатинфосфат, неорганический фосфат, аутотрансплантат, костная ткань
Key words: phosphocreatine, inorganic phosphate, autotransplant, bone tissue
Нагиев Э. Р., Дадашев М. Н., Чудинов А. Н., Нагиева С. Э., Исмаилова Ф. Э., Сейфаддинова М. С.
ОБМЕН МАКРОЭРГИЧЕСКИХ ФОСФАТОВ ПРИ КРИТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА
METABOLISM OF HIGH-ENERGY PHOSPHATES UNDER CRITICAL CONDITIONS OF ORGANISM
'Дагестанская государственная медицинская академия. Адрес: 367012, г. Махачкала, пл. Ленина, 1
1Dagestan State Medical Academy. Address: 367012, Makhachkala, Lenin street, 1 2ФГУП «Биотехнический завод». Адрес: Московская область, пгт Успенский
2FSUI Biotechnical Plant. Address: Moscow region, Uspensky
Нагиев Эйзудин Рамазанович д.м.н., проф., академик РАЕН, Заслуж. работник ВШ РФ, зав. каф. биохимии1
Nagiev Eizudin R., Doctor of Medicine, Professor, Member of the Academy of Natural Sciences, Honorary Figure of Russian Higher Education, Head of Biochemistry Dept.1 Дадашев Мирали Нуралиевич, д.т.н., проф., нач. научно-исслед. лаборатории2 Dadashev Mirali N., Doctor of Engineering, Professor, Head of Scientific-Research Laboratory2 Чудинов Александр Николаевич, к.б.н., доцент каф. биохимии1 Chudinov Alexander N., Ph.D. in Biology Science, Associate Professor of Biochemistry Dept.1 Нагиева Саида Эйзудиновна, ст. лаборант каф. стоматологии1 Nagieva Saida E., Senior Labaratory Assistant of Stomatology Dept.1 Исмаилова Фариза Эдуардовна, аспирант каф. биохимии1 Ismailova Fariza E., Postgraduate of Biochemistry Dept.1 Сейфаддинова Мария Сейфаддиновна, к.б.н., ассистент каф. биохимии1 Seyfaddinova Maria S., Ph.D. in Biology Science, Assistant of Biochemistry Dept.1
Аннотация. В трансплантатах костей при замещении дефектов нижней челюсти исследовано содержание ма-кроэргических фосфатов - аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) и креатинфосфата (КФ), характеризующих биоэнергетику и жизнеспособность трансплантатов. Параллельно проведенные рентгенологические и морфологические исследования подтверждают важность энергоснабжения костей при критических ситуациях для их минерализации и приживления при пересадках. Установлено, что в костной ткани функцию хранения и универсального поставщика энергии выполняет не столько АТФ, сколько креатинфосфат. Разработан комплекс показателей, который может служить обоснованным критерием для использования трансплантатов из губчатой костной ткани при дефектах костей на практике.
Summary. The content of adenosine-5/-triphosphate (ATP) and creatine phosphate possessing a high-energy which characterize bioenergetics and viability of transplantants is researched in ones of bones under correction of defects of lower jaw. Conducted morphological and X-ray researches prove the importance ofproviding bones with the energy under critical conditions for the mineralization and engraftment in transplantations. It has been determined that the creatine phosphate accumulates and provides bone tissues with energy more than ATP. The complex of indexes which can be the criterion for using cancelous bone tissues transplantants in defects of bones has been developed in practice.
Введение
Энергия, освобождающаяся на промежуточных этапах окисления органических веществ, аккумулируется в макроэргических связях молекул аденозинтрифосфорной кислоты и некоторых других соединений и при посредстве адениловой системы переключается на нужды пластического и функционального обменов. Превращение энергии передачи электронов в химическую энергию
АТФ - это основной путь использования энергии, освобождающейся в дыхательной цепи [1, 2].
Макроэргические фосфорные соединения, такие как АТФ и креатинфосфат, играют огромную роль и в жизнедеятельности костной ткани. Так, минерализация кости может наблюдаться только в присутствии АТФ, который непосредственно включается в процесс минерализации, фиксируя лабильный
фосфор посредством реакции трансфосфо-рилирования на полярные группы белковой матрицы [3, 4].
Функция креатинфосфата отличается специфическими особенностями. Он выполняет роль вторичного запаса энергии в клетке, являясь донором макроэргического фосфата для АТФ в креатинкиназной реакции. Креатинфосфат представляет собой фосфоа-мидное производное креатина с макроэрги-ческой связью; молекулярный вес его ниже АТФ, а следовательно, в меньшем объеме и количестве вещества заложено больше энергии [5, 6].
Трансплантация органов и тканей наиболее актуальна в современной медицине. Интерес к этой проблеме еще более возрастает в связи со сложившимися в новейшей истории событиями на Северном Кавказе, и в частности в Республике Дагестан. Любая травма нижней челюсти может сопровождаться функциональными нарушениями и эстетическим дефектом, а дефекты нижней челюсти различной этиологии приводят не только к деформации и обезображиванию лица, но и к значительным нарушениям жевательной функции, что требует вмешательств с использованием костной пластики.
В связи с изложенным целью настоящей работы было изучение биохимических, рентгенологических и морфологических особенностей перестройки трансплантатов компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти и разработка практических рекомендаций по применению наиболее рациональных методов костной пластики.
Материалы и методы
Исследования проведены на 74 половозрелых беспородных собаках в возрасте 5-6 лет, массой 10-15 кг. В искусственно созданный дефект в области тела нижней челюсти пересаживался аутотрансплантат из компактной или губчатой костной ткани. В качестве трансплантата компактной кости использовали кортикальную пластинку тела нижней челюсти, взятую во время создания искусственного дефекта, а в качестве губчатого трансплантата - гребень подвздошной кости.
Экспериментальные животные были разделены на 3 группы. 1 группа - контроль (10 интактных животных); 2 группа - ау-тотрансплантация губчатой костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти (32 животных); 3 группа -аутотрансплантация компактной костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти (32 животных). Исследования проводились с соблюдением норм гуманного обращения с животными и выбором адекватного метода анестезии [7, 8]. В области тела нижней челюсти, параллельно нижнечелюстному краю, отступя от него на 0,5 см книзу, проводили разрез кожи длиной 6-7 см. При помощи бормашины и долота на наружной части тела нижней челюсти создавали дефект кости до половины ее толщины размером: высотой 1 см и длиной 4 см, в который помещали различный костнопластический материал. В послеоперационном периоде всем животным в течение 5-7 дней вводили антибиотики внутримышечно. Для изучения биохимических показателей участок челюсти, содержащий трансплантат, после забоя животного тотчас погружался в сосуд с жидким азотом. Фиксация ткани в жидком азоте полностью останавливает ферментативные процессы и позволяет исследовать биологические субстраты весьма близко к прижизненному состоянию. Содержание АТФ определяли методом ионообменной хроматографии [9], креатинфосфат и неорганический фосфат определяли по нарастанию фосфора и выражали в мкмоль на 1 г ткани [10].
Для морфологических исследований часть фрагмента нижней челюсти, содержащей трансплантат, фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, декальциниро-вали трилоном Б и заливали в целлоидин, готовили срезы толщиной 10-15 мкм, которые подвергали гистологическим исследованиям. Рентгенографию производили на отечественном дентальном аппарате «Уран-70» с фокусным расстоянием от объектива 30 см при экспозиции 1-1,5 сек. Применяли рентгеновскую пленку марки РМ-1 с чувствительностью 3,0. Проявляли и фиксировали рентгеновские снимки по общепринятой
методике. Контролем во всех исследованиях служила здоровая костная ткань, взятая из тех же участков кости, что и трансплантат.
Статистическую обработку результатов исследования проводили по ^критерию Стьюдента [11] с использованием компьютерной программы «Statistika У.5.5А».
Результаты и обсуждение
Биохимические исследования касались биоэнергетики и процессов минерализации в условиях трансплантации костей.
Содержание АТФ определяли методом ионообменной хроматографии как в интактной костной ткани, так и в различные сроки после ее пересадки в образованный дефект тела нижней челюсти. Однако ни в одном из этих случаев нам не удалось обнаружить с достаточной степенью достоверности ни АТФ, ни ее аналогов. Кроме того, для уточнения этого факта были проведены дополнительные контрольные исследования. В гомогенат костной ткани добавляли стандартные препараты АТФ, АДФ и АМФ фирмы «Реанал» из расчета 2-3 мг на 100 г ткани и затем проводили биохимические исследования. Во всех случаях использованными методами в костных гомогенатах были обнаружены АТФ и другие адениннуклеотиды в соответствующих стандартам количествах.
В связи с этим мы пришли к выводу, что в костной ткани, в отличие от других тканей организма, функцию хранения и универсального поставщика энергии выполняет
не столько АТФ, сколько креатинфосфат. Тем более, как это вытекает из полученных нами данных и данных литературы, содержание креатинфосфата в костной ткани (и компактной, и губчатой) существенно превышает его содержание в других органах и тканях [12, 13, 14].
Как показали проведенные исследования (см. табл.), в процессе перестройки трансплантатов содержание креатинфосфата претерпевает существенные изменения. Достоверное снижение количества креатинфосфата до 61 % от контроля в губчатой костной ткани происходит через 30 суток после трансплантации. В последующие сроки исследования количество креатинфосфата повышается по сравнению с предыдущим сроком, а спустя 60 суток полностью нормализуется и практически не отличается от показателей контрольной группы животных.
Изменения содержания креатинфосфата в трансплантате компактной кости имеют аналогичную тенденцию, однако более выражены по сравнению с трансплантатами из губчатой костной ткани. Так, спустя 30 суток после трансплантации содержание КФ значительно снижается и составляет около 54 % от контроля. В дальнейшем снижение количества КФ прекращается и через 45 суток после трансплантации повышается до 70 % от контроля. Через 60 суток содержание креа-тинфосфата продолжает повышаться, однако остается низкой по отношению к контролю.
Таблица.
Содержание креатинфосфата (КФ) и неорганического фосфата (НФ) в аутотрансплантатах костной ткани (мкмоль/г; М±m; п = 10; *р < 0,05)
Условия опыта КФ НФ
Губчатая кость Контроль 31,08±1,30 2626±55,79
30 сут. 18,93±0,57* 1991±34,54*
45 сут. 27,95±0,85 2442±48,71*
60 сут. 30,73±0,66 2607±45,06
Компакт. кость Контроль 23,83±0,85 3192±51,93
30 сут. 12,01±0,66* 21659±46,13*
45 сут. 19,02±0,70* 2575±58,34*
60 сут. 22,71±0,71 2909±50,00
Примечание: М - средняя арифметическая опытов; т - ошибка средней арифметической; п - число опытов; р - достоверность.
Следует отметить, что наблюдающееся снижение содержания креатинфосфата в трансплантатах костей в начальный период после операции пересадки свидетельствует о нарушении биоэнергетики трансплантатов и их жизнеспособности. Причем в период нарушения энергообеспечения трансплантатов имеет место и сопряженное угнетение процессов минерализации костей, о чем мы судили по содержанию в них неорганического фосфата.
Как следует из представленных в таблице данных, содержание неорганического фосфата в трансплантате из губчатой кости через 30 суток после пересадки снижается до 76 % от контроля. В дальнейшем, спустя 45 и особенно 60 суток после трансплантации, с нормализацией биоэнергетики костной ткани повышается и количество неорганического фосфата в трансплантатах костей, свидетельствуя об усилении процессов минерализации и повышении жизнеспособности трансплантатов.
Изменения содержания неорганического фосфата в трансплантатах из компактной кости в динамике хотя и однотипные, как в губчатой костной ткани, но более резко выражены. Кроме того, к завершению экспериментов (через 60 суток) количество неорганического фосфата в трансплантатах из компактной костной ткани, в отличие губчатой, остается заметно низкой по отношению к контрольным показателям.
Таким образом, проведенные биохимические исследования свидетельствуют о существенном снижении энергетических ресурсов в трансплантатах костей, нарушении их минерализации и, следовательно, снижении их жизнеспособности, особенно в начальный период после операции пересадки. К завершению экспериментов (через 60 суток) в трансплантатах из губчатой кости, в отличие от компактной, происходит нормализация и биоэнергетики, и процессов минерализации костной ткани.
В связи с этим, на наш взгляд, было важно выяснить, как биохимические изменения коррелируют с рентгенологическими и морфологическими изменениями трансплантатов костной ткани, что весьма важно для практики.
Рентгенологические исследования показали, что при аутотрансплантации губчатой костной ткани первичное приживление трансплантата наступает через 7 суток после операции и выражается в появлении облако-видной тени на стыке трансплантата и костного ложа реципиента. В дальнейшие сроки наблюдения, в частности спустя 30 суток после трансплантации, определяется более совершенная структура перестройки трансплантата и образование костной ткани в области пересадки (рис. 1).
Рис. 1. Рентгенограмма нижней челюсти собаки через 30 суток после аутотрансплантации губчатой костной ткани.
Что касается трансплантатов из компактной костной ткани, то первые признаки начала перестройки трансплантата и образования первичной мозоли определяются к концу второй недели. Спустя 30 суток после операции пересадки (рис. 2) перестройка трансплантата усиливается, однако в области пересадки наблюдаются явления остеопороза. Отчетливо выявляется резорбция трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью. Линия просветления, разделяющая трансплантат и костное ложе, в верхних
Рис. 2. Рентгенограмма нижней челюсти собаки через 30 суток после аутотрансплантации компактной костной ткани.
отделах не прослеживается. В боковых отделах трансплантата определяется образование костной мозоли.
Через 45 суток после операции пересадки рентгенологически определяются отчетливые процессы резорбции трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью. Контуры трансплантата и послеоперационного дефекта определяются с трудом, выявляется образование костной мозоли.
Спустя 60 суток после трансплантации губчатой костной ткани (рис. 3) рентгенологически определяется полное замещение трансплантата совершенной костной структурой.
Рис. 3. Рентгенограмма нижней челюсти собаки через 60 суток после аутотрансплантации губчатой костной ткани.
Что касается трансплантата из компактной костной ткани (рис. 4), то спустя 60 суток после операции пересадки границы между трансплантатом и ложем реципиента различаются с трудом. В области пересадки отмечается плотность костной ткани, характерная для компактного строения. Имеет место полная перестройка трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью. Однако в области трансплан-
Рис. 4. Рентгенограмма нижней челюсти собаки через 60 суток после аутотрансплантации компактной костной ткани.
тации отмечается небольшая перестройка кости по типу остеопороза, что указывает на незавершенность процесса замещения ауто-трансплантата компактной костной ткани к указанному сроку наблюдений.
Таким образом, рентгенологические исследования показали, что быстрее и совершеннее перестройка и замещение трансплантата происходит при аутопластике губчатой костной ткани. При трансплантации компактной кости сроки перестройки и замещения вновь образованной костной тканью увеличены по сравнению с другими сериями опытов.
Что касается морфологической картины, то во всех сериях опытов можно выявить как ряд общих изменений, так и некоторые отличия, связанные с видом трансплантата и его структурой. Так, при аутопластике губчатой костной ткани начало репаративных процессов определяется спустя трое суток после операции и характеризуется умеренной пролиферацией клеток остеобластов на фоне слабой лимфоидной инфильтрации. В дальнейшем процессы регенерации активируются, и через 30 суток после операции пересадки (рис. 5) происходит образование незрелой костной мозоли. В трансплантате просматриваются остеоциты, наблюдается усиленная пролиферация остеобластов, в костном ложе реципиента отмечаются следы значительной перестройки костной ткани.
В компактной кости начальные признаки репаративной регенерации проявляются поз-
Рис. 5. Морфологические изменения нижней челюсти собаки через 30 суток после аутотрансплантации губчатой костной ткани.
же по сравнению с губчатой костной тканью и определяются спустя 7 суток после трансплантации. В дальнейшем, спустя 30 суток после операции пересадки (рис. 6), происходит сращение трансплантата с костным ложем посредством образования костной мозоли и активное замещение трансплантата вновь образованной костью. Причем на границе замещения вновь образованной костью отмечается участок сохранившегося трансплантата.
Рис. 6. Морфологические изменения нижней челюсти собаки через 30 суток после аутотрансплантации компактной костной ткани.
Спустя 45 суток после операции пересадки трансплантата происходит его сращение с костным ложем реципиента посредством обильно васкуляризованной вновь образованной костной ткани примитивного строения. Новообразованная кость плотно спаяна с поверхностью трансплантата. Линия соединения неровная с наличием впадин и изгибов. В трансплантате клетки костной ткани остеоциты сохранены.
Через 60 суток после пересадки (рис. 7) границы трансплантата из губчатой костной ткани определить невозможно вследствие замещения ткани трансплантата вновь образованной костью.
Что касается трансплантации компактной кости, то через 60 суток (рис. 8) происходит замещение трансплантата вновь образованной костной тканью с некоторыми признаками ее незрелости в виде наличия широких костномозговых пространств, заполненных кровеносными сосудами. Среди вновь образованной костной ткани отмечается участок сохранившейся кости трансплантата, свиде-
тельствующий о том, что через 60 суток после пересадки замещение трансплантата из компактной кости вновь образованной костной тканью не завершается, в отличие от губчатой кости.
Рис. 7. Морфологические изменения нижней челюсти собаки через 60 суток после аутотрансплантации губчатой костной ткани.
Рис. 8. Морфологические изменения нижней челюсти собаки через 60 суток после аутотрансплантации компактной костной ткани.
Заключение
Проведенные морфологические исследования показали, что конечным результатом пересадок различных по виду и характеру трансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти является резорбция и замещение пересаженной костной ткани. Однако при пересадках компактной кости срок первичного приживления увеличен, а перестройка и замещение вновь образованной костью завершается значительно позднее по сравнению с аналогичными пересадками из губчатой костной ткани.
Весь комплекс полученных данных свидетельствует о полной корреляции биохими-
ческих, рентгенологических и морфологических показателей и о явных преимуществах трансплантатов губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти. В случаях же использования трансплантации компактной кости приживление и перестройка трансплантатов протекает значительно хуже, с низкими показателями жизнеспособности.
Все вышеизложенное диктует необходимость дифференцированного подхода при подборе костнопластического материала при различных критических состояниях организма на практике, и в частности дефектах челюстей различной этиологии.
Список литературы
1. Алейникова, Т. Л. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / Т. Л. Алейникова, Г. В. Рубцова - М. : Высшая школа, 2002. - 238 с.
2. Исмаилова, Ф. Э. Исследование содержания адениловых нуклеотидов в тканях животных при ал-лотрансплантации и воздействии вредных экологических факторов / Ф. Э. Исмаилова, С. Э. Нагиева // Вестник Российского государственного медицинского университета. - М., 2010. - С. 48-49.
3. Касавина, Б. С. Жизнь костной ткани / Б. С. Ка-савина, В. П. Торбенко. М. : Наука, 2004. - 217 с.
4. Кокунин, В. А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов / В. А. Кокунин // Укр. биохим. журн. - 1975. - Т. 47. - № 6. - с. 776-790.
5. Нагиев, Э. Р. Биохимия тканей полости рта : учебник для студентов медицинских вузов России / Э. Р. Нагиев, С. Э. Нагиева. - М., 2005. - ИПЦ ДГМА, Махачкала, 2007. - 148 с.
6. Нагиев, Э. Р. Пиримидиновый нуклеотидный фонд при действии облучения и физической нагрузки и пути его коррекции. / Э. Р. Нагиев // Мед. радиология и радиационная безопасность. - 1996. - Т. 3. -№ 1. - С. 39-41.
7. Нагиев, Э. Р. Способ замещения дефектов нижней челюсти / Э. Р. Нагиев, А. Н.
Чудинов // Каталог Российских разработок. - Российско-Китайский Технопарк Дружба. - КНР, Шень-чжень, 2008. - С. 77-81.
8. Северин, С. Е. Биохимия / С. Е. Северин. - М. : ГЕОТАР-МЕД, 2003. - 784 с.
9. Скулачев, В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии / В. П. Скулачев. - М. : Высшая школа, 1999. - 271 с.
10. Торбенко, В. П. Функциональная биохимия костной ткани / В. П. Торбенко, Б. С. Касавина. - М. : Медицина, 2002. - 137 с.
11. Чудинов, А. Н. Особенности углеводно-энергетического обмена костных аутотрансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти в эксперименте : автореф. дис. ... канд. биол. Наук / А. Н. Чудинов. -Махачкала, 2006. - 22 с.
12. Han, B. F. ATP - sensitive potassium channels and endoginius adenosine are involved in spinae antinociception produced by locus coeruleus stimulation / Bao Fen. Han, Ce Zhang, Jin-Shun Qi //Acts phisiol. sin. -2002. - V. 54. - № 2. - P. 139-144.
13. Kerr, S. E. Studies on phosphorus compounds of brain phosphocreatine / S. E. Kerr // J. Biol. Chem. -1985, 153. - P. 625-635.
14. Laver, D. R. Regulation of the calcium release channel rabbit skeletal muscle by nucleotides ATP, AMP, IMP and adenosine / Drek R. Laver, K. E. Lenz Gerlinde, D. Lamb Graham // J. Phisiol. - 2001. - V. 537. - № 3. -P. 763-778.
