CC BY
65
УДК 616.716.4-089.843-092.9 Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
С. Э. НАГИЕВА’, И. М. БЫКОВ3, Э. Р. НАГИЕВ2, А. Н. ЧУДИНОВ’, Н. И. БЫКОВА4, Е Е БРЕЩЕНКО
БИОХИМИЧЕСКИЕ, РЕНТГЕНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ЗАМЕЩЕНИИ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
кафедра стоматологии детского возраста и 2кафедра медицинской и клинической биохимии Дагестанской государственной медицинской академии,
Россия, 367012, г. Махачкала, пл. Ленина, 1;
3кафедра фундаментальной и клинической биохимии и 4кафедра детской стоматологии и ЧЛХ Кубанского государственного медицинского университета,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4
Проведены исследования содержания креатинфосфата и неорганического фосфата - важнейших биохимических показателей, характеризующих биоэнергетику и процессы минерализации костей в аллотрансплантатах компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти в эксперименте. Впервые в процессе репаративной регенерации костной ткани параллельно с биохимическими проведены рентгенологические и морфологические исследования аллотрансплантатов.
На основании полученных результатов разработан комплекс биохимических, рентгенологических и морфологических показателей, который может служить научно обоснованным критерием для преимущественного использования аллотрансплантатов из губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти на практике.
Ключевые слова: аллотрансплантация, костная ткань, дефекты нижней челюсти, креатинфосфат, неорганический фосфат.
S. E. NAGIEVA1, I. M. BYKOV3, E. R. NAGIEV2, A. N. CHUDINOV1, N. I. BYKOVA4, E. E. BRESCHENKO3
THE BIOCHEMICAL, ROENTGENOLOGICAL AND MORPHOLOGICAL CHANGES OF THE BONE TISSUE ALLOTRANSPLANTS AT THE SUBSTITUTION OF MANDIBULAR DEFECTS IN THE EXPERIMENT
1The chair of pediatric dentistry and 2the chair of medical and clinical biochemistry of Dagestan state medical academy,
Russia, 367012, Makhachkala, pl. Lenina, 1;
3the chair of fundamental and 4clinical biochemistry and the chair of pediatric dentistry and maxillofacial surgery of Kuban state medical university,
Russia, 350063, Krasnodar, Sedina str., 4
There was performed the study of the creatine phosphate and the non-organic phosphate-the crucial biochemical factors, which characterize the bioenergetics and the processes of the bone mineralization of the compact and squamous bone tissue allotransplants in mandible defects substitution in the experiment. For the first time along with the biochemical tests there were performed the roentgenological and morphological exams of the allotransplants during the process of bone tissue reparative regeneration.
On the basis of the produced results there was created the complex of the biochemical, roentgenological and morphological factors, which may serve as a scientifically based criterion for the preferential use of the squamous bone tissue allotransplants in the practical substitution of the mandibular defects.
Key words: allotransplantation, bone tissue, mandibular defects, creatine phosphate, non-organic phosphate.
Введение
Проблема трансплантации органов и тканей является весьма актуальной в современной медицине, в частности, в восстановительной челюстно-лицевой хирургии. Метод костной пластики, получивший столь широкое распространение в медицине, был впервые предложен нашим великим соотечественником Н. И. Пироговым еще в 1852 году, а в 1854 году он в работе о лечении огнестрельных переломов указывал на хорошие пластические свойства мелких кусков кости. Несмотря на солидный исторический опыт, трансплантация органов и тканей остается интенсивно развивающейся областью современной медицины [2, 3, 11].
Следует отметить, что при использовании для пластики дефекта костей костно-пластического материала не в виде большого костного трансплантата, а в виде небольших костных кусков создаются более благоприятные условия для рассасывания костной ткани трансплантатов [7, 9, 13]. Поэтому мы избрали метод костной пластики с использованием «костной щебенки», что представляется логичным и целесообразным при замещении дефектов нижней челюсти.
Любая травма нижней челюсти может сопровождаться функциональными нарушениями и эстетическим дефектом, а дефекты нижней челюсти различной этиологии приводят не только к деформации и обе-
зображиванию лица, но и к значительным нарушениям жевательной функции, что требует вмешательств с использованием костной пластики [4, 9, 14].
Остается спорным вопрос оценки способности различных по виду костных трансплантатов в разные сроки после операции стимулировать репаративные процессы [8, 12].
Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы были изучение рентгенологических, морфологических и некоторых биохимических особенностей перестройки аллотрансплантатов компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти и разработка практических рекомендаций по применению наиболее рациональных методов костной пластики.
Материалы и методы
Исследования проведены на 74 половозрелых беспородных собаках-самцах в возрасте 5-6 лет средней массой 10-15 кг. В искусственно созданный дефект в области тела нижней челюсти пересаживался аллотрансплантат из компактной или губчатой костной ткани. В качестве трансплантата компактной кости использовали кортикальную пластинку тела нижней челюсти, взятую во время создания искусственного дефекта, а губчатой - гребень подвздошной кости.
Экспериментальные животные были разделены на 3 группы. 1-я группа - контрольная (10 интактных животных); 2-я группа - 32 животных с аллотрансплантацией губчатой костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти; 3-я группа - 32 животных с аллотрансплантацией компактной костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти.
За 20 минут до операции животным внутримышечно вводили 2,0 мл дроперидола и 2,0 мл аминазина [8]. Через 15-20 минут собака становилась вялой, сонливой, переставала реагировать на человека. Животное фиксировалось на операционном столе, внутрибрюшинно ему вводили 2,0 мл 5%-ного тиопентал-натрия. Через 3-5 минут собака засыпала. В области тела нижней челюсти справа или слева тщательно выстригали шерсть, операционное поле обрабатывали теплым раствором воды с мылом, насухо высушивали марлевыми салфетками и обрабатывали двукратно 5%-ным раствором йода. В области тела нижней челюсти параллельно нижнечелюстному краю, отступя от него на 0,5 см книзу, проводили разрез кожи длиной 6-7 см. Послойно рассекали мягкие ткани: кожу, подкожную клетчатку и надкостницу, последнюю отсепарировали гладилкой и обнажали тело нижней челюсти. Тупыми крючками расширяли операционное поле. При помощи бормашины и долота на наружной части тела нижней челюсти создавали дефект кости до половины ее толщины размером: высотой 1 см и длиной 4 см, в который помещали различный костно-пластический материал в виде костной «щебенки». Отсепарированные мягкие ткани укладывались на место, и рану ушивали послойно кетгутом, на кожу накладывали шелковые швы. Операционное поле в области гребня подвздошной кости подготавливали так же, как и при взятии кортикальной пластинки. По краю гребня подвздошной кости производили разрез кожи, подкожно-жировой клетчатки, фасции, надкостницы. Тупыми крючками расширяли операционное поле, надкостницу отслаивали распатором, при помощи бормашины и долота иссекали часть гребешка подвздошной кости размером 5-6 см. Иссеченную часть гребешка подвздошной кости при помощи костных кусачек измельчали до состояния
костной «щебенки» размером 0,2-0,3 см и использовали в качестве костно-пластического материала.
В послеоперационном периоде всем животным в течение 5-7 дней вводили антибиотики внутримышечно. В эти же сроки проводили клинические наблюдения. Животных забивали в различные сроки после операции: через 3, 7, 15, 30, 45 и 60 суток после операции пересадки путем быстрого введения внутривенно 2,0 мл тиопентал-натрия. После забоя быстро вычленяли нижнюю челюсть, проводили рентгенологические исследования. Рентгенографию производили на отечественном дентальном аппарате «Уран-70» с фокусным расстоянием объектива 30 см при экспозиции 1-1,5 сек. Применяли рентгеновскую пленку марки РМ-1 с чувствительностью 3,0. Проявляли и фиксировали рентгеновские снимки по общепринятой методике.
Для морфологических исследований часть фрагмента нижней челюсти, содержащей трансплантат, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, декальцинировали трилоном Б и заливали в целлоидин. Полученные срезы толщиной 10-15 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизон.
Для изучения биохимических показателей участок челюсти, содержащий трансплантат, после забоя животного тотчас погружался в сосуд с жидким азотом. Фиксация ткани в жидком азоте полностью останавливает ферментативные процессы и позволяет исследовать биологические субстраты весьма близко к прижизненному состоянию. Креатинфосфат определяли по нарастанию неорганического фосфора в кислой среде в присутствии молибденово-кислого аммония и выражали в мкмоль на 1 г ткани [1]. Неорганический фосфат определяли колориметрически в модификации В. П. Скулачева [10]. Контролем во всех исследованиях служила здоровая костная ткань, взятая из тех же участков кости, что и трансплантат.
Статистическую обработку результатов исследования проводили по ^критерию Стьюдента [6] с использованием компьютерной программы «^айвйка V.5.5A».
Результаты исследования и их обсуждение
Клинические исследования показали, что во всех сериях экспериментов у животных в первые 2-3 суток после пересадки в области операционного поля отмечалась небольшая отечность мягких тканей. При пальпации подчелюстные лимфатические узлы были увеличены. Общее состояние животных ухудшалось в первые четверо суток после операции. Они были вялыми, неохотно принимали пищу, а некоторые из подопытных животных теряли в весе в среднем до 10%. На 4-7-е сутки эти явления стихали и полностью исчезали. Швы снимали на 8-й день после операции. Клинически заживление послеоперационной раны во всех случаях происходило без осложнений, первичным натяжением. По всей видимости, это связано с тем, что трансплантат из костной ткани вызывает менее выраженную иммунологическую реакцию, чем трансплантат любой другой ткани из-за низкой анти-генности, так как около 70% кости - это неорганические вещества [5, 7, 12].
Рентгенологические исследования показали, что при аллотрансплантации губчатой костной ткани первичное приживление трансплантата наступает к концу второй недели и характеризуется начальными признаками резорбции и репарации. Спустя 30 суток после трансплантации определяются признаки репаративных
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
А
процессов: контуры образованного дефекта нижней челюсти становятся нечеткими и неровными, прозрачность её понижена, в трансплантате губчатой кости отмечается замещение трансплантата вновь образованной костью (рис. 1А).
Что касается компактной костной ткани, то процесс перестройки и замещения пересаженной кости был более затяжным.
Первые признаки перестройки определялись через 30 суток после трансплантации и характеризовались образованием первичной костной мозоли, слиянием и сглаживанием границ трансплантата и краев образованного дефекта костного ложа реципиента. Имеют место явления остеопороза (рис. 1Б).
Через 45 суток после операции пересадки рентгенологически определяются более выраженные репара-тивные процессы, проявляющиеся в том, что контуры трансплантата становятся округлыми, наблюдается образование костной мозоли. Отчетливо заметны процессы резорбции трансплантата и замещения его вновь образованной костной тканью, при этом контуры трансплантата и послеоперационного дефекта определяются с трудом.
В дальнейшем определяется более совершенная структура перестройки трансплантата. Так, через 60 суток после операции пересадки трансплантата из губчатой кости (рис. 2А) имеет место замещение трансплантата вновь образованной костной тканью.
А
Рентгенологически определяется полное замещение трансплантата совершенной костной структурой. Границы между трансплантатом и ложем реципиента практически неразличимы.
Что касается компактной кости, рентгенологически отмечается замещение трансплантата вновь образованной костной тканью, структура которой во многом сходна с костной тканью нижней челюсти реципиента. Границы трансплантата на рентгенограмме (рис. 2Б) определяются с трудом из-за костного сращения между трансплантатом и ложем реципиента. В области пересадки отмечается плотность костной ткани, характерная для компактного строения. Спустя 60 суток в отличие от губчатой костной ткани перестройка и замещение аллотрансплантатов из компактной кости продолжались, о чем свидетельствует сохраняющаяся плотность тени трансплантата и отчетливо выраженная картина остеопороза в области пересадки, указывающая на незавершенность процесса перестройки костной ткани к указанному сроку наблюдений.
Таким образом, рентгенологические исследования показали, что быстрее и совершеннее перестройка и замещение трансплантата происходят при пересадке губчатой кости.
При трансплантации компактной кости сроки перестройки и замещения вновь образованной костной тканью увеличены по сравнению с трансплантатами из губчатой костной ткани.
Как показали морфологические исследования, первоначальные признаки резорбции и репарации трансплантатов из губчатой кости наблюдаются на 7-е сутки после пересадки. Спустя две недели происходит образование незрелой костной мозоли, которая через 30 суток превращается в зрелую костную мозоль примитивного строения, обильно васкуляризованную кровеносными сосудами; обнаруживаются мелкие участки костной ткани трансплантата среди зрелой костной мозоли (рис. 3А). Новообразованная кость интимно спаяна с костью реципиента, линия соединения неровная, с наличием впадин и изгибов. В трансплантате рисунок
остеонов нечеткий, определяются единичные остеоци-ты. Гаверсовы каналы всюду широкие, содержат кровеносные сосуды. В трансплантате просматриваются остеоциты, наблюдается усиленная пролиферация остеобластов, которая осуществляется со стороны периоста. В костном ложе реципиента следы значительной перестройки костной ткани.
В отличие от этого начало репаративной регенерации и замещение трансплантата компактной кости наблюдаются позже и определяются образованием клеточно-волокнистой ткани на 7-14-е сутки после пересадки.
Начало образования незрелой костной мозоли между трансплантатом и костным ложем реципиента определяется спустя 14 суток после трансплантации. Через 30 суток (рис. 3Б) происходит приживление трансплантата к костному ложу реципиента посредством образования костной мозоли, построенной из незрелой кости широкопетлистого строения в участке соединения аллотрансплантата с материнским ложем. В этот период пересаженная костная ткань еще довольно хорошо сохранена, в ней определяется четкий рисунок остеонов.
Спустя 45 суток после трансплантации происходит плотное сращение трансплантата с костным ложем реципиента посредством обильно васкуляризованной вновь образованной костной ткани примитивного строения, которая интимно спаяна с поверхностью трансплантата. Линия соединения неровная, с наличием впадин и изгибов. В трансплантате рисунок остеонов сохранен, но он нечеткий, остеоциты сохранены. Видны широкие гаверсовы каналы, заполненные кровеносными сосудами. Вокруг гаверсовых каналов прослеживается четкий рисунок с наличием остеоцитов. Со стороны периоста происходит усиленная пролиферация клеточно-волокнистой ткани, врастающей в трансплантат.
Через 60 суток после операции пересадки происходит замещение трансплантатов вновь образованной костной тканью. Рисунок остеонов нечеткий, остеоци-ты отсутствуют. В случае трансплантации губчатой
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
кости происходит плотное сращение трансплантата с костным ложем реципиента с помощью зрелой костной мозоли широкопетлистого строения (рис. 4А). Границы трансплантата из губчатой костной ткани определяются с трудом вследствие замещения ткани трансплантата вновь образованной костью. В костной ткани ложа реципиента наблюдается множество базофильно окрашенных линий склеивания, являющихся следствием перестройки костных структур.
При трансплантации компактной кости спустя 60 суток после пересадки продолжается активная перестройка трансплантата (рис. 4Б). Происходит плотное спаяние трансплантата с материнским ложем посредством образования зрелой костной мозоли. Границы трансплантата компактной костной ткани определяются с трудом вследствие замещения ткани трансплантата вновь образованной костью с некоторыми признаками её незрелости (наличие широких костно-мозговых пространств, заполненных
кровеносными сосудами). Все это свидетельствует о том, что полного замещения аллотрансплантата компактной костной ткани к этому сроку наблюдений все еще не происходит.
Таким образом, морфологические исследования показали, что во всех сериях экспериментов конечным результатом пересадок различных по виду и характеру трансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти являются резорбция и замещение пересаженной костной ткани. Однако при пересадках аллогенной компактной кости сроки первичного приживления увеличены, а перестройка и замещение вновь образованной костью завершаются значительно позднее по сравнению с аналогичными пересадками губчатой костной ткани. Так, к завершению экспериментов спустя 60 суток после операции пересадки процесс замещения аллотрансплантата из компактной костной ткани (в отличие от губчатой кости) еще полностью не завершается.
Рис. 4. Морфологические изменения в аллотрансплантате губчатой костной ткани (А) и компактной костной ткани (Б) через 60 суток после пересадки
Содержание креатинфосфата (КФ) и неорганического фосфата (НФ) в аллотрансплантатах костной ткани (М±т; мкмоль/г ткани)
Условия опыта КФ НФ
Губчатая кость Контроль 31,08±0,79 2626±55,79
7 сут. 20,21±0,47* 1995±34,12*
15 сут. 15,23± 0,38* 1496±23,31*
30 сут. 17,83±0,51* 1959±34,07*
45 сут. 23,53±0,57* 2163±45,57*
60 сут. 30,15±0,66 2468±48,65
Компактная кость Контроль 23,83±0,85 3192±51,93
7 сут. 12,86±0,55* 2298±46,13*
15 сут. 10,01±0,37* 1691±23,17*
30 сут. 12,05± 0,42* 1992±28,54*
45 сут. 14,64±0,53* 2049±37,10*
60 сут. 18,10±0,67* 2234±45,67*
116
Примечание: * - р<0,05.
Биохимические исследования касались анализа биоэнергетики и процессов минерализации аллотрансплантатов в условиях репаративной регенерации. Существенная роль в биоэнергетике костной ткани принадлежит макроэргическому соединению креатинфосфату, выполняющему роль вторичного запаса энергии в клетке, являясь донатором макро-эргического фосфата для АТФ в креатинкиназной реакции. В случае интенсивного энергообразования равновесие реакции сдвигается в сторону образования креатинфосфата, и таким образом в клетке накапливается запас биологической энергии. По мере того как клетка расходует энергию АТФ на различные процессы, равновесие реакции сдвигается в обратную сторону, и креатинфосфат служит донатором фосфатов для поддержания АТФ при помощи креа-тинкиназной реакции [10, 15].
Как показали проведенные исследования, содержание креатинфосфата в трансплантате из губчатой костной ткани снижается и через 7 суток составляет около 65% от контроля (таблица). Максимальное снижение содержания креатинфосфата до 49% и 40% от контроля происходит через 15 и 30 суток после трансплантации. К 45-м суткам содержание креатин-фосфата повышается по сравнению с предыдущим сроком исследования, а к 60-м суткам приближается к показателям контроля.
Что касается компактной кости, то спустя 7 суток количество креатинфосфата достоверно падает до 54%, а через 15-30 суток после трансплантации составляет примерно 42-51% от контроля соответственно. В дальнейшем, спустя 45 и особенно 60 суток после трансплантации, количество креатинфосфата повышается и приближается к контрольным значениям. Однако содержание креатинфосфата в трансплантате из компактной кости в отличие от губчатой к завершению экспериментов остается заметно низким по сравнению с показателями контроля.
В период снижения энергообеспечения трансплантатов наблюдается и сопряженное угнетение процессов минерализации костной ткани, о чем мы судили по содержанию в них неорганического фосфата.
Как следует из представленных данных (таблица), содержание неорганического фосфата в трансплантате из губчатой кости в первые две недели после трансплантации достоверно падает по сравнению с контролем, составляя 76% (7 суток) и 57% (15 суток). Через 30 суток намечается тенденция повышения содержания неорганического фосфата по сравнению с предыдущим сроком исследования. В дальнейшем, спустя 45 и особенно 60 суток после трансплантации, с нормализацией содержания креатинфосфата повышается и накопление в трансплантатах неорганического фосфата, свидетельствуя об усилении процессов минерализации аллотрансплантата и повышении его жизнеспособности.
Изменения содержания неорганического фосфата в трансплантате из компактной кости хотя и однотипные, как в случае губчатой кости, но более резко выражены. Кроме того, к завершению экспериментов (через 60 суток) количество неорганического фосфата в трансплантате из компактной кости в отличие от губчатой остается существенно низким по отношению к показателям контрольной группы животных.
Таким образом, весь комплекс полученных данных свидетельствует о явных рентгенологических,
морфологических и биохимических преимуществах трансплантатов из губчатой костной ткани по сравнению с другим видом костной пластики при замещении дефектов нижней челюсти. В случаях же использования трансплантации компактной кости приживление и перестройка трансплантатов протекают значительно хуже, с низкими показателями жизнеспособности, что необходимо иметь в виду при выборе характера и вида трансплантата в условиях практической медицины.
Все это диктует необходимость дифференцированного подхода при подборе пластического материала костной ткани при лечении больных в клинике.
Таким образом в результате проведенных исследований установлено, что процессы перестройки и замещения пересаженной костной ткани губчатого и компактного строения начинаются однотипно, но завершаются они быстрее и совершеннее при аллотрансплантации губчатой костной ткани.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. - М.: Высшая школа, 2002. - 238 с.
2. Аржанцев П. З., Горбуленко В. Б., Козлов С. В, Труханов Е. Ф. Этапы развития стоматологии и челюстно-лицевой хирургии в Главном военном госпитале // Военно-медицинский журнал. -2007. - Т. 327. № 5. - С. 82-86.
3. Белоус А. М., Панков Е. Я. Некоторые итоги исследований по репаративной регенерации кости // Механизмы регенерации костной ткани. - М.: Медицина, 2002. - С. 284-294.
4. Загубелюк Н. К. Отдаленные результаты остеопластики послеоперационных полостей челюсти // Вопросы аллотрансплантации в стоматологии. - М., 1989. - С. 50-56.
5. Касавина Б. С., Торбенко В. П. Жизнь костной ткани. - М.: Наука, 2004. - 217 с.
6. Кокунин В. А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Украинский биохимический журнал. - 1975. - Т. 47. № 6. - С. 776-790.
7. Лаврищева Г. И. Морфологические особенности приживления аллокости // Биоматериалы. - 2006. - № 5. - С. 36-40.
8. Нагиев Э. Р., Чудинов А. Н. Способ замещения дефектов нижней челюсти // Каталог российских разработок. - Российско-китайский технопарк «Дружба». КНР, Шеньчжень, 2008. -С.77-81.
9. Плотников Н. А. Костная пластика нижней челюсти. - М.: Медицина, 2003. - 136 с.
10. Скулачев В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. - М.: Высшая школа, 1999. - 271 с.
11. Сысолятин П. Г. Костная пластика дефектов нижней челюсти «кильскими» трансплантатами // Стоматология. - 1995. -№ 1. - С. 6-8.
12. Торбенко В. П., Касавина Б. С. Функциональная биохимия костной ткани. - М.: Медицина, 2002. - 137 с.
13. Bauss O., Fenske C., Schilke R., Schwestka-Polly R. Autotransplantation of immature third molare into edentulous and atrophied jam sections // Int. j. oral maxillofac surg. - 2007. - Vol. 33 (6). -P. 558-563.
14. Imasato S., Fukunishi K. Potentialefficacy of GTR and autogenous bone grafts for autotransplantation to recipient sites with osseous defects: evaluation by re-entry procedure // Dent traumatol. -2006. - Vol. 20 (1). - P. 42-47.
15. Kerr S. E. Studies on phosphorus compounds of brain phosphocreatine // J. biol. chem. - 1985. - Vol. 153. - Р. 625-635.
Поступила 23.01.2011
Кубанский научный медицинский вестник № 2 (125) 2011
