CC BY
105
микробиология
© коллектив авторов, 2013
УДК 616.8-002.6-078
Г. Ю. Куляш1, м. И. Сабаев1, Л. в. Ерко1, С. Г. марданлы2, Н. в. Бахилина2
об эффективности и перспективе применения теста исследовательской лаборатории венерических заболеваний (VDRL) для диагностики нейросифилиса в российской федерации
ТУз Саратовский областной кожно-венерологический диспансер; 2зАО «ЭКОлаб», Электрогорск, московская обл.
Проведена сравнительная оценка эффективности различных нетрепонемных тестов при анализе спинномозговой жидкости (СМЖ).
Ликвор от 100 больных сифилисом исследовали с помощью реакции связывания комплемента (РСК), теста Исследовательской лаборатории венерических заболеваний (VDRL) и реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП). РСК, а также VDRL-тесты зарубежного и отечественного производства одинаково эффективны при выявлении позитивных образцов ликвора и превосходят аналогичную способность РМП в 2,4раза при нейросифилисе с симптомами и в 3,5 раза при асимптомном нейросифилисе.
VDRL-тест является простой стандартизированной нетрепонемной реакцией, которая может заменить трудоемкий неунифицированный ликворологический комплекс на основе РСК при лабораторной диагностике нейросифилиса. Тестирование ликвора на основе РМП неэффективно и обусловливает получение ложноотрицательных результатов в РСК- и VDRL-позитивных пробах, что определяет высокий риск ошибочных клинических заключений.
Ключевые слова: нейросифилис, VDRL, РСК, РМП
G.Yu. Kulyash, M.I. Sabayev, L.V. Yerko, S.G. Mardanly, N.V. Bakhilina ABOUT EFFECTIVENESS AND PERSPECTIVE OF APPLICATION OF TEST OF VENEREAL DISEASE RESEARCH LABORATORY (VDRL) FOR DIAGNOSTIC OF NEUROSYPHILIS IN THE RUSSIAN
FEDERATION
The comparative evaluation of effectiveness of different nontreponema tests in analysis of cerebrospinal fluid. The liquor from 100 patients with syphilis was analyzed using Bordet-Gengou test, VDRL test and micro-precipitation reaction with cardiolipin antigen. The Bordet-Gengou test and VDRL test made in Russia or abroad are equally effective in analysis of positive samples of liquor and twice surpass the same capacity of micro-precipitation reaction with cardiolipin antigen in case of neurosyphilis with symptoms and thrice surpass in case of asymptomatic neurosyphilis.
VDRL test is a simple standardized nontreponema reaction which can substitute labor-consuming non-unified liquorologic complex in laboratory diagnostic of neurosyphilis. The testing of liquor on the basis of micro-precipitation reaction with cardiolipin antigen is non-effective and results in false negative results in Bordet-Gengou and VDRL positive tests determining high risk of erroneous clinical considerations.
Key words: neurosyphilis, VDRL, Bordet-Gengou test, micro-precipitation reaction with cardiolipin antigen
Сифилис по-прежнему является одной из наиболее актуальных социально значимых инфекций с высоким уровнем заболеваемости во всех регионах России и преобладанием скрытых вариантов течения [1]. В связи с этим успешность борьбы с ним определяется наличием эффективных и доступных методов лабораторной диагностики. Серологические реакции, регламентированные приказом Минздрава РФ № 87 от 26.03.2001 г. [2], включают группу нетрепонемных и трепонемных тестов, позволяющих надежно выявлять как ранние, так и поздние формы сифилиса, в том числе и скрытого. Однако лабораторная диагностика нейросифилиса в настоящее время характеризуется рядом проблем, про-
Для корреспонденции:
Марданлы Сейфаддин Гашимович, канд. мед. наук, президент ЗАО «ЭКОлаб»
Адрес: 142530, Московская обл., Электрогорск, ул. Буденного, 1 Телефон: 8-909-992-14-94 E-mail: [email protected]
являющихся наиболее остро при подозрении на асим-птомное инфицирование центральной нервной системы (ЦНС). Такие разрешенные для ликвородиагностики в России трепонемные реакции, как иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлюоресценции с цельным ликвором (РИФц), обладают высокой чувствительностью и специфичностью в отношении суммарных антител (AT) к Treponema pallidum. В то же время прямая клиническая интерпретация их позитивности в пользу нейросифилиса при анализе спинно-мозговой жидкости (СМЖ) неоправданна и более информативными признаются отрицательные результаты указанных тестов [3, 4]. Позитивность СМЖ в реакциях связывания комплемента с кардиолипиновым (РСКк) и трепонемным (PCK) антигенами (АГ) объективно свидетельствует о нейросифилисе [5]. Однако данная методология трудоемка, не унифицирована, не применяется за рубежом многие десятилетия и, кроме того, подлежит отмене в Российской Федерации с 2006 г. [2]. Вместо РСКк и РСКт в мировой практике для ликвородиагностики нейроси-филиса используется высокоспецифичный кардиолипи-
новый тест Исследовательской лаборатории венерических заболеваний [4, 6], известный как VDRL (Veneral Diseases Research Laboratories). Следует признать, что в российских дерматовенерологических учреждениях (ДВУ) VDRL фактически незнаком специалистам и до последнего времени не был представлен на рынке диагностических препаратов зарегистрированными отечественными тест-системами (ТС). Важно отметить также, что применение реакции микропреципитации с кардиолипиновым АГ (РМП) и ускоренного плазмареа-гинового теста RPR (rapid plasma regain test) не рекомендовано для ликвородиагностики сифилиса [7, 8]. Однако по данным периодической литературы 37% ДВУ России используют РМП для тестирования СМЖ при сифилисе [9], тогда как допустимость замены VDRL и РСК на РМП для диагностики нейросифилиса не подтверждена опубликованными отечественными исследованиями.
В связи с изложенным целью настоящей работы явилось сравнительное изучение диагностической эффективности РСК, VDRL и РМП при тестировании СМЖ у больных сифилисом и оценка возможности внедрения простых стандартизированных кардиолипиновых тестов в практику отечественного здравоохранения вместо трудоемкой неунифицированной РСК.
Материалы и методы. В период с 2010 по 2011 г. исследованы образцы СМЖ 100 больных сифилисом в возрасте от 20 до 78 лет, проходивших диагностическое обследование и лечение в ГУЗ Саратовский областной кожно-венерологический диспансер. Основанием для проведения люмбальной пункции являлось наличие у пациентов неврологических симптомов, в случае их отсутствия необходимость исключения асимптомно-го поражения ЦНС при вторичном, скрытом раннем и скрытом позднем сифилисе. Группа сравнения, представленная серонегативными лицами без подозрения на сифилис (здоровыми), отсутствовала, поскольку проведение люмбальных пункций без достаточных клинических оснований не представлялось возможным.
Анализ проб сыворотки крови и ликвора на наличие антикардиолипиновых AT выполняли на основе неуни-фицированных РМП и РСКс применением кардиолипи-нового АГ для РМП и для РСК производства ЗАО «ЭКО-лаб» (Электрогорск, Московская обл.). В качестве унифицированных ТС для выявления антикардиолипиновых AT в СМЖ использовали VDRL-тест для серодиагностики сифилиса (SPINREACT, Испания), а также «Сифилис-VDRL-тecт», выпускаемый в виде экспериментальных серий ЗАО «ЭКОлаб». Тестирование проб сывороток крови и СМЖ на наличие антитрепонемных AT на основе неунифицированной РСКт проводили с использованием трепонемного ультраозвученного АГ для РСК производства ФГУП «НПО «Микроген» (Ставрополь). Суммарные AT к T. pallidum в пробах сыворотки крови и СМЖ выявляли в ИФА с применением ТС «ИФА-антипаллидум-скрин» (ЗАО «ЭКОлаб»). Анализ проб сыворотки крови пациентов в унифицированной трепонемной реакции на основе гемагглютинации эритроцитов проводили с ТС «Сифилис-РПГА-тест» (ЗАО «ЭКОлаб»). Все перечисленные методы выполняли в соответствии с протоколами приказа Минздрава РФ № 87 [2], а также требованиями инструкций по применению ТС. При этом для РСК использовали цельный ликвор и его разведения 1:2 и 1:5, а для ИФА - ликвор в разведении 1:2 и 4-кратное увеличение концентрации конъюгата.
Белок и цитоз СМЖ, подлежащие обязательному исследованию при диагностике нейросифилиса в соответствии с приказом Минздрава РФ № 291 от 30.07.2001
[10], определяли с применением наборов «Клиника-СМЖ» и «Белок-ПГК» производства ЗАО «ЭКОлаб».
Результаты и обсуждение. Анализ историй болезни 100 пациентов с сифилисом, прошедших плановое специфическое серологическое и ликворологическое обследование, позволил дифференцировать данную группу лиц на больных сифилисом с поражением и без поражения нервной системы (см. таблицу). Все пациенты, включенные в данное исследование, характеризовались серопозитивностью в трепонемных тестах. С клиническим диагнозом нейросифилис с симптомами было 14 пациентов, с асимптомным нейросифилисом - 35, что в целом отражает вероятность выявления манифестных и неманифестных форм сифилитической нейроинфекции в настоящее время [11, 12]. Диагностика асимптомного нейросифилиса является наиболее сложной из-за отсутствия надежных объективных клинических и лабораторных критериев этой формы заболевания [13]. Доступным и достоверным диагностическим критерием нейросифилиса, в том числе и асимптомного, признается РСК/ УОКЬ-позитивность СМЖ [5, 6]. В связи с этим группа пациентов с асимптомным нейросифилисом сформирована только из РСК-СМЖ-позитивных лиц. Другие больные с тем же диагнозом, установленным на основании клинической интерпретации результатов менее объективных ликворологических показателей (ИФА, цитоз и белок), не включены в исследование.
Среди 51 больного сифилисом без клинических и лабораторных данных, свидетельствующих о наличии, было 3 пациента с вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек, 14 - с сифилисом скрытым ранним, 34 - с сифилисом скрытым поздним.
Полученные данные указывают на различную эффективность использованных иммунодиагностических методов анализа СМЖ при нейросифилисе. При ней-росифилисе с симптомами и при асимптомном положительные результаты у всех пациентов (100%) отмечены только в ИФА, т. е. ни один из пациентов с нейросифи-лисом не был ИФА-СМЖ-негативным. РСКт и РСК , также регламентированные приказами Минздрава РФ № 87 и 291 в качестве методов ликвородиагностики при сифилисе, характеризовались меньшим количеством положительных результатов. Так, при нейросифилисе с симптомами в обеих модификациях РСК позитивность СМЖ выявлялась у 85,7% пациентов. При асимптомном нейросифилисе РСКк была положительной с ликвором всех 35 обследованных (100%), тогда как РСКт позволила установить СМЖ-реактивность у 88,6% пациентов данной группы. Сравнительные исследования СМЖ больных нейросифилисом с помощью кардиолипиновых тестов, не предусмотренных приказами Минздрава РФ № 87 и 291 в качестве ликвородиагностических, представлены УБКЬ производства SРINREAСT (УБИ^ . УБКЬ производства ЗАО «ЭКОлаб» (УDRLЭк ) иРМП на основе кардиолипинового антигена (ЗАО «ЭКОлаб»). В инструкциях по применению обеих ТС для выполнения VDRL указывается на возможность тестирования и сыворотки крови, и ликвора. В то же время РМП предназначена только для анализа сыворотки или плазмы крови. У больных нейросифилисом с симптомами и асимптомным обе VDRL-TС позволяли выявлять позитивность ликвора в каждой из этих групп с одинаковой эффективностью - 85,7% при нейросифилисе с симптомами и 100% при асимптомном нейросифилисе. Аналогичные результаты при обеих формах нейросифилиса получены в случае использования РСКк (реакции Вассер-мана). Эффективность РСКТ при асимптомном нейроси-
филисе была меньше, чем в случае применения реакции Вассермана, а также обеих ТС для УБИТ, и составляла 88,6%. Самую низкую способность к установлению позитивности СМЖ при нейросифилисе продемонстрировала РМП. Так, в случае нейросифилиса с симптомами позитивность РМП отмечалась у 35,7% больных, а при асимптомном нейросифилисе доля СМЖ-позитивных пациентов составляла лишь 28,6%.
Эти данные подтверждаются также результатами сравнения эффективности использования при диагностике нейросифилиса УОКЬ- и ИРЯ-теста, являющегося модификацией РМП [18].
Анализ иммунодиагностических ликворологических реакций у больных сифилисом без поражения ЦНС показал, что ни в одном из применявшихся вариантов РСК, УОКЬ, а также в РМП ни у одного из обследованных реактивность СМЖ не установлена (100% отрицательных результатов). Одновременно у данных пациентов положительные ответы получены только в случае использования ИФА, относящегося к группе высокочувствительных трепонемоспецифических тестов. При этом доля позитивных результатов ИФА при различных формах сифилиса различалась и была наибольшей при вторичном сифилисе (100%). У больных ранним скрытым сифилисом СМЖ-ИФА-позитивность составляла 64,3%, у больных поздним скрытым сифилисом - 64,7%. СМЖ-ИФА-позитивные пациенты с вторичным и скрытым сифилисом не имели объективных критериев, позволяющих установить нейросифилис, поскольку у них отсутствовала неврологическая симптоматика, ликвор каждого из них в регламентированных иммунодиагно-стических реакциях (РСКк и РСКт) был отрицательным, а количественные значения таких стандартных неспецифических СМЖ-маркеров, как белок и цитоз, не свидетельствовали о наличии патологии ЦНС.
Представленные результаты демонстрируют различную эффективность использованных иммунодиагности-ческих методов исследования СМЖ при сифилисе, что целесообразно учитывать в практической работе ДВУ и при проведении мероприятий по оптимизации существующих методов диагностики нейросифилиса в России.
Из применявшихся методов ИФА отличался наибольшей эффективностью в установлении позитивности
образцов СМЖ при всех формах сифилиса. Специфические IgG при сифилитической нейроинфекции синтезируются в ЦНС локально (интратекально), что имеет важное диагностическое значение [13]. Однако не исключается выявление в СМЖ трепонемоспецифических IgG и при сифилисе без нейроинфекции [13, 14]. Это связано с высокой чувствительностью ТС-ИФА в отношении IgG, которые доминируют во фракции суммарных AT к T. pallidum практически на всех стадиях сифилиса и способны проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из кровотока. Изложенное согласуется с полученными результатами. Как следует из табл. 1, максимальные показатели положительных ответов (100%) ИФА-СМЖ отмечены в обеих группах пациентов с нейро-сифилисом. Значимость ИФА-СМЖ-позитивности как объективного критерия нейросифилиса при асимптомном его течении существенно ниже, чем при нейросифилисе с симптомами [15]. Доля ИФА-СМЖ-позитивных больных сифилисом без поражения ЦНС была максимальной (100%) в группе пациентов с вторичным периодом заболевания. Группа больных с ранним и поздним скрытым сифилисом характеризовалась менее высоким уровнем ИФА-СМЖ-позитивности (63,4 и 64,7% соответственно). Установленные расхождения относительных показателей ИФА-СМЖ-позитивности могли быть связаны с различиями выраженности специфического гуморального иммунного ответа на различных стадиях сифилиса. Уровень антикардиолипиновых и антитрепо-немных AT в сыворотке крови больных сифилисом наиболее высок во вторичном его периоде и снижается при поздних формах заболевания [7], что может определять разницу в эффективности диффузии специфических IgG крови через ГЭБ. Малая выборка (n = 3) пациентов с вторичным сифилисом не исключает получения отрицательных результатов ИФА-СМЖ в группах с большим числом обследуемых, в которых фактор индивидуальной вариабельности интенсивности иммунного ответа проявляется сильнее.
Положительные результаты ликвородиагностики на основе трепонемного ИФА могут определяться и при нейросифилисе, и при сифилисе без поражения нервной системы, что существенно ограничивает информативность ИФА-СМЖ-позитивности. В отличие от позитивности ИФА позитивность нетрепонемных РСК и VDRL
Результаты сравнительного исследования СмЖ в нетрепонемных и трепонемных тестах при различных формах сифилиса
Диагноз РСК РСКк VDRLs . t sprnreact ТОГЦколаб РМП ИФА
+ - + - + - + - + - + -
Сифилис с поражением нервной системы:
с симптомами, п = 14 12 (85,7) 2 (14,3) 12 (85,7) 2 (14,3) 12 (85,7) 2 (14,3) 12 (85,7) 2 (14,3) 5 (35,7) 9 (64,3) 14 (100) 0
нейросифилис, п = 35 31 (88,6) 4 (11,4) 35 (100) 0 (0) 35 (100) 0 (0) 35 (100) 0 (0) 10 (28,6) 25 (71,4) 35 (100) 0
Сифилис без поражения нервной системы:
вторичный, п = 3 0 (0) 3 (100) 0 (0) 3 (100) 0 (0) 3 (100) 0 (0) 3 (100) 0 (0) 3 (100) 3 (100) 0
скрытый ранний, п = 14 0 14 (100) 0 (0) 14 (100) 0 (0) 14 (100) 0 (0) 14 (100) 0 (0) 14 (100) 9 (64,3) 5 (35,7)
скрытый поздний, п = 34 0 34 (100) 0 (0) 34 (100) 0 (0) 34 (100) 0 (0) 34 (100) 0 (0) 34 (100) 22 (64,7) 12 (35,3)
Примечание. + и - положительный и отрицательный результат соответственно, в скобках - процент.
с ликвором прямо указывает на сифилитическую ней-роинфекцию [5, 6]. Это определяет особую значимость кардиолипиновых тестов в диагностике нейросифилиса, а также необходимость обоснованного выбора наиболее простых и надежных нетрепонемных реакций для использования в здравоохранении. VDRL является мировым стандартом рутинного анализа СМЖ на наличие реа-гиновых AT [4, 6], однако фактически не применяется в Российской Федерации, где основой ликвородиагности-ки сифилиса по-прежнему остается более трудоемкий и неунифицированный комплекс РСКк и РСКт (9]. При нейросифилисе с симптомами РСК и VDRL выявляли позитивность ликвора у 85,7% обследованных, что согласуется с данными о варьировании чувствительности теста VDRL в пределах 27,0-91,7% [6, 16, 17]. Группа больных асимптомным нейросифилисом сформирована только из РСК-СМЖ-позитивных пациентов, что снижало роль субъективных факторов на стадии вынесения данного клинического диагноза. В связи с этим представленная в таблице 100% СМЖ-позитивность РСКк и VDRL при асимптомном нейросифилисе не отражает их истинной чувствительности, установление которой не представлялось возможным из-за отсутствия доступных методов прямого подтверждения инфицирования ЦНС больных T. pallidum и не являлось целью данного исследования. Главным результатом проведенной работы стало получение информации о том, что чувствительность VDRL-TC как зарубежного, так и отечественного производства не уступает чувствительности РСКк, превышает диагностические возможности РСКт и тем более РМП. Способность последней к выявлению позитивных проб СМЖ в сравнении с РСКк и VDRL в 2,4 раза меньше при нейросифилисе с симптомами и в 3,5 раза ниже при асимптомном нейросифилисе.
Использование РСК, VDRL и РМП в группе больных сифилисом без поражения нервной системы не позволило выявить ни одного позитивного образца СМЖ. Это в совокупности с данными об отсутствии неврологической симптоматики, а также патологических значений цитоза и белка в ликворе обследованных подтверждает специфичность всех реакций на основе кардиолипи-нового АГ при диагностике нейросифилиса. Качество нетрепонемных СМЖ-тестов определяет высокий диагностический статус их позитивных ответов в отличие от позитивных результатов трепонемных реакций, в том числе и ИФА, способных к выявлению специфических AT в ликворе и при нейросифилисе, и при сифилисе без поражения ЦНС.
Исследование продемонстрировало равную диагностическую эффективность регламентированного в России ликворологического комплекса на основе РСК и широко применяемого в мировой практике теста Исследовательской лаборатории венерических заболеваний (VDRL). При этом отечественный набор для VDRL, разработанный в ЗАО «ЭКОлаб» (Россия), не уступал зарубежному VDRL-тесту (SPINREACT, Испания) по способности к выявлению реактивных образцов СМЖ при различных формах сифилиса и существенно превосходил диагностический потенциал РМП. Принимая во внимание неунифицированность этапов постановки и трудоемкость РСК, следует признать целесообразность замены данного метода на нетрудоемкий стандартизированный VDRL, производящийся в удобном формате ТС со всеми необходимыми реагентами, включая положительный и отрицательный контроли. Несмотря на сходство кардиолипи-
нового АГ, используемого для VDRL и РМП, применение последнего для диагностики нейросифилиса недопустимо ввиду высокой вероятности получения ложноотрицательных результатов в тех случаях, когда сифилитическое поражение ЦНС может быть подтверждено в тесте VDRL. В заключение следует отметить, что первая отечественная ТС для постановки VDRL, разработанная в ЗАО «ЭКОлаб» под торговым названием «Сифилис-VDRL-тест», находится на этапе утверждения и в ближайшее время станет доступной для практических специалистов ДВУ Российской Федерации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кубанова A. A., Лесная И. Н., Кубанов А. А. и др. Анализ эпидемиологической ситуации и динамика заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, и дерматозами на территории Российской Федерации. Вестник дерматологии и венерологии. 2010; 5: 4-21.
2. Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации № 87 от 26.03.2001 г. «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса». М.; 2001.
3. Соколовский Е. В., Савичева A. M., Смирнова Т. С. и др., ред. Лабораторная диагностика сифилиса: методические рекомендации. СПб.: Н-Л; 2009.
4. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines 2002. MMWR 2002; 51 (No. RR-6).
5. Кубанова А. А., ред. Клинические рекомендации. Дерматовенерология. М.: ДЭКС-ПРЕСС; 2007.
6. Марра К. Нейросифилис. ИППП. 2004; 4: 7-11.
7. Дмитриев Г. А., ГлазкоИ. И. Диагностика инфекций, передаваемых половым путем. М.: Бином; 2007.
8. Centers for Disease Control and Prevention. 1998 Guidelines for treatment of Sexually transmitted diseases. MMWR 1998; 47 (No. RR-1).
9. Катунин Г. Л., Фриго H. B., Ротанов С. В. и др. Анализ заболеваемости и качества лабораторной диагностики нейросифилиса в Российской Федерации. Вестник дерматологии и венерологии. 2011; 3: 18-26.
10. Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации № 291 от 30.07.2001 г. «О мерах по предупреждению распространения инфекций, передаваемых половым путем». М.; 2001.
11. КузнецоваН. П., Чащин А. Ю., ДолженицинаН. А., Афанасьева И. Г. Эпидемиологическая и клиническая характеристика нейро-сифилиса в Иркутской области. В кн.: Тезисы научных работ III Всероссийского конгресса дерматовенерологов. Казань, 27-30 октября 2009 г. Казань; 2009: 13.
12. Новиков Ю. А., Новиков А. И., Чермошенцев А. А. и др. Опыт диагностики нейросифилиса в Омской области за период 20072009 г. В кн.: Тезисы научных работ III Всероссийского конгресса дерматовенерологов. Казань, 27-30 октября 2009 г. Казань; 2009: 94-5.
13. Kotnik V., Jordan К., StopinsekS. et al. Intrathecal antitreponemal antibody synthesis determination using the Inno-Lia™ Syphilis Score. Acta Dermatovenerol. Alp Panonica Adriat. 2007; 16 (4): 135-41.
14. SmikleM. F., James O. B., PrabhakarP. Diagnosis of neurosyphilis: a critical assessment of current methods. South. Med. J. 1988; 81 (4): 452-4.
15. Куляш Г. Ю. Диагностика нейросифилиса: проблемы трактовки результатов лабораторных исследований. Клиническая дерматология и венерология. 2011; 4: 6-14.
16. Luger A. F., Schmidt B. L., Kaulich М. Significance of laboratory findings for the diagnosis of neurosyphilis. Int. J. STD AIDS. 2000; 11 (4): 224-34.
17. Davis L. E., Schmitt J. W. Clinical significance of cerebrospinal fluid tests for neurosyphilis. Ann. Neurol. 1989; 25 (1): 50-5.
18. Marra C. M. et al. The rapid plasma regain test cannot replace the venereal disease research laboratory test for neurosyphilis diagnosis. Sex Transm. Dis. 2012; 39 (6): 453-7.
Поступила 31.10.12
